Введение к работе
Лимфоидные неоплазии представляют собой большую группу разнообразных злокачественных заболеваний, в которую входит так называемая болезнь Ходжкина, неходжкинские лимфомы (NHL), различные формы лейкемии и множественная миелома. В последние годы получено большое количество данных, касающихся молекулярных механизмов, приводящих к возникновению лимфом. Было выяснено, что одним из важных факторов онкогенеза и, в частности, лимфомогенеза являются вирусы (Magrath, 1990; 1992). Вирусы, по-видимому, ответственны примерно за 15% всех злокачественных опухолей человека. За последние годы произошел большой прогресс в изучении механизмов вирусного онкогенеза и его особенностей. В частности, развитие злокачественных NHL довольно часто ассоциировано с инфицированием людей вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) (Bower, 2001; Carbone, 2002; Carbone et al, 2000; Frisch et al, 2001; Gaidano et al, 1996; Gaidano et al., 2000; Knowles, Pirog, 2001). NHL характерны для 3,5-12% ВИЧ-носителей (Frisch et al., 2001; Hiddemann, 1989). Количество случаев возникновения NHL значительно возросло с начала распротранения СПИДа (1984 год). Частота заболеваний NHL у ВИЧ-инфицированных пациентов в 200 раз выше, чем в целом в популяции людей (Spina etal., 1999).
Изучение молекулярных особенностей NHL показало как сходство, так и различие между ассоциированными и не ассоциированными с ВИЧ лимфомами. Было отмечено, что у ВИЧ-инфицированных пациентов в 15 раз чаще, чем у неинфицированных людей возникают лимфомы мозга и примерно в 3 раза чаще лимфомы с высокой степенью злокачественности (Cote et al., 1997). По регистрационным данным 1980-1990 гг. было подсчитано, что риск возникновения лимфом высокой степени злокачественности в 348 раз выше у пациентов со СПИДом, по сравнению с неинфицированными людьми, в то время как риск возникновения лимфом с низкой степенью злокачественности у ВИЧ-инфицированных пациентов только в 14 раз выше (Biggar et al., 1997). Высоко злокачественные диффузные В-крупноклеточные лимфомы (DLBCL) составляют примерно две трети системных NHL (Moses et al., 1998) и являются одними из наиболее часто встречающихся типов лимфом у больных СПИДом. В связи с этим изучение молекулярно-генетических
srzan
{ОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ) БИБЛИОТЕКА СПетерф 03
2 механизмов возникновения и развития данной группы лимфом, возникающих у человека на фоне ВИЧ-инфекции и спонтанно, приобретает на сегодняшний день особую актуальность.
В настоящее время не известны надежные генетические маркеры как для ассоциированных с ВИЧ, так и для спонтанных DLBCL. Несмотря на то, что недавние исследования, касающиеся DLBCL, являются большим шагом по выяснению происхождения, генетических и клинических характеристик данной гетерогенной группы заболеваний, надо отметить, что механизмы возникновения DLBCL в целом и каждого заболевания из этой группы лимфом все еще остаются неясными. Необходимо изучить молекулярные особенности каждой конкретной лимфомы этого типа и идентифицировать группы генов, ответственные за различный прогноз течения заболевания и различный ответ на лечение, доступное в наши дни, и, таким образом, приблизиться к конечной цели - разработке совершенных стратегий борьбы с возникновением и развитием рака.
В настоящее время уже ясно, что в злокачественную трансформацию клеток, как правило, вовлечены не единицы и не десятки, а сотни генов. Поэтому сейчас на повестке дня встали следующие вопросы: изменение экспрессии каких генов связано с опухолевой трансформацией клетки, какие из этих генов могут играть ключевую роль и влиять на остальные гены, и в какой степени эта роль универсальна или специфична. Один из возможных подходов к решению этой проблемы, который был использован в данной работе, - сравнительный анализ транскрипции генов в разных типах раковых клеток и на разных этапах их злокачественного перерождения.
Цель и задачи работы.
Целью настоящей работы являлось изучение молекулярных механизмов ВИЧ-ассоциированного лимфомогенеза. В качестве объекта исследования были выбраны две ВИЧ-ассоциированне близкородственные лимфомы человека, относящиеся к классу DLBCL, - центробластная и иммунобластная, а также спонтанные лимфомы человека.
В соответствии с этой целью была поставлены следующие задачи: 1. С помощью модифицированного метода двухэтапной вычитающей гибридизации, сопряженной с двухступенчатым дифференциальным скринингом, обнаружить
з гены, транскрипция которых повышена в двух ВИЧ-ассоциированных лимфомах (центробластной и иммунобластной) по сравнению с нормальными В-лимфоцитами, а также в каждой из двух лимфом по сравнению с другой.
Проанализировать уровни транскрипции отобранных генов в ВИЧ-ассоциированных и спонтанных лимфомах человека с целью выяснения влияния вируса на лимфомогенез.
Проанализировать уровни транскрипции отобранных генов в иммортализованных фибробластах человека, как модели раннего этапа злокачественного перерождения клетки.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Селектированы гены, дифференциально транскрибирующиеся в двух ВИЧ-
ассоциированных лимфомах (центробластной и иммунобластной) по сравнению с
нормальными В-лимфоцитами, а также в каждой из двух лимфом по сравнению с
другой.
Выявлены как гены, специфичные для ВИЧ-ассоциированных лимфом, так и гены, универсальные для лимфомогенеза разной природы.
Обнаружены гены, связанные со злокачественным перерождением клетки уже на ранних этапах онкогенеза.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В данной работе был разработан оригинальный метод двухэтапной вычитающей гибридизации с последующим двуступенчатым дифференциальным скринингом, сопряженный с ПЦР-амплификацией.
С помощью этого метода были обнаружены гены с известными функциями, активно экспрессирующиеся в двух ВИЧ-ассоциированных лимфомах (центробластной и иммунобластной) по сравнению с нормальными В-лимфоцитами, а также в каждой лимфоме по сравнению с другой.
Также были обнаружены новые гены с неизвестными функциями, дифференциально транскрибирующиеся в каждой лимфоме по сравнению с другой.
Впервые было показано, что изменение транскрипции генов а-туЪ, pub и кальпаина 4 специфично для ВИЧ-ассоциированных лимфом и не происходит в
спонтанных лимфомах человека. Кроме того, впервые было показано повышение транскрипции генов set, SMG-1, ND4 в лимфомогенезе человека, как в ВИЧ-ассоциированном, таки в спонтанном.
Установлено, что экспрессия генов ND1, ND4, СОХ2, set, a-myb, IL4R, SMG-1, pub, дифференциально транскрибирующихся в лимфомах, повышена по сравнению с нормой в одной или обеих проанализированных линиях иммортализованных фибробластов человека, что свидетельствует о возможном участии этих генов в злокачественной трансформации клеток на ранних этапах канцерогенеза.
Таким, образом, были идентифицированы гены, являющиеся возможными кандидатами на роль генетических маркеров для ВИЧ-ассоциированных DLBCL. Обнаружение таких маркеров может способствовать более точной и своевременной постановке диагноза, а также разработке современных методов лечения этих заболеваний.
Апробация работы.
Отдельные положения работы представлялись на 11-ой Международной Конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, октябрь 2003 г.) и на Ш-м съезде Всероссийского Биохимического общества (Санкт-Петербург, июнь 2002 г.). В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены на заседании Ученого совета Института молекулярной генетики РАН 25 июня 2004 г.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и тезисы 2 докладов в материалах российских и международных конференций.
Структура и объем диссертации.
