Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 6
2. Обзор литературы 10
2.1. Структура и свойства нормальной печени 10
2.2. Эпидемиология и патологические свойства гк 12
2.3. Стадии гепатоканцерогенеза 13
2.4. Патогенез гк 14
2.4.1. Хронический вирусный гепатит 16
2.4.2. Вирус гепатита В 17
2.4.3. Вирус гепатита С. 19
2.4.4. Химические канцерогены 22
2.4.5. Наследственные генетические нарушения 23
2.5. Свойства опухолевой клетки 24
2.5.1. Независимость от ростовых сигналов 26
2.5.2. Нечувствительность к сигналам, запрещающим рост 26
2.5.3. Уклонение от программы апоптоза. 27
2.5.4. Неограниченныйрепликативный потенциал 27
2.5.5. Способность к ангиогенезу. 28
2.5.6. Генетическая нестабильность. 28
2.5.7. Способность к инвазии и метастазированию. 29
2.5.8. Снижение уровня дифференцировки 30
2.6. Генетические механизмы гепатоканцерогенеза 30
2.6.1. Ранние изменения при гепатоканцерогенезе 31
2.6.2. Поздние события гепатоканцерогенеза 33
2.7. Гепатоцитариые ядерные факторы и их роль в регуляции генов печени 39
2.7.1. СемействоHNF1 41
2.7.2. Семейство С/ЕВР 45
2.7.3. СемействоHNF3 48
2.7.4. СемействоHNF4 51
2.7.5. СемействоHNF6 58
2.7.6. FTF. 60
2.7.7. Семейство GA ТА 61
2.7.8. Семейство COUP-TF 62
2.7.9. Основные этапы формирования печени 64
2.7.10. Спектры экспрессии ГЯФ в печени и других органах 67
2.7.11. Регуляционная иерархия ГЯФ. 69
2.7.12. ГЯФ в генетических заболеваниях человека 75
2.7.13. ГЯФ при вирусных инфекциях 75
2.7.14. ГЯФ при канцерогенезе 76
2.8. Регуляция экспрессии гена афп 77
2.8.1. Структура гена АФП и продукты его транскрипции 79
2.8.2. Синтез АФП в норме и при патологии 81
2.8.3. Механизмы регуляции экспрессии гена АФП 82
2.8.4. Регуляторные цис-элементы гена АФП 83
2.8.5. Транскрипционные факторы, участвующие в регуляции экспрессии гена АФП 85
2.8.6. Возможная модель регуляции гена АФП. 93
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Список использованных растворов и сред 96
3.2. Линии перевиваемых гепатокарцином 97
3.3. Клеточные линии 97
3.4. Трансформация клеток е. Coli 99
3.5. Выделение нуклеиновых кислот 99
3.6. Электрофорез нуклеиновых кислот
В неденатурирующих агарозных гелях 100
3.7. Метод "обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция" (от-пцр) 100
3.8. Нозерн-блот гибридизация 104
3.9. Определение активности теломеразы методом trap (telomerase repeat amplification protocol) 107
3.10. Авторадиография 108
3.11. Иммунохимическое выявление белков 108
3.12. Получение гистологических препаратов гк мышей 110
3.13. Гибридизация с кднк микрочипами 111
4. Результаты исследования 114
4.1. Изучение механизмов одноступенчатой прогрессии перевиваемых гк мышей 114
4.1.1. Сравнение биологических свойств бГКи мГК 114
4.1.2. Утрата эпителиальной морфологии при прогрессии ГК 117
4.1.3. Активация теломеразы при прогрессии ГК 120
4.1.4. Экспрессия гепато-специфических генов при прогрессии ГК. 122
4.1.5. Прогрессия ГК сопровождается подавлением экспрессии всехизоформ№Г4а
4.1.6. Гепатоцитарныеядерные факторы в прогрессии ГК 127
4.1.7. Восстановление экспрессии HNF4al в культуре клеток 6ГК ведет к восстановлению транскрипции некоторых гепато-специфических генов и установлению эпителиальной морфологии. 132
4.1.8. Регуляторныйрайон HNF4al в клетках 6ГКнеактивен. 137
4.2. Закономерности экспрессии гепато-специфических генов в гк мыши различного уровня дифференцировки 140
4.3. Изучение механизмов регуляции гена афп в клонах крысиной гепатомы 150
4.3.1. Различия в уровне синтеза АФП определяются на транскрипционном уровне. 150
4.3.2. Разработка нового метода трансфекции эукариотических клеток... 152
4.3.3. Анализ экспрессии репортерных генов под контролемрегуляторных элементов гена А ФП в А ФП+ и АФП- клонах. 153
4.3.4. Экспрессия гепато-специфических белков вАФП+ и АФП- клонах. 154
4.3.5. Сравнение спектров экспрессии транскрипционных факторов вАФП+ и АФП- клонах. 156
4.3.6. Получение соматических гибридов АФП+ и АФП- клонов 159
4.3.7. Синтеза АФП в полученных гибридах не наблюдается 161
4.3.8. Экспрессия генов семейства альбумина в соматических гибридах. 161
4.3.9. Закономерности экспрессии транскрипционных факторов в соматических гибридах. 163
4.3.10. Экзогенная экспрессия HNF4a и HNF1 вАФП- клонах крысиной гепатомы 164
4.4. Анализ спектров экспрессии генов в гк мышеи и крыс методом гибридизации с кднк микрочипами 169
4.4.1. Гены, дифференциально экспрессирующиеся при прогрессии ГК 173
4.4.2. HNF4o.l-pecnoHcueHbie гены.. 175
4.4.3. Возможные маркеры гепатоканцерогенеза 175
4.4.4. Гены, дифференциально экспрессирующиеся в ГК мышей разного уровня дифференцировки и клонах крысиной гепатомы, различающихся по синтезу А ФП 178
4.5. Экспрессия hnf4al в образцах гк человека подавлена 180
5. Обсуждение 184
5.1. Изменения ткане-специфической экспрессии генов при прогрессии гк 184
5.1.1. Одноступенчатая прогрессия перевиваемых ГК мыши 184
5.1.2. Экспрессия транскрипционных факторов, определяющих гепатоцитарный фенотип, при прогрессии ГК 185
5.1.3. Экспрессия HNF4a при гепатоканцерогенезе и прогрессии опухолей 186
5.1.4. HNF4al - важный регулятор дифференцировки гепатоцитов 187
5.1.5. Что стало причиной репрессии HNF4a? 192
5.2. Регуляция экспрессии гена афп 195
5.3. Изменения профилей экспрессии генов при прогрессии гк 200
Заключение 204
Выводы 206
- Эпидемиология и патологические свойства гк
- Свойства опухолевой клетки
- Закономерности экспрессии гепато-специфических генов в гк мыши различного уровня дифференцировки
- Регуляция экспрессии гена афп
Введение к работе
Гепатоцеллюлярная карцинома (ГК) - самая частая опухоль печени и одна из наиболее распространенных форм рака в мире. Основными факторами риска для развития ГК являются хронические инфекции вирусами гепатита В (HBV) или (HCV) и длительное воздействие химических гепатоканцерогенов, таких как афлатоксин Bl (Bosch, 1999). Анализ генетических нарушений и изменений в экспрессии генов позволил выявить ряд факторов, вовлеченных в процесс гепатоканцерогенеза. Он включает гены, кодирующие факторы роста (TGF-a, TGF-(3, HGF и их рецепторы), опухолевые супрессоры (Rb, р53), компоненты Wnt-сигнального пути, молекулы межклеточных контактов и адгезионные белки (Buendia, 2000).
Развитие опухолевого фенотипа представляет собой многостадийный процесс, обусловленный накоплением генетических нарушений. Следствием таких нарушений является приобретение опухолью все более злокачественного фенотипа. Этот процесс, получивший название опухолевой прогрессии, является важным свойством злокачественных новообразований различного происхождения, но всегда определяется свойствами исходной ткани, давшей начало опухоли.
Прогрессия ГК сопровождается снижением уровня дифференцировки, подавлением экспрессии ткане-специфических генов, увеличением скорости пролиферации клеток, утратой эпителиальной морфологии, приобретением инвазивности и способности к метастазированию. Прогрессия ГК связана с утратой опухолями дифференцированного фенотипа, в то же время, карциномы часто сохраняют способность к ре-дифференцировке (Абелев, 2003). В настоящее время описано множество сигнальных путей, важных для контроля функций печени и пролиферации, однако молекулярные основы прогрессии ГК остаются недостаточно изученными.
Определяющую роль в регуляции экспрессии большинства генов, специфичных для печени, играет соотношение в клетке уровней так называемых гепатоцитарных ядерных факторов (ГЯФ), к которым относят несколько семейств регуляторных белков: HNF1, С/ЕВР, HNF3, HNF4 и HNF6 (Tronche and Yaniv, 1992). Между уровнями экспрессии различных ГЯФ существуют тесные связи (Лазаревич, 2000; Locker, 2001), однако иерархические отношения между представителями различных семейств факторов пока исследованы недостаточно полно.
Ядерный рецептор HNF4ot играет ключевую роль в эмбриональном развитии печени и в поддержании дифференцированного гепатоцитарного фенотипа (Li et al., 2000; Hayhurst et al., 2001). Однако роль HNF4oc и других ткане-специфических регуляторов транскрипции в гепатоканцерогенезе в настоящее время практически не изучена.
Для решения этой проблемы мы использовали новую экспериментальную систему, в которой из медленнорастущей дифференцированной ПС мыши (мПС) одномоментно выщепился инвазивный высоко злокачественный вариант (6ГК). Мы рассчитывали, что сравнение вариантов мПС и 6ГК позволит идентифицировать генетические пути, определяющие основные свойства прогрессии ПС, и приступить к разработке подходов к реверсии злокачественного фенотипа ПС. Универсальность регуляторных механизмов, выявленных при изучении этой системы, была проверена на клонах крысиной гепатомы с разным уровнем экспрессии опухолевого маркера альфа-фетопротеина (АФП), в химически индуцированных ПС мышей независимого происхождения и в образцах ПС человека.
Цели и задачи исследования
Цель настоящей работы состояла в изучении молекулярных механизмов прогрессии ПС и проверки выдвинутой нами гипотезы о роли транскрипционных факторов, специфических для печени, в гепатоканцерогенезе.
В ходе работы решались следующие основные задачи:
1. Характеристика биологических свойств новой экспериментальной системы прогрессии ПС мышей in vivo.
2. Анализ профиля экспрессии гепато-специфических белков и транскрипционных факторов при прогрессии ПС.
3. Изучение эффектов ре-экспрессии HNF4ct в культуре клеток дедифференцированной ПС.
Проверка универсальности выявленных закономерностей на панели независимо индуцированных ПС мышей с разного уровня дифференцировки.
Определение спектров экспрессии и возможной роли ГЯФ в регуляции экспрессии гена опухолевого маркера АФП в клонах крысиной гепатомы и их соматических гибридах.
Поиск причин подавления транскрипции HNF4a при де-дифференцировке ПС.
Исследование уровней экспрессии HNF4a в образцах ПС человека.
8. Выявление потенциальных эффекторов и маркеров гепатоканцерогенеза и прогрессии опухолей печени методом гибридизации с кДНК микрочипами.
Научная новизна работы
Исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе опухолевой прогрессии ПС, были значительно осложнены отсутствием четких экспериментальных моделей гепатоканцерогенеза in vivo. Поэтому научная новизна исследования во многом определяется использованием уникальных моделей: коллекции химически индуцированных ПС мышей, системы ГК мышей общего происхождения, различающихся по скорости роста и уровню дифференцировки, и набором клонов крысиной гепатомы, отличающихся по уровню экспрессии АФП. Создание и характеристика экспериментальных систем близкого происхождения, различающихся по выраженности определенного ряда признаков, позволило провести сравнительный анализ экспрессии генов, определяющих прогрессию и де-дифференцировку опухолей печени.
В работе показано, что прогрессия ГК сопровождается координированным подавлением уровней мРНК гепато-специфических генов. Впервые проведен полный анализ уровней экспрессии транскрипционных факторов, определяющих дифференцировку печени, при возникновении и прогрессии ГК in vivo. Впервые установлено, что на ранних этапах канцерогенеза происходит активация транскрипции эмбриональной формы HNF4ot. В то же время, при прогрессии ГК выявлено изменение экспрессии целого блока ткане-специфических транскрипционных факторов. В работе впервые продемонстрирована ключевая роль HNF4al в поддержании дифференцированного статуса опухолей печени и показана возможность частичной реверсии злокачественного фенотипа при экзогенной экспрессии этого гена. В ходе этих исследований идентифицирован ряд новых транскрипционных мишеней HNF4al.
В то же время, показано, что причиной подавления экспрессии HNF4al стало изменение функции транскрипционных регуляторов этого гена, и выявлена последовательность, определяющая негативную регуляцию HNF4al в быстрорастущем варианте ГК.
Выявленные закономерности носят, по-видимому, общий характер, поскольку HNF4al и ряд регулируемых им генов имеют сходные паттерны экспрессии в различных модельных системах, а их репрессия четко коррелирует с дедифференцировкой клеток. Более того, нами впервые обнаружено подавление транскрипции HNF4al в образцах дедифференцированных ГК человека.
Экспрессия гена опухолевого маркера АФП в исследованных системах коррелирует с транскрипцией HNF4al и ряда других ГЯФ. Впервые показана способность HNF4al активировать экспрессию АФП. Методом соматической гибридизации установлено существование механизма негативной регуляции гена АФП, вероятно опосредованной репрессией HNF4al.
Впервые проведено исследование профилей экспрессии генов при прогрессии ГК методом гибридизации с кДНК микрочипами. Выявлены гены, потенциально определяющие ход опухолевой прогрессии, возможные маркеры гепатоканцерогенеза, новые HNF4al респонсивные гены и возможные эффекторы его экспрессии.
Практическая ценность работы
Изучение механизмов, определяющих прогрессию ПС, относится к фундаментальным исследованиям природы опухолевого роста и имеет прямое отношение к разработке методов терапии злокачественных опухолей.
Исследование содержит ряд новых экспериментальных подходов и теоретических концепций для изучения гепатоканцерогенеза. Результаты работы имеют прямое отношение к разработке методов диагностики и регрессии опухолей. Определение способов повышения уровня дифференцировки ПС может привести как к усилению чувствительности опухолей к терапии, так и к созданию новых методов их лечения. В ходе работы получены новые данные о механизмах регуляции онко-эмбрионального маркера АФП, широко используемого в клинической практике. Кроме того, в исследовании выявлены гены, потенциально являющиеся маркерами возникновения и прогрессии опухолей печени.
Модельные системы, охарактеризованные в настоящем исследовании, представляются многообещающей моделью для комплексного изучения механизмов, отвечающих за поддержание дифференцировочного статуса опухолей печени, и идентификации генов, определяющих прогрессию ПС.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Эпидемиология и патологические свойства гк
Гепатоцеллюлярная карцинома (ГК) - наиболее часто встречающаяся форма злокачественных опухолей печени, возникающая из основных клеток печени, гепатоцитов. Она является пятой по распространенности в мире. В 1999 году новые случаи ГК были зарегистрированы у 316 000 мужчин и 121 000 женщин, что составило примерно 7.4% (для мужчин) и 3.2% (для женщин) всех злокачественных новообразований (корме раков кожи) (Hamilton and Aaltonen 2000). Частота возникновения ГК варьирует географически и составляет менее 3.6 на 100 000 в Северной и Южной Америке, центральной и северной Азии, северной Европе, Австралии и Новой Зеландии и более чем 20.1 на 100 000 в Сахаре, Северной Африке Восточной Азии и Меланезии (Hamilton and Aaltonen 2000). За последние годы частота встречаемости ГК в странах с традиционно низким уровнем заболеваемости ГК стала возрастать, вероятно, в результате распространения HCV (см. ниже). В зонах высокого риска ГК обычно возникают у населения среднего возраста (20-34 года), в то время как в странах с низким уровнем заболеваемости ГК страдают в основном пациенты старшего возраста (55-59 лет). ГК чаще всего возникают на фоне хронических заболеваний печени, прежде всего при циррозе. В таких случаях возникновению ГК обычно предшествует образование гепатоцеллюлярных аденом, которые могут давать начало злокачественным ГК. Нередко в наиболее поврежденных участках печени наблюдается несколько очагов опухолевого роста. От 50 до 80% ГК обладает способностью метастазировать в другие органы, прежде всего в легкие, семенники, костный мозг, желудочно-кишечный тракт, мочевой пузырь и поджелудочную железу (Kojiro et al., 1997). Скорость удвоения объема опухоли составляет от 1 до 20 (в среднем 6) месяцев. Гистология ГК существенно варьирует, чаще всего встречаются опухоли с трабекулярным строением, менее распространены уплотненные варианты, характеризующиеся фиброзом. Образование печеночных балок толщиной более чем 3 клетки и отсутствие ретикулина отличают дифференцированные ГК от гепатоцеллюлярных аденом. Основными признаками, позволяющими отличить низкодифференцированные ГК от печеночных метастазов негепатоцитарного происхождения, являются продукция желчи, экспрессия АФП, Bgpl, CD 10 (Rocken and Carl-McGrath, 2001). Редко встречающиеся и существенно отличающиеся от других типов фиброламеллярные ГК, состоящие из отдельных фиброзных слоев и полигональных клеток, возникают обычно у женщин молодого возраста (в среднем 23 года) в отсутствие хронических болезней печени (Ishak et al., 2001). 2.3. Стадии гепатоканцерогенеза В 1940-х годах Berenblum (Berenblum, 1941) на модели рака кожи мышей была разработана теория многостадийного канцерогенеза, согласно которой возникновение опухоли происходит в результате ряда последовательных событий.
Позже эта теория была подтверждена для других типов опухолей, в том числе для опухолей печени (Pitot and Sirica, 1980). Выделяют три основных стадии канцерогенеза: инициацию, промоцию и прогрессию. Инициация происходит при воздействии канцерогена или спонтанных изменениях в клетке, в дальнейшем приводящих к образованию опухоли. Инициация необратима, на этой стадии происходят изменения последовательности ДНК, приводящие к мутациям отдельных генов. Эффективность инициации зависит от стадии клеточного цикла и не зависит от дозы канцерогена. Наличие в клетке других мутаций, например, нарушение системы репарации, усиливает эффективность инициации. К факторам, облегчающим индукцию опухолей, относится так же усиление пролиферации с помощью митогенов или активации регенерации. Инициирующим называется химический, физический или биологический агент, который способен непосредственно и необратимо изменять исходную последовательность ДНК клетки. Хорошо изученными инициаторами гепатоканцерогенеза являются афлатоксины, о-аминоазотолуен, диэтилнитрозамин, 2-ацетиламинофлуорен, вирусы HBV и HCV (Турусов, 1985). Инициированные клетки можно обнаружить в нормальной ткани по ускорению роста, они, как правило, не экспрессируют специфических маркеров. Группы таких клеток получили название пренеопластических фокусов или узелков. Для инициированных клеток характерны пониженная чувствительность к антипролиферативному действию ксенобиотиков и токсинов и повышенная чувствительность к митогенам или сигналам регенерации (Faber, 1980). Промежуток времени, необходимый для клинического проявления опухоли получил название промоции. В этот период в клетке происходят существенные изменения метаболизма и активности генов, способствующие трансформации. Эта стадия обратима, при отмене промотора возможна регрессия. Стадия промоции зависит от внешних факторов, таких, как качество и количество пищи, доза промотора, возраст, уровень гормонов или введение веществ, обладающих антиканцерогенной активностью, например, производных ретиноевой кислоты для опухолей кожи. Промоторное действие оказывают вещества, изменяющие характер экспрессии генов и способные индуцировать пролиферацию. Классическими промоторами гепатоканцерогенеза являются фенобарбитал, полихлорбифенил, дихлордифенилтрихлороэтан, эстрогены. Главным эффектом промоторов является сокращение времени, необходимого для проявления опухоли и увеличение эффективности канцерогенеза. Некоторые инициаторы также обладают промоторными свойствами. Клетки, находящиеся на этой стадии канцерогенеза, можно отличить по изменению спектра экспрессии генов, появлению белков, нехарактерных для данной ткани или стадии дифференцировки, а также по изменению паттерна ферментативной активности. Для гепатоцитов на стадии промоции характерны снижение активности ферментов синтеза гликогена, накопление рибосом и изменение реакции цитоплазмы от ацидофильной к базофильной, увеличение активности эмбриональной изоформы у- глютамилтранспептидазы, увеличением синтеза глютатион-8-трансферазы, появление специфических маркеров (АФП), увеличение скорости синтеза ДНК и числа митозов.
Стадия промоции сопровождается морфологическими изменениями: значительное усиление роста приводит к обособлению гиперпластических узелков, как правило, вокруг артериальных сосудов. Ядра клеток в таких фокусах характеризуются деконденсацией хроматина, в цитоплазме наблюдается уменьшение мембран эндоплазматического ретикулума. Межклеточные контакты разрушаются и клетки отделяются друг от друга. Стадия промоции завершается либо полным исчезновением гиперплазии, либо образованием опухоли, дальнейшее развитие которой происходит за счет прогрессии. Прогрессией называется процесс озлокачествления опухоли, ее эволюция от доброкачественного новообразования к метастазирующей опухоли. Эта стадия необратима, так как для нее характерна растущая нестабильность генома, приводящая к анеуплодиям и другим хромосомным аберрациям. В клетках отбираются и накапливаются изменения, приводящие к ускорению пролиферации, появлению инвазивности, а на последних стадиях и способности к метастазированию. Усиливать прогрессию способны как инициаторы, так и промоторы, кроме того, опухолевая прогрессия может происходить спонтанно за счет усиливающейся геномной нестабильности. На этой стадии показана транскрипционная или мутационная активация многих протоонкогенов (Pitot and Dragan, 1991) и изменение активности ряда ферментов. Несмотря на существование большого числа экспериментальных моделей, ключевые механизмы прогрессии пока изучены недостаточно. 2.4. Патогенез ГК На возникновение ГК в разной мере оказывают влияние факторы окружающей среды, инфекции, питание, метаболические и эндокринные нарушения, пол и возраст пациента. Основные факторы риска представлены в Таблице 1, важнейшие из них, хроническая инфекция вирусами гепатита В и С, цирроз и химические гепатоканцерогены будут подробно рассмотрены Хронический гепатит, вызываемый вирусами HBV и HCV, ассоциирован с некрозом клеток печени, воспалением, повышением синтеза цитокинов и фиброзом. Воспаление при вирусном гепатите связано с действием на гепатоциты цитотоксических Т и мононуклеарных клеток.
Свойства опухолевой клетки
В последние годы сформулирован ряд общих свойств, определяющих злокачественную трансформацию клеток (Рис. 2) (Hanahan and Weinberg, 2000; Копнин, 2000; Hahn and Weinberg, 2002). Как показывает анализ литературы, эти свойства характерны и для процесса гепатоканцерогенеза. Ниже будут коротко освещены основные свойства опухолевых клеток, а в следующей главе будут рассмотрены генетические механизмы их реализации. Нормальные клетки нуждаются в ростовых сигналах, которые передаются посредством каскада тирозиновых киназ. Такими сигналами могут служить растворимые ростовые факторы, компоненты внеклеточного матрикса и молекулы межклеточных контактов. Автономность трансформированной клетки достигается «подменой» ростового сигнала. Важным для пролиферации гепатоцитов является фактор роста гепатоцитов (HGF), продуцируемый эндотелием печени. Клинические исследования показали, что у многих пациентов с ГК значительно повышен уровень экспрессии HGF или его рецептора c-Met (Shiota et al., 1995; Huang et al., 1999). Экспрессия конститутивно активной формы рецептора с-Met достаточна для иммортализации первичных гепатоцитов мыши (Amicone, 1997). Мишенью активирующих мутаций в ГК часто становится ген передающей пролиферативный сигнал киназы N-ras (Adjei, 2001). Автономность от ростовых сигналов может достигаться при изменении механизмов взаимодействия клетки с матриксом. 2.5.2. Нечувствительность к сигналам, запрещающим рост Нормальная клетка постоянно получает сигналы, которые удерживают ее либо в стадии покоя Ge, либо в пост-митоти ческой стадии. Трансформированная клетка должна обладать способностью преодолевать сигналы, препятствующие ее росту. Одним из ключевых регуляторов клеточного цикла является белок Rb, регулирующий активность транскрипционного фактора E2F. В гипофосфорилированном состоянии pRb связывает E2F, который необходим для экспрессии генов, контролирующих переход из Gi в S-фазу (Hahn and Weinberg, 2002). Активность pRb регулируется внешними факторами, например, подавляется TGFp. Описано несколько способов инактивации pRb: мутации самого гена, нарушения TGF-P зависимого пути передачи сигнала, инактивация pRb вирусными онкогенами, мутации plS 48, Smad4 или CDK4. Для ГК характерна потеря гетерозиготности в локусе Rb (до 48% случаев) и подавление экспрессии этого гена (30-50% случаев) (Buendia, 2000). Изменения в спектре экспрессии интегринов могут приводить к потере клетками чувствительности к тормозящим пролиферацию сигналам ЕСМ.
Еще один характерный для ГК путь утраты чувствительности к запрещающим рост сигналам - активация Wnt сигнального пути за счет нарушения адгезионных контактов, стабилизации р-катенина и его транслокации в ядро, где в комплексе с факторами Tcf/LEF этот белок может активировать транскрипцию с-тус, циклина D1, матриксных металлопротеаз и фибронектина (см. п. 2.6.1.). Этот механизм чаще всего реализуется за счет мутаций гена Р-катенина (см обзор (Buendia, 2000)). 2.5.3. Уклонение от программы апоптоза. Преодоление апоптоза необходимо для успешного развития опухоли. Наиболее универсальным молекулярным изменением в различных новообразованиях человека является инактивация функции белка р53 (Чумаков, 2000). Более чем в половине всех опухолей человека (50-60% новообразований более чем 50 различных типов) обнаруживаются мутации гена р53, мутации этого гена обнаруживают в трети случаев ПС (см. п. 2.6.2). Кроме того, инактивация р53 на ранних стадиях гепатоканцерогенеза может определяться его связыванием с вирусными белками HBV или HCV (п. 2.4.2-2.4.3.). Предполагается, что онкогенный потенциал аномалий р53 прежде всего связан с потерей контроля над размножением измененных клеток, в том числе тех, в которых произошла активация онкогенов, а также с возникновением генетической нестабильности, резко увеличивающей вероятность появления других онкогенных мутаций. Подавление р53-зависимого апоптоза резко увеличивает жизнеспособность опухолевых клеток при попадании их в кровоток, что ведет к значительному повышению вероятности метастазирования. К числу других важнейших механизмов «выживания», реализуемых при гепатоканцерогенезе, можно отнести активацию Ras, гиперэкспрессию IGF1/2 и мутации анти-онкогена PTEN (Fietelson et al., 2002). 2.5.4. Неограниченный репликативный потенциал. Даже приобретя способность к неограниченному росту и независимость от ростовых сигналов, трансформированные клетки не могут создать опухоль значительной массы, пока их репликативный потенциал ограничен так называемым пределом Хайфлика, связанным с физическим укорачиванием концов хромосом, теломер, при делении. Однако репликативный потенциал трансформированных клеток может стать практически неограниченным благодаря активности теломеразы, сложного комплекса с обратно-транскриптазной активностью, достраивающего концы хромосом с РНК-матрицы. Такой же механизм обеспечивает способность эмбриональных тканей к пролиферации. Ткань печени в этом смысле находится в «привилегированном» состоянии, так как она способна к практически неограниченной регенерации. В печени грызунов теломераза конститутивно активна, при регенерации ее активность существенно повышается (Golubovskaya, 1997; Tsujiuchi, 1998; Yamaguchi, 1998). Возможно, в таких случаях активация теломеразы не является критическим этапом для опухолевой трансформации, однако может отражать изменения в находящихся выше механизмах транскрипционной регуляции. Повышение теломеразной активности описано для разных типов опухолей, в том числе для 85% ПС (Tahara et al., 1995). Активность теломеразы в значительной степени определяется уровнем транскрипции гена TERT, который кодирует каталитическую субъединицу, обладающую РНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью (Lingner et al., 1997; Bodnar et al., 1998). Регуляция экспрессии гена TERT может непосредственно активироваться прото-онкогеном c-myc (Wang et al., 1999), который часто гиперэкспрессируется в различных типах опухолей, в том числе в ПС. Гипер-экспрессия с-тус при гепатоканцерогенезе может достигаться как амплификацией этого гена, так и активацией Wnt сигнального пути. 2.5.5.
Способность к ангиогенезу. Растущей опухоли так же, как и нормальной ткани, необходимо поступление питательных веществ и кислорода. Ангиогенез (процесс образования сосудов) регулируют инициирующие (фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), факторы роста фибробластов (FGF) -1 и -2) и блокирующие (тромбоспондин-1) факторы. При этом в печени осуществляется положительная обратная связь между эндотелием сосудов и гепатоцитами: эндотелий продуцирует HGF, являющийся сильным митогеном для гепатоцитов, а нормальные гепатоциты на низком уровне продуцируют VEGF, активирующий рост сосудов (Yamane, 1994). При росте опухоли спектр продуцируемых регуляторов сосудистого роста смещается в пользу факторов, индуцирующих ангиогенез. Задача облегчается, если мутирован или подавлен р53, который активирует экспрессию тромбоспондина-1, или если активирован Ras, являющийся активатором VEGF. Кроме того, ангиогенезу может способствовать Р-катенин-зависимая активация металлопротеиназ (см. п. 2.6.1.), разрушающих внеклеточный матрикс, из которого освобождается значительный запас ростовых факторов (Taipale, 1997). 2.5.6. Генетическая нестабильность. Генетическая нестабильность является фактором, обеспечивающим возникновение и накопление генетических изменений, которые в ходе постоянного отбора приводят к возникновению все более злокачественного фенотипа опухоли. Нарушение систем репликации и репарации приводит к повышению числа ошибок при воспроизведении генетической информации, подавление индукции апоптоза повышает выживаемость клеток с повреждениями ДНК, но наиболее эффективным представляется нарушение системы контроля клеточного цикла, предотвращающей пролиферацию клеток с поврежденным геномом. Дисфункция опухолевых супрессоров р53 и pRb, а также протоонкогенов Мус и Ras, часто наблюдаемая в ПС, приводит именно к таким последствиям (Копнин, 2000). 2.5.7. Способность к инвазии и метастазированию. Удаленные метастазы являются причиной смерти 90% онкологических больных. Способность к инвазии и метастазированию позволяет злокачественным клеткам выходить за пределы первичной опухоли и заселять новые пространства с пока не ограниченным количеством места и питательных веществ.
Закономерности экспрессии гепато-специфических генов в гк мыши различного уровня дифференцировки
На следующем этапе работы мы решили проверить, какие из выявленных нами при анализе прогрессии ГК закономерностей экспрессии генов являются общими для процесса дифференцировки опухолей. Для этого нами была использована коллекция независимо индуцированных диэтилнитрозамином и фенобарбиталом перевиваемых ГК мышей, полученная в НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН. Из этой коллекции нами было отобрано 12 опухолей, которые по скорости роста и уровню дифференцировки можно условно разделить на две группы: медленнорастущие высокодифференцированные ГК и быстрорастущие низкодифференцированные ГК. Эти опухоли и нормальная печень взрослой мыши были параллельно исследованы двумя методами: результаты гистологического анализа уровня дифференцировки ГК были сопоставлены с данными полуколичественного ОТ-ПЦР анализа уровней экспрессии печень-специфических генов и некоторых других вероятных эффекторов гепатоканцерогенеза. Уровень дифференцировки ГК оценивали по гистологическим препаратам, описание которых проводили в сотрудничестве с B.C. Турусовым и О.В. Морозовой (Лаборатория канцерогенных веществ НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН). При этом степень дифференцировки определялась следующими факторами: сохранилась ли в опухоли хотя бы частично балочная структура печени; состоит ли опухоль из клеток эпителиального типа; одинаковы ли клетки по размеру и плоидности; каков пролиферативный статус опухолевых клеток; имеются ли очаги некрозов; врастают ли в опухоль тяжи соединительной ткани. Результаты этой части работы представлены в Табл. 3. Типичная морфология дифференцированной медленнорастущей ГК (DBF $5) и типичная морфология быстрорастущей опухоли (BDF1 674) представлены на Рис. 2 Таким образом, в исследуемую панель вошло 12 опухолей (в том числе описанные ранее мГК и 6ГК) пять из которых были описаны как дифференцированные, а семь - как нелиЛЛепенпипованные ГК. Из обпазнон опухолей была вылелена тотальная клеточная РНК, которая совместно с О.А.Черемновой и Д.А. Флейшман была использована для анализа уровней экспрессии генов методом ОТ-ПЦР. Целью этой части исследования была идентификация генов, изменение активности которых наиболее четко отражает развитие злокачественного фенотипа. В частности, мы хотели определить: - Всегда ли экспрессия HNF4a коррелирует с уровнем дифференцировки химически индуцированных ГК мышей? - Связаны ли уровни экспрессии ГЯФ с дифференцировочным статусом ГК? - Какие гены имеют сходные паттерны экспрессии при гепатоканцерогенезе?
Для контроля специфичности ОТ-ПЦР с различными наборами праймеров была использована РНК из нормальной печени взрослой мыши (№1 в панели). Кроме того, о достоверности полученных данных судили, сопоставляя их с результатами аналогичных экспериментов, полученными ранее при исследовании мГК и 6ГК. Полученные данные подтверждали повторными ПЦР с независимо ревертированных кДНК. В реакцию обратной транскрипции брали равное количество РНК каждого образца, однако для полного подтверждения точности выравнивания проводили ПЦР с праймерами к последовательностям HPRT и Р-актина, которые равномерно экспрессируются во всех клетках. Данные ОТ-ПЦР анализа представлены в Табл. 4, а также на Рис. 23, 24 и 25, отображающих электрофорез продуктов ОТ-ПЦР. Продукты ПЦР наносили в 1% агарозные гели в обычном порядке (1-13). Размеры всех продуктов ОТ-ПЦР совпадали с теоретически предсказанными на основе нуклеотидных последовательностей соответствующих генов. В первую очередь был проведен анализ экспрессии гена СА, основного маркера дифференцированных гепатоцитов. Оказалось, что этот ген экспрессируется лишь в печени и в тех пяти медленнорастущих опухолях, которые при гистологическом анализе были признаны высокодифференцированными (Рис. 23). Таким образом, гистологическая классификация была подтверждена на уровне экспрессии генов. Анализ уровней экспрессии гена HNF4a в образцах ГК показал, что HNF4a экспрессируется только в печени и пяти высокодифференцированных опухолях. В семи недифференцированных быстрорастущих гепатомах экспрессия гена HNF4a не была обнаружена. Таким образом, уровень дифференцировки ГК четко коррелирует с уровнем экспрессии гена HNF4a. Аналогичным образом экспрессируются взрослые изоформы HNF4al-a6(PHC. 23). Важно отметить, что во всех дифференцированных опухолях произошла индукция эмбриональных изоформ HNF4a7-a8, которые практически не экспрессируются во взрослой печени. В дедифференцированных ГК наблюдалась одновременная утрата экспрессии всех изоформ HNF4a. При сравнении уровней экспрессии других ГЯФ и некоторых генов, являющихся вероятными маркерами гепатоканцерогенеза, по характеру экспрессии в ГК разных уровней дифференцировки мы смогли выделить три группы факторов: 1) Гены, экспрессия которых четко связана со степенью дифференцировки, скоростью роста опухолей и уровнем экспрессии HNF4a (в Табл. 4 выделены красным цветом). К этой группе генов относятся HNF1, vHNFl, HNF3y, C/EBPa, FTF, и CA, которые транскрибируются в нормальной печени и дифференцированных опухолях, а также ген COUPFI, гиперэкспрессирующийся в де-дефференцированных ГК (обратная корреляция с уровнем дифференцировки) (Рис. 23). Вероятно, именно репрессия (или, в случае COUPFI, активация) генов, входящих в эту группу, могут играть наиболее существенную роль в процессе де-дифференцировки при гепатоканцерогенезе. Полное совпадение паттернов экспрессии этой группы генов предполагает возможность кооперативной регуляции их экспрессии. Важно отметить, что большинство генов этой группы по результатам предыдущей серии экспериментов (Гл. ...) являются прямыми или опосредованными мишенями HNF4a. 2) Гены, активность которых нестрого связана с дифференцировочным статусом ГК: HNF6, С/ЕВРР, GATA4, АФП, Сх32, интегрин a3, Snail, и Е-кадхерин (не более трех несовпадений, в Табл. 4 эти гены обозначены синим цветом) (Рис. 24). Отсутствие экспрессии онко-эмбрионального маркера АФП в некоторых дедифференцированных ГК вероятно стало следствием репрессии факторов, регулирующих транскрипцию АФП и свидетельствует об их наибольшей злокачественности по сравнению с другими опухолями. Ген важного эпителиального маркера Е-кадхерина активен в трех наиболее дифференцированных опухолях, а также в одной де-дифференцированной опухоли, гистологический анализ которой свидетельствует о тесном взаимодействии между клетками. Примечательно, что ген Snail, ключевой ген эпителиально-мезенхимального перехода (Hemavathy et al., 2000) и репрессор Е-кадхерина, активен в тех опухолях, где не функционирует Е-кадхерин.
По видимому, гены этой группы могут быть вовлечены в развитие злокачественного фенотипа ГК, но не являются определяющими для этого процесса, а регуляция их экспрессии напрямую не связана с активностью HNF4a. 3) Гены, экспрессирующиеся независимо от HNF4a и не коррелирующие с уровнем дифференцировки: HNF3a, HNF3p, GATA6, COUPFII, c-myc и р-катенин (Рис. 25). Экспрессия HNF3a и HNF3P сохраняется в части недифференцированных ГК, но, по-видимому, не является достаточной для сохранения гепато-специфического паттерна экспрессии и поддержания эпителиальной морфологии клеток. Повышение уровней экспрессии генов с-тус и Р-катенина во всех ГК по сравнению с нормальной печенью указывает на то, что их гиперэкспрессия является ранним событием гепатоканцерогенеза и не является непосредственной причиной де-дифференцировки клеток. Уровни транскрипции GATA6 и COUPFII в ГК по сравнению с нормальной печенью не изменяются. Таким образом, в проанализированной нами коллекции ГК существует прямая корреляция между морфологическими признаками дифференцировки, экспрессией гепато-специфических маркеров и статусом гепатоцитарного регулятора HNF4a. Важно отметить, что в группу генов, четко связанных с дифференцировочным статусом ГК, попали исключительно ткане-специфические регуляторы транскрипции. Между большинством из них просматриваются четкие регуляторные связи, и центральную роль в этой регуляции играет HNF4al. Необходимо отметить, что единственный фактор этой группы, транскрипция которого, по всей видимости, не индуцируется HNF4al в культуре клеток бГК, С/ЕВРа, при прогрессии ГК репрессирован не полностью, и представляется маловероятным, что критические изменения в дифференцировочной программе клетки могли быть вызваны колебанием уровня его экспрессии.
Регуляция экспрессии гена афп
На протяжении нескольких десятилетий онко-эмбриональный белок АФП широко используется в клинической онкологии для диагностики ГК. Несмотря на то, что за последние годы достигнут значительный прогресс в изучении регуляторных элементов гена АФП и идентифицировано значительное число транскрипционных факторов, участвующих в его" регуляции, механизм активации этого гена при гепатоканцерогенезе остается невыясненным. Понимание механизмов регуляции гена АФП в опухолевых клетках представляется важной проблемой современной онкологии, поскольку может не только привести к идентификации ключевых событий, определяющих злокачественный рост клеток печени, но и открыть новые перспективы в диагностике и лечении ГК. Полученные в этой работе данные о подавлении транскрипции АФП в соматических гибридах АФП и АФП" клонов указывают на то, что в описанной экспериментальной системе доминирует негативный механизм регуляции экспрессии этого гена. Видимо, подавление экспрессии гена АФП в соматических гибридах происходит за счет наличия в АФП" клонах негативного транскрипционного фактора (или факторов), которого нет в клетках АФП4" клона. Этот предполагаемый фактор может непосредственно связываться с регуляторным районом гена АФП, или действовать опосредовано, подавляя экспрессию активаторов транскрипции гена АФП. Практически все изученные к настоящему времени транскрипционные факторы, взаимодействующие с регуляторными элементами гена АФП, являются либо активаторами транскрипции, либо, в зависимости от собственной концентрации и присутствия других факторов, могут выполнять как активаторные, так и репрессорные функции (Лазаревич, 2000). К последней группе регуляторов транскрипции относятся не ткане-специфические факторы: NF-1, АР-1, глюкокортикоидный и ретиноидный гормон-рецепторный комплекс. Нам представляется, что регуляция экспрессии онко-эмбрионального маркера АФП, синтез которого строго коррелирует с важнейшими этапами в судьбе гепатоцита — дифференцировкой, регенерацией и опухолевой трансформацией, должна осуществляться не на уровне конкуренции или молярных соотношений транскрипционных факторов, каждый из которых активирует промотор гена, а зависеть от ключевых ткане-специфических механизмов, связанных с поддержанием дифференцировочного статуса гепатоцитов.
Недавно предложен механизм р53-зависимой репрессии гена АФП за счет возможной конкуренции этого белка с активационным фактором HNF3 за перекрывающиеся сайты связывания, расположенные в репрессорном районе гена (Lee et al., 1999). Показано также, что р53 блокирует функции таких важных гепато-специфических факторов, как HNF4al (Maeda et al., 2002) и C/EBPa (Kubicka et al., 1999), что приводит к нарушению экспрессии белков, специфических для печени. Возможно, р53 участвует в регуляции экспрессии гена АФП на некоторых стадиях развития, однако такой механизм, по-видимому, не носит универсального характера, так как в первичной культуре мышиных гепатоцитов индукция экспрессии гена АФП происходит независимо от активности р53, а в клонах крысиной гепатомы, различающихся по уровню экспрессии АФП, этот признак не коррелирует с активностью р53 (Кудрявцева и Лазаревич, неопубликованные данные). Кроме того, в печени р53-/- мышей не наблюдается активации экспрессии гена АФП (Альперн и др, неопубликованные данные). Таким образом, р53 не является ключевым регулятором постнатальной репрессии гена АФП, как это предполагалось в ряде работ (Lee et al., 1999; Ogden et al., 2000). Все эти данные не исключают участия р53 в регуляции транскрипции АФП, однако предполагают существование дополнительных регуляторных механизмов супрессии гена АФП. Ни один из известных транскрипционных факторов, способных подавлять экспрессию АФП в тех или иных экспериментальных системах, не является гепато-специфическим. Кроме того, ни для одного из них не установлено обратной зависимости между повышением транскрипционной активности или уровня экспрессии и репрессией гена АФП в онтогенезе. В литературе есть данные, указывающие на существование гепато-специфических негативных регуляторов, определяющих подавление экспрессии гена АФП в процессе развития (Spear, 1999), однако такие факторы пока не идентифицированы. Одновременно с АФП в соматических гибридах клонов крысиной гепатомы происходит подавление экспрессии других гепато-специфических генов, в том числе генов, кодирующих родственные белки альбуминового семейства. В нормальной печени после рождения экспрессия эмбрионального белка АФП замещается синтезом белков, специфических для зрелых гепатоцитов — СА, а-АЛБ и ДСБ. При возникновении гепатом механизмы регуляции генов могут нарушаться. По характеру экспрессии ткане-специфических генов существующие культуры гепатомных клеток можно разделить на три основных класса (Torres-Padilla et al., 2001). К первому классу относятся дифференцированные гепатомы, например McA-RH 8994, которые сохраняют взрослый тип экспрессии генов: в них подавлена экспрессия АФП, сохраняется экспрессия СА и многих транс-факторов, в том числе HNF4a. Другой класс гепатом, таких как McA-RH 7777 и HepG2, представляет эмбриональный тип экспрессии генов: в них одновременно экспрессируются АФП и СА, а также HNF4a и многие ГЯФ, что позволяет считать их умеренно дифференцированными. Наконец, третий вид гепатом - де-дифференцированные, которые утрачивают экспрессию печень-специфических белков и ГЯФ. Тандемное расположение альбуминовых генов и динамика их экспрессии в онтогенезе свидетельствуют о том, что подавление экспрессии АФП и активация СА взаимосвязаны. Экспрессия генов семейства альбумина регулируется координировано, в такой регуляции участвуют общие транскрипционные факторы и z/uc-элементы. Вероятными координаторами экспрессии альбуминовых генов представляются факторы семейства HNF1, сайты связывания которых обнаружены в регуляторных элементах всех этих генов (Лазаревич, 2000). В период эмбрионального развития уровень мРНК vHNFl преобладает над HNF1. После рождения транскрипция гена HNF1 повышается параллельно с падением экспрессии гена vHNFl. Во взрослой печени соотношение уровней экспрессии факторов этого семейства значительно сдвинуто в пользу HNF1. В некоторых модельных системах экспрессия эмбрионального гена АФП преимущественно активируется фактором vHNFl, тогда как гены, экспрессирующиеся в дифференцированных гепатоцитах, СА и ДСБ, эффективнее активируются фактором HNF1. Нокаут гена vHNFl, но не HNF1, в эмбриональных стволовых клетках приводит к падению синтеза АФП (Coffinier et al., 1999). В экспериментах по восстановлению экспрессии HNF1 или vHNFl в АФП клоне 7Е10 мы показали, что в исследуемой системе эти факторы не достаточны для активации транскрипции АФП, СА и ссАЛБ.
По-видимому, только уровень транскрипции ДСБ четко определяется активностью HNF1. Эти результаты показывают, что в исследуемых клонах уровень HNF1, являющийся по мнению Bernier и соавторов определяющим для экспрессии АФП, не влияет на транскрипцию этого гена. Другими вероятными эффекторами транскрипции АФП представляются эмбриональные и взрослые изоформы HNF4a. Этот фактор может связываться с каноническим сайтом ядерных рецепторов DR1 в промоторе гена АФП. Показано, что промоторы ранних гепато-специфических белков, таких как АФП и ТТР, сильнее активируются эмбриональной формой HNF4a7. Экспрессия этой формы начинается на 4.5 сутки развития мышиного эмбриона и предшествует появлению АФП и других маркеров висцеральной энтодермы. Промоторы генов, кодирующих функциональные белки взрослой печени, например СА, эффективнее активируются HNF4al. Репрессия гена АФП после рождения совпадает по времени с падением экспрессии HNF4a7 и повышением уровня экспрессии HNF4al. Мы установили, что в АФГҐ" клоне экспрессируются обе группы изоформ, а в АФП" клонах экспрессия всех вариантов HNF4a полностью подавлена. Экзогенная экспрессия гена HNF4al в АФП" клоне 7Е10 привела к активации транскрипции гена АФП. Насколько нам известно, это первые данные, указывающие на определяющую роль взрослых изоформ HNF4a в регуляции гена АФП в опухолях. Эти результаты подтверждаются результатами исследования нескольких образцов ГК человека: в опухолевой ткани пациента с крайне де-дифференцированной ГК, низким уровнем АФП и способностью к метастазированию выявлено наиболее значительное подавление экспрессии HNF4al изоформ при сохранении уровня HNF4a7, зарегистрированного в окружающей опухоль ткани
