Содержание к диссертации
Введение
Введение 3
Актуальность проблемы 3
Цели и задачи исследования 4
Научная новизна и практическая ценность работы 6
Обзор литературы 8
Введение 8
Основные ДНК-мишени 9
Выбор образца. Контроль за контаминацией 16
Отбор проб. Экстракция древней ДНК 19
Амплификация древней ДНК 22
Конкретные приложения палеогеномики: молекулярная филогенетика, этногеномика, палеопатология, молекулярная антропология 23
Этические аспекты палеогеномных исследований 38
Материалы и методы 47
Подготовка к исследованию древней ДНК 47
Исследованный биоматериал и отбор проб 47
Контроль за аутентичностью результатов 48
Получение препаратов тотальной древней ДНК 49
Выделение древней ДНК из волос 49
Выделение древней ДНК из костного и рогового вещества 49
Количественное определение связывания ДНК с используемым лабораторным пластиком 50
ПЦР-амплификация древней ДНК 51
Амплификация митохондриальной ДНК 51
Молекулярное типирование пола 52
Амплификация гена 12S рРНК копытных животных 53
Секвенирование ДНК 54
Результаты и обсуждение 55
Молекулярно-генетическая характеристика популяции восточных эвенков по данным анализа ДНК, выделенной из антропологической коллекции волос 55
Характеристика ДНК древнего населения археологического памятника Березовая Лука (Алтай, эпоха бронзы) 66
Молекулярно-филогенетический анализ древней ДНК нового вида копытных Pseudonovibos spiralis W. P. Peter, A. W. Feiler 79
Выводы 93
- Выбор образца. Контроль за контаминацией
- Конкретные приложения палеогеномики: молекулярная филогенетика, этногеномика, палеопатология, молекулярная антропология
- Контроль за аутентичностью результатов
- Характеристика ДНК древнего населения археологического памятника Березовая Лука (Алтай, эпоха бронзы)
Введение к работе
Разработка методов анализа следовых количеств ДНК с помошью полимеразной цепной реакции (ПЦР) сделала возможным анализ древней ДНК - генетического материала, выделенного из образцов останков живых организмов и их частей значительного срока давности [74]. Антропологи и археологи и ранее использовали молекулярные характеристики ДНК, полученные для современного населения Земли, с целью описания изменчивости человека и выяснения вопросов антропогенеза, однако лишь анализ палео-ДНК позволил непосредственно ввести параметр времени в эти исследования. Спектр объектов, из которых можно выделить древнюю ДНК, весьма широк - от антропологических и палеонтологических находок до копролитов диких животных. То, что древняя ДНК находится в палеоматериале в следовых количествах, обусловило одну из важнейших проблем при ее исследовании - проблему аутентичности получаемых результатов [1].
Возможность применения в комплексных междисциплинарных исследованиях методов анализа древней ДНК из музейного, коллекционного материала и археологических находок, делает нашу работу актуальной для широкого круга специалистов разных областей науки. Расшифровка генома человека способствовала развитию целого ряда научных направлений в области молекулярной генетики, в частности этногеномики и палеогеномики [199]. Данные о генофонде уже не существующих популяций человека представляют несомненную научную значимость для изучения биологической истории современных народов, характеристики их генофондов и оценки основных направлений.эволюции всего человечества. Исследования древней ДНК животных и растений помогают определить направления эволюции их геномов и определить филогенетические связи древних видов с ныне существующими.
Исследование древней ДНК в рамках задач таких дисциплин, как антропология, археология, зоология возможно как на уровне единичной особи, так и на популяционном уровне. Возможность соотнесения получаемых в исследовании данных с современными данными значительно расширяет возможности применения анализа древней ДНК. Такой важнейший вопрос антропологии, как анализ возможных путей расселения современного человека по планете, в настоящее время решается с активным привлечением данных по анализу древней ДНК человека и культурных видов растений и животных.
ДНК-исследование древних патогенных микроорганизмов активно используется для определения направлений процессов эволюции возбудителей заболеваний человека и животных, а также для анализа особенностей распространения и течения инфекционных заболеваний у древнего населения.
Возможность анализа ДНК, выделенной из биоматериала, накопленного и систематизированного в богатейших зоологических, антропологических и музейных коллекциях, значительно расширяет временные границы ДНК-анализа, одновременно сокращая затраты на сбор материала. Кроме того, такое исследование является зачастую единственным способом получения информации о вымерших видах живых организмов.
Настоящая работа включала в себя апробацию на реальных образцах методик выделения и амплификации аутентичных препаратов древней ДНК, и непосредственное применение методов исследования древней ДНК человека и животных для решения конкретных научных задач в рамках комплексных междисциплинарных исследований.
Цели и задачи исследования Основной целью данного исследования является применение молекулярно-генетического анализа древней ДНК для решения конкретных научных задач антропологии, зоологии, археологии и истории. Для достижения поставленной цели надо было решить следующие задачи:
1. Разработать и апробировать на различных образцах системы выделения и амплификации аутентичных последовательностей древней ДНК из биологического материала различной видовой принадлежности и различного срока хранения.
2. Доказать возможность использования музейных антропологических образцов волос человека в качестве источника древней ДНК для молекулярно-генетического анализа. Установить структуру митотипов модельной популяции восточных эвенков, определить генетические расстояния между этой и другими этническими популяциями Азии. Установить уровень внутрипопуляционного нуклеотидного разнообразия гипервариабельного сегмента I митохондриальной ДНК (ГВСІ мтДНК) у восточных эвенков.
3. Провести анализ митотипов и молекулярное типирование пола на древней ДНК взрослых индивидуумов и младенцев, синхронно захороненных на территории погребально-поминального комплекса Березовая Лука (Алтай, Ш-П тыс. до н.э.). Попытаться установить возможную этническую принадлежность погребенных и степень их родства.
4. Провести исследование палео-ДНК недавно описанного вида вымершего копытного животного из Юго-Восточной Азии Pseudonovibos spiralis. Уточнить таксономическое положение данного вида среди прочих копытных путем сравнительного филогенетического анализа первичной последовательности гена 12S рРНК этого вида.
Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ онкогенеза Института молекулярной биологии РАН (зав. лаб. академик Л. Л. Киселев) на базе Межинститутского Кабинета по изучению древней ДНК ИМБ РАН (руководитель к.б.н. А. Б. Полтараус).
Научная новизна и практическая ценность работы
В первой части работы мы разработали и апробировали методики молекулярно-генетического анализа древней ДНК, выделенной из музейной антропологической коллекции образцов волос восточных эвенков, взятой в качестве модели. Впервые охарактеризована структура митохондриального генофонда восточных эвенков, показан высокий уровень внутрипопуляционного нуклеотидного разнообразия, рассчитаны генетические расстояния между восточными эвенками и родственными популяциями Азии. Эта работа является первым молекулярным исследованием популяций человека, основанным на анализе мтДНК, выделенной из коллекционного материала значительного (30 лет) срока хранения.
Во второй части работы мы провели комплексное исследование (анализ митотипов, молекулярное типирование пола) древней ДНК из костных останков взрослых и младенцев, найденных в синхронном захоронении на территории поминально-погребального комплекса эпохи бронзы Березовая Лука (предгорья Алтая, Ш-П тыс. до н.э.). Нами были получены и анализированы последовательности древней ДНК из костей младенцев большой давности захоронения. Данные о половой принадлежности погребенных младенцев, существенные для археологов и историков, изучающих данный исторический памятник, не могли быть получены классическими методами физической антропологии. Это исследование, равно как и попытка определения этнической принадлежности погребенных по их митотипам, делает проделанное исследование значимым для историко-археологической интерпретации памятника.
В третьей части работы нами была исследована древняя ДНК недавно описанного вымершего вида копытных животных Pseudonovibos spiralis, выделенная из единственного в нашей стране музейного образца рогов и лобной кости этого вида. Всего в мире насчитывается менее двух десятков таких образцов. Вид был описан лишь на основании необычных по форме рогов, и пока не было найдено целого скелета или черепа представителя этого вида. Необычное сочетание морфологических признаков рогов, разрозненность и недостоверность имеющейся о виде информации делают таксономический статус P. spiralis объектом активной дискуссии зоологов. Наше исследование позволило получить новую информацию о систематическом положении этого вида среди копытных.
Выбор образца. Контроль за контаминацией
Экстракция амплифицируемой древней ДНК возможна из широкого спектра биологического материала, включая зубы, волосы, кости и сохранившиеся мягкие ткани. Древняя ДНК может быть также получена из образцов, которые не являются древними в прямом смысле этого слова - музейных образцов шкур [58], волос [104, 105], экскрементов диких животных [35, 86]. ДНК, выделенная из подобных источников, сходна по трудностям исследования с подлинно древней ДНК из-за высокой степени фрагментации, окислительного и гидролитического повреждения, и присутствия ингибиторов ПЦР, экстрагируемых вместе с ДНК - зачастую компонентов фиксирующих растворов и других консервантов, применяемых в музейной практике [ПО]. При отборе образцов для исследования необходимо тщательно соблюдать предосторожности против контаминации образца современной ДНК. Качество препаратов ДНК, получаемых из древних образцов, в большей степени зависит от условий захоронения (нахождения образца в месте, где он был обнаружен археологами), нежели от его абсолютного возраста [120, 170, 59, 70, 73]. Вероятность успешного выделения аутентичного препарата древней ДНК из образца может быть в некоторой степени предсказана по морфологии самого образца, так как на нее влияет во многом тот же набор факторов, что и на нуклеиновые кислоты - кислород, свет, вода. За исключением тех случаев, когда образец является минерализованным, практика показывает, что чем образец кости или зуба более тверд, тем выше вероятность сохранности в нем интакной ДНК [74]. Наиболее важным путем распада ДНК в древних образцах является депуринирование [111], сопровождаемое разрывом фосфодиэфирных связей и разрушением деоксирибозного кольца [6]. Скорость деградации ДНК в древних образцах зависит от температуры, относительной влажности, уровня подземных вод, и кислотности почвы в месте захоронения образца. Особенности почвы, в которой найден образец, могут также влиять на возможность успешного выделения амплифицируемой в ПЦР древней ДНК, так как гуминовые кислоты почвы являются мощным ингибитором ПЦР, экстрагируясь из образца вместе с нуклеиновыми кислотами [74].
Одним из способов предсказания наличия в образце амплифицируемой ДНК является исследование степени рацемизации аминокислот образца. Данный метод основан на том, что при жизни организма все аминокислоты его белков имеют L-конформацию, и только после смерти организма аминокислоты начинают спонтанно изменять конформацию, т. е. рацемизоваться. На скорость подобных конформационных переходов влияют те же факторы, что и на деградацию нуклеиновых кислот [129, 53]. Анализ соотношения конформеров аминокислот образца способен, таким образом, указывать на вероятность выживания интактной ДНК. Однако, подобное исследование является деструктивным, требуя взятия довольно значительной пробы образца для проведения анализа, и, кроме того, невысокая степень рацемизации аминокислот образца вовсе не свидетельствует о высокой степени сохранности ДНК в образце. Из-за этих ограничений, равно как и из-за высокой стоимости исследования, этот метод не получил широкого внедрения в практику палеогеномных исследований. Содержание в образцах костной ткани основного белка соединительной ткани -коллагена - также может служить грубым индикатором биологической сохранности образца [160]. Этот способ также не получил широкого распространения из-за своей деструктивности и высокой стоимости анализа. Проведение подобного анализа имеет смысл только в случае планирующегося радиокарбонового исследования образца, когда определение содержания коллагена можно провести совместно с датированием [111]. Перед началом выделения древней ДНК из образца необходимо очистить его поверхность от возможного загрязнения экзогенной современной ДНК. Обычно археологические и музейные образцы проходят через руки многих исследователей, поэтому такое загрязнение является весьма вероятным. Некоторые стандартные процессы обработки образцов могут привести к контаминации, или распаду аутентичной ДНК образца - например, мытье водой способствует проникновению контаминирующей ДНК вглубь образца, а рентгенография может приводить к дополнительной фрагментации древней ДНК [39]. Возможными путями деконтаминации являются: физическое удаление поверхностного слоя образца, обработка его сильными окислителями (гипохлоритом натрия), облучение поверхности коротковолновым ультрафиолетовым излучением. Экзогенная ДНК может попадать в образцы из многих источников. Для полного контроля за аутентичностью получаемых результатов необходимо соблюдение при работе многих предосторожностей. Лаборатория, работающая с древней ДНК, должна иметь раздельные помещения для выделения древней ДНК и постановки ПЦР, разделенные с теми помещениями, где работают с современной ДНК и ПЦР-продуктами. Абсолютно необходимым является также использование защитной одежды и стерильных условий для работы (ламинарные шкафы, и др.). Все используемые реактивы и посуда должны быть свободны от ДНК [74]. Несмотря на все предпринимаемые предосторожности, необходимой мерой при анализе древней ДНК оказывается проведение множественных отрицательных и положительных контролей на всех этапах работы, начиная с выделения ДНК и заканчивая ее секвенированием. Хорошим контролем аутентичности получаемых данных служит параллельный анализ нескольких проб материала от каждого образца.
Весьма желательным является также повторение всего исследования, по возможности в другой лаборатории - главным препятствием в этом случае является высокая финансовая стоимость подобных исследований [1]. Отбор проб. Экстракция древней ДНК Для облегчения выхода ДНК из образца его тщательно измельчают, если речь идет о костной ткани. При этом необходимо иметь в виду вероятность заноса контаминирующей ДНК при измельчении. Из методов измельчения проб следует упомянуть растирание замороженных в жидком азоте проб, размалывание в шаровых мельницах, и пр. [74] Одним из наименее деструктивных методов отбора проб для палеогеномного исследования является засверливание плотных тканей образца низкоскоростной дрелью со сбором получаемой стружки [127]. Этот способ позволяет хорошо контролировать отсутствие загрязнения проб благодаря легкости деконтаминации используемого инструмента, и дает вполне адекватное для исследования количество хорошо измельченного биоматериала. Кроме того, этот способ позволяет забор проб материала с различной глубины образца, и взятие параллельных проб даже из ценных образцов без значительного их повреждения. Низкая скорость работы сверла (100 об/мин) исключает локальный перегрев образца, способный вызвать деградацию ДНК. В случае исследования образцов костной ткани некоторыми авторами рекомендуется предварительная декальцинация пробы в 0.5М растворе ЭДТА (рН 8.0) в течении 72 часов, со сменой раствора каждые 24 часа [95, 20]. Показано, что такая обработка повышает выход древней ДНК из пробы. Однако, подобное обращение с образцами может приводить к потерям ДНК при смене растворов, равно как и к контаминации современной ДНК. В настоящее время для выделения древней ДНК применяется два стандартизованных метода: классический протокол фенол-хлороформенной экстракции, адаптированный для древней ДНК [139], и протокол аффинного связывания ДНК на носителе (диатомит, стеклянный порошок, силикагель) в присутствии сильных хаотропных агентов.
Конкретные приложения палеогеномики: молекулярная филогенетика, этногеномика, палеопатология, молекулярная антропология
Применение анализа древней ДНК в антропологии позволяет изучать изменчивость генома человека и других организмов для проверки гипотез о происхождении и поведении человека. Быстрые изменения материальной культуры человека часто объясняют миграцией популяции. Такая гипотеза может быть точно проверена применением молекулярного анализа древних человеческих останков, относящихся к домиграционному и послемиграционному периодам [124, 50,112]. Доисторические перемещения популяций человека, а также непрерывность или последовательная смена популяций могут быть исследованы с помощью палео-ДНК. Примером работ, исследующих такие миграции и следующий за ними разрыв генетической, непрерывности, является исследование древнего населения Великого Бассейна (США, штат Невада) [71, 72, 70]. И лингвистические, и археологические данные были привлечены для демонстрации того, что современное население Великого Бассейна, говорящее на нумских языках, является недавними (ок. 1000 лет) мигрантами в эту область, заместившими прежнее население [91]. Однако, другие исследователи оценивали те же данные как свидетельства адаптации местного населения к изменяющемуся окружению и растущей плотности популяции [91]. Исследование митохондриального генофонда современного коренного населения Америки показало, что большинство населения имеет митотипы, принадлежащие к материнским американским гаплогруппам А, В, С, D и X [95, 94, 153]. Сравнительный анализ спектров этих гаплогрупп у представителей древнего и современного населения Великого бассейна выявил значительные генетические различия между этими популяциями. Отсутствие генетической преемственности между древним и современным населением поддерживает гипотезу о недавней миграции носителей нумских языков в район Великого Бассейна. Интересно, что сходные с древним населением Великого бассейна значения частот встречаемости материнских гаплогрупп показаны для современного коренного населения Калифорнии, имеющего культурные связи с палеоиндейцами Великого Бассейна [48, 102]. Данные по палео-ДНК активно используются для решения вопросов о заселении человеком крупных территорий — континентов или гряд островов в Тихом Океане [57, 153, 1, 152]. Было показано, например, что древние палеоиндейцы (первопоселенцы Америки) морфологически отличны от современного коренного населения [109, 151]. Этот факт позволил предположить, что современное коренное население Америки не является потомками палеоиндейского населения [103].
Однако, анализ древней ДНК из останков палеоиндейцев показал, что большинство исследованных индивидуумов принадлежат к митохондриальным гаплогруппам, характерным для современного коренного населения Америки [145]. Это указывает на наличие генетической непрерывности между самыми ранними жителями Америки и современным коренным населением. Анализ древней ДНК применяется для установления филогенетических связей между современными людьми и другими гоминидами. Место неандертальцев в эволюционной истории человека активно обсуждалось с момента признания их группой, близкой современному человеку. Первая последовательность участка митохондриальной ДНК неандертальца была определена в 1997 году [80], причем при попытке повторить полученный результат в независимой лаборатории исследователям удалось амплифицировать только загрязнившую образец современную человеческую ДНК (А. Stone). С момента публикации первой последовательности ДНК неандертальца вышло еще две статьи [79, 116]. Таким образом, суммарное число исследованных индивидуумов неандертальцев достигло трёх. Результаты этих уникальных исследований свидетельствуют, что последовательность митохондриальной ДНК неандертальцев значительно отличается от таковой у современных людей. Дивергенция последовательностей внутри выборки незначительна, и составляет 3.8% - это указывает на принадлежность исследованных индивидуумов к единой генетической ветви. Такой порядок внутрипопуляционной дивергенции близок к среднему показателю для современных популяций человека. «Неандертальские» гаплотипы мтДНК на сегодняшний момент не выявлены в популяциях современных людей. Этот факт может указывать на то, что несмотря на длительное (около 20000 лет) совместное обитание групп неандертальцев и современных людей на территории Европы, эти популяции были полностью генетически изолированы друг от друга, по крайней мере, по материнской линии. Согласно расчетам, время дивергенции неандертальца и современного человека определяется порядком 500 тыс. лет назад, задолго до разделения современных людей на популяции. Исследование ДНК из останков древнего населения Сибири, датируемых концом 4 -началом 3 тысячелетия до н. э. (неолитический погребальный комплекс Усть-Ида, Прибайкалье), позволило получить генетические характеристики древней монголоидной популяции. Была исследована выборка из 19 индивидуумов. Авторы анализировали полиморфизм сайтов рестрикции гипервариабельного участка митохондриальной ДНК (позиции 16106-16545). Был определен уровень внутрипопуляционного нуклеотидного полиморфизма, и получена структура наиболее часто встречающихся митотипов исследованной неолитической популяции. Сравнение полученных в работе данных с литературными данными по современным нам коренным этническим группам Сибири, Монголии и Урала позволило выдвинуть гипотезу, что исследованная монголоидная группа является одним из потенциальных предков всего современного населения Сибири. По определенным генетическим расстояниям, принимая скорость нуклеотидных замен за постоянную величину, было рассчитано примерное время дивергенции исследованной неолитической популяции и современных популяций Сибири - порядка 5600 лет назад.
Это время хорошо согласуется с данными о возрасте исследованных останков, определенном методом радиокарбонового датирования - также порядка 5600 лет [108]. Группой российских исследователей была проведено интереснейшее исследование древней ДНК носителей культуры раннего железного века Горного Алтая (плоскогорье Укок). Эта культура, известная как пазырыкская, занимала в IV-II вв. до н. э., занимала одной из центральных мест в скифо-сибирском мире. Была определена нуклеотидная последовательность фрагмента 15926-16518 митохондриальной ДНК, содержащая полностью ГВСІ, у двух индивидуумов. Выявленные митотипы сопоставили с вариантами мтДНК современных европейцев, монголов и алтайцев. Один из полученных митотипов соответствовал промежуточному для монголоидных и европеоидных групп варианту, в то время как второй соответствовал специфичному монгольскому варианту, преимущественно представленному в современных этнических группах Северной Азии, и в значительно меньшей степени в центрально-азиатских популяциях. Для расширения представлений об антропогенетической структуре популяции пазырыкцев результаты молекулярно-генетического анализа были рассмотрены в сочетании с палеоантропологическими данными. Краниологическое изучение материалов пазырыкских погребений обнаружило присутствие как монголоидной, так и европеоидной компонент в ее составе. Европеоидная компонента была представлена краниологическим вариантом, встречающимся у населения скотоводческих племен II тыс. до н. э. на территории Южного Таджикистана, Южной и Юго-Западной Туркмении, и Северного. Ирана. В состав монголоидной компоненты входили два антропологических типа. Первый из них, автохтонный, обнаруживаемый на территории Алтая у людей, погребенных на рубеже неолита-энеолита, и во второй половине II тыс. до н. э., имеет значительное сходство с южно-сибирским расовым комплексом, современными носителями которого являются казахи, киргизы, некоторые группы хакасов и южных алтайцев. Второй антропологический тип - палеосибирский, доминировавший в эпоху неолита на территории Прибайкалья.
Контроль за аутентичностью результатов
Для выявления возможной контаминации современной ДНК исследуемых образцов применяли множественные положительные и отрицательные параллельные контроли на всех стадиях исследования. Все исследованные образцы анализировали путем неоднократных амплификации из независимо выделенных препаратов древней ДНК, и только повторяемые воспроизводимые результаты считались аутентичными. Все методы предотвращения контаминации и контроля за ней полностью соответствовали критериям, общепринятым при исследовании древней ДНК. Получение препаратов тотальной древней ДНК Все используемые реактивы и материалы тестировали на отсутствие их загрязнения человеческой ДНК, амплифицируемой используемыми в работе системами. В каждую серию образцов в качестве отрицательных контролей выделения ДНК включали пустые пробирки и пробирки с пластиковой стружкой с этапа забора проб. Полученные препараты древней ДНК хранили в замороженном виде при -20С. Выделение древней ДНК из волос «Р Для выделения ДНК использовали стержни волос без луковиц. Нарезанные на фрагменты длиной 1 см волосы, промытые последовательно раствором додецилсульфата натрия, дистиллированной водой и 96% этанолом, подсушивали на воздухе. Волосы заливали смесью для экстракции ДНК, состоящей из 0.2% водной суспензии ионообменной смолы Chelex-100 (Bio-Rad), содержащей протеиназу К (20 мкг/мкл, Applied Biosystems). Опытным путем было показано, что лизис образцов происходит и без добавки дитиотреитола в лизисный буферный раствор. Образцы инкубировали в течение 18 часов при 37 С и непрерывном перемешивании. Протеиназу К инактивировали нагреванием при 90С в течение 10 минут, лизат центрифугировали и 5 мкл полученного после центрифугирования супернатанта использовали без дополнительной очистки в качестве матрицы для ПЦР. Выделение древней ДНК из костного и рогового вещества Полученный при отборе проб измельченный биоматериал (100-200 мг) заливали 500 мкл лизирующего реагента (ЮМ гуанидина тиоцианат, 0.1М Tris-HCl рН 6.4, 0.02М EDTA рН 8.0, Triton Х-100 1.3%). Инкубацию проводили при +65С и непрерывном перемешивании в течение ночи. После экстрации образцы центрифугировали 5 минут при \ф 13000 g, 500 мкл супернатанта переносили в чистую микропробирку. К аликвоте супернатанта прибавляли 500 мкл лизирующего реагента и 40 мкл 10% суспензии диатомита в деионизованной воде. Пробы инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. После центрифугирования проб удаляли супернатант, осадок промывали дважды охлажденным до +4С промывным раствором (0.1М Tris-HCl рН 6.4, 70% этанол), ресуспендируя и осаждая диатомит центрифугированием. Осадок диатомита со связанной ДНК высушивали. ДНК элюировали двумя аликвотами подогретой до +56С деионизованной воды.
Объединенный элюат использовали непосредственно как матрицу для амплификации древней ДНК. Количественное определение связывания ДНК с используемым лабораторным пластиком Незначительные количества ДНК, содержащиеся в палеоматериале, накладывают серьезные ограничения на методы молекулярного исследования. Для определения количества ДНК, адсорбирующейся на полипропиленовых микропробирках, проводили анализ с использованием радиоактивно меченой фосфором-32 ДНК. В качестве модельной ДНК использовали ПЦР-продукт длиной 300 п.н. 50 нг ПЦР-продукта, выделенного из агарозного геля, метили способом случайного праймирования с использованием фрагмента Кленова и oc-32P-dCTP. Процент включения изотопной метки составлял около 50%, удельная активность меченого ПЦР-продукта составляла около 2x109 актов распада в минуту на микрограмм ДНК. Инкубировали при комнатной температуре параллель из 10 полипропиленовых микропробирок (Treff, QSP), в которые вносили 1 нг меченого ПЦР-продукта в 100 мкл деионизованной воды. После инкубации раствор ДНК удаляли, пробирки наполняли жидким сцинтиллятором и считали количество радиоактивной метки, связавшейся за время инкубации с внутренними поверхностями пробирок. Среднее количество ДНК, связываемое при исследованных условиях, составило незначительную величину (порядка 0.005±100% нг). Таким образом, использованный в работе пластик в условиях опыта фактически не связывал следовые количества ДНК. ПЦР-амплификация древней ДНК ПЦР проводили под слоем минерального масла, в объеме 50 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Трис-HCl (рН 8.3), 17 мМ сульфата аммония, 0.01% (w/v) Tween-20, 2.5 мМ хлорида магния, по 0.2 мМ каждого dNTP (дезоксирибонуклеотидтрифосфатов), по 5 пмоль каждого из праймеров, 5 мкл препарата древней ДНК и 2.5 ед. ДНК-полимеразы Taq (ЗАО Синтол), свободной от ДНК. Для проведения ПЦР использовали амплификатор ДНК МС2 (ДНК-Технология). Режим термоциклирования для всех использованных систем праймеров подбирали экспериментально. Проводили 40 циклов ПЦР в режиме: начальная денатурация - 95С, 2 мин; затем в каждом из последующих циклов - денатурация - 94, 30 с; отжиг праймеров, 30 с (праймеры L15989-H16228: 50, L16190-H16410: 56); синтез ДНК (элонгация) - 72, 2 мин. Ввиду ожидаемого высокого уровня деградации ДНК в образцах, была применена система амплификации всего ГВС1 мтДНК из двух перекрывающихся фрагментов, длиной 239 и 220 п.н. Для синтеза первого продукта применяли праймеры L15989 и HI6228, для синтеза второго продукта - L16190 и HI6410. Величина перекрытия фрагментов составляет 38 п.н. Разработанная нами система ПЦР-амплификации позволяет реконструировать полную последовательность ГВСІ мтДНК. Молекулярное типирование пола Для выявления наличия в палеоматериале ДНК половой хромосомы Y была применена система амплификации короткого фрагмента альфоидного прицентромерного повтора хромосомы Y DYZ1.
Нами была разработана система праймеров, фланкирующая мономер этого микросателлитного повтора (табл. 3). Амплификацию (40 циклов) проводили в режиме: начальная денатурация - 95С, 2 мин.; затем в каждом из последующих циклов - денатурация - 94, 30 с; отжиг праймеров - 60, 30 с; синтез ДНК - 72, 2 мин. После последнего цикла образцы были инкубированы при 72 в течение 6 мин для финального удлинения. Для одновременной амплификации последовательностей ДНК Y и X хромосом была применена ПЦР-система, синтезирующая фрагмент уникального ядерного X-Y гомологичного гена амелогенина. Разработанная нами система ПЦР включает два раунда амплификации. На первом раунде амплифицируется фрагмент гена длиной 212/218 (X/Y) п.н., на втором - длиной 106/112 (X/Y) п.н. В первом раунде использовали праймеры PrD и PrR, температура отжига 60, во втором - BrD и BrR, температура отжига 56 (табл. 4). Проводили 40 циклов ПЦР в режиме: начальная денатурация - 95С, 2 мин.; затем в каждом из последующих циклов - денатурация - 94, 30 с; отжиг праймеров - 57, 30 с; синтез ДНК (элонгация) - 72, 2 мин. При проведении двух раундов амплификации мтДНК первый раунд включал 40 циклов, температура отжига - 58, второй раунд включал 35 циклов, температура отжига - 49. Для амплификации митохондриального гена 12S рРНК на древней ДНК Pseudonovibos spiralis были разработаны специальные системы праймеров. Праймеры на центральную часть гена были разработаны на основе сравнительного анализа консервативных участков этого гена для всех копытных животных, доступных в GeneBank. Используя последовательности ДНК, полученные при секвенировании центральной части гена 12S рРНК, нами были разработаны оригинальные универсальные праймеры на 5 и 3 области этого гена. В результате нескольких амплификации на древней матрице были синтезированы четыре перекрывающихся ПЦР-фрагмента гена 12S рРНК, длиной 150-450 п.н. каждый, перекрывающих совместно около 1000 п.н. последовательности гена. Были разработаны следующие праймеры: mttRNA-Phe389L (5і- ggcactgaaaatgcctagatg-3 ), mtl2SrRNA707H (5 -cctgttagcttgggttaaacg-3 ) (I); mtl2SrRNA670L (5 -cagccaccgcgg[t/c]catac-3 ), mtl2SrRNA860H (5 -ggtatctaatcccagtttg-3 )(II); mtl2SrRNA842L (5 -caaactgggattagatacc-3 ), mtl2SrRNA1015H (5 - ggt[g/a]aggt[t/c]tatcggggttt-3 )(III); mtl2SrRNA985L (5 -ctataatcgataaaccccgata-3 ), mtl2SrRNA1379H (5 -ccaagcacactttccagtatg-3 )(IV). Амплификацию (40 циклов) проводили в режиме: начальная денатурация - 95С, 2 мин.; затем в каждом из последующих циклов -денатурация - 94, 30 с; отжиг праймеров: фрагмент I - 53С, фрагмент II - 53С, фрагмент III - 44С, фрагмент IV - 44С 30 с; синтез ДНК - 72, 2 мин.
Характеристика ДНК древнего населения археологического памятника Березовая Лука (Алтай, эпоха бронзы)
Памятник елунинской археологической культуры Березовая Лука (Алтайский край), датируется III тыс. до н.э. - началом II тыс. до н.э. (ранняя бронза). Радиоуглеродным методом датирования отобранных на этом археологическом комплексе проб получена серия абсолютных показателей, позволившая определить рамки его существования: конец III тыс. до н.э. - 1-я треть II тыс. до н.э. (СОАН-3213, 3753, 3754, 3755, 4150, 4151, 4152 и др.). Стоит заметить, что калиброванные данные удревняют изучаемый объект. Всего при проведении комплексных исследований для разных целей радиоуглеродным методом обработано более 15 образцов. Результаты получены к.г.-м.н. Л.А. Орловой в Лаборатории геологии и палеоклиматологии кайнозоя Института геологии СО РАН. младенцев. Захоронения младенцев столь значительной древности и высокой степени сохранности представляют большую редкость. Условия захоронения и степень сохранности образцов указывали на возможность успешного анализа древней ДНК. Исследованные неглубокие могилы со скелетами младенцев обнаружены по периметру котлована жилища №1, частично разрушенного рекой. Кроме этого найдены кости из других подобных захоронений в разных местах, часть из которых находилась уже в переотложенном виде (материалы находятся в Кабинете антропологии АлтГУ; приводимые антропологические определения сделаны к.и.н. С.С. Тур). Могила №1 была зафиксирована по уровню материка у северо-северо-восточного края котлована жилища №1. Заполнение представляло собой темно-бурую супесь с кальцинированными костями животных. На дне ямы, глубина которой составила всего 10 см (все глубины, указанные при описании могил, брались от 0 - уровень материкового слоя), находился скелет младенца, уложенного в скорченном состоянии на левый бок, головой на северо-восток. Под фрагментами черепа была обнаружена свинцовая серьга. Размеры костей посткраниума младенца (ключицы, бедренной, большеберцовой) и степень развития зубной системы соответствуют возрасту от 2 до 4 месяцев (рис. 8, рис. 9 и далее). Могила №2 была обнаружена неподалеку от юго-восточного края жилища №1. На глубине 8 см находился скелет ребенка. Умерший был положен скорченно, на левый бок, головой в восточную сторону.
Сопроводительные предметы не обнаружены. Скелет младенца (в возрасте 0-3 месяца) оказался довольно хорошей сохранности. Могила №3, располагавшаяся у западного-юго-западного края жилища №1, фиксировалась на зачищенной по материку поверхности. В могиле на глубине около 7 см находился полный скелет умершего ребенка, уложенного скорченно на правый бок, головой на северо-восток. Сопроводительных вещей не было. Посткраниум младенца в возрасте 0-3 месяца был хорошей сохранности. Могила №4 найдена у юго-юго-западного внутреннего края выявленного котлована жилища №1 неподалеку от предыдущего погребального сооружения. Могила зафиксирована в материковом слое. На дне ямы находился скелет ребенка. По всей видимости, умерший был уложен скорченно на левый бок, головой на восток-юго-восток. Под черепом и в районе грудной клетки были найдены скопления угольков. Скелет младенца неполный. Размеры костей посткраниума (ключицы, бедренной, малоберцовой) соответствуют возрасту от 2 до 4 месяцев. Кроме этого, в могиле были найдены кости животных: лошади, овцы, млекопитающих (неопределимые костные остатки — 6 шт.). Кроме описанных выше могил, на исследованной площади поселения и при сборах подъемного материала обнаружены многочисленные разрозненные человеческие кости. У края котлована жилища №2 в разных местах найдены кости ребенка в переотложенном состоянии. В результате был собран неполный скелет младенца в возрасте 0-3 месяца. Эти данные свидетельствовали о наличие разрушенной могилы, получившей обозначение №5. У края жилища №1 также обнаружились отдельные части скелета младенца хорошей сохранности. Размеры костей этого посткраниума (ключицы, бедренной, большеберцовой, малоберцовой) и степень развития зубной системы соответствуют возрасту 0-3 мес. Найденные материалы указывали на наличие разрушенной могилы (№6). Фрагменты костей детского скелета (в возрасте от 0,5 до 1 года) обнаружены в зольнике №3, а также в других местах у постройки №3. Разрозненные части человеческих посткраниумов встречены во многих местах раскопа №1, площадь которого составила около 500 кв.м. Среди них были кости младенцев (в возрасте не старше 1 года), а также подростков и взрослых людей. В качестве биологического материала для выделения ДНК были использованы фрагменты берцовых костей скелетов от 12 индивидуумов, обнаруженных на памятниках Березовая Лука, Айна-Булак-1, Булгартаботы-I, Телеутский Взвоз-I (табл. 9). 6 посткраниумов принадлежало младенцам (в возрасте от 0 до 4 месяцев) и 6 - взрослым людям обоих полов. При использовании системы выделения ДНК, основанной на селективной адсорбции на диатомите, были получены аутентичные препараты древней ДНК для всех индивидуумов. Для пяти индивидуумов, найденных на поселении Березовая Лука (младенцы -образцы №1, 2, 3) и на памятнике Айна-Булак-1 (взрослые - образцы №7 и 8) нами были определены нуклеотидные последовательности ГВСІ мтДНК. Каждый исследованный индивидуум обладает своим уникальным митотипом. Этот факт позволяет исключить возможное предположение археологов о родстве по материнской линии всех исследованных индивидуумов. Митотипы древних обитателей Березовой Луки (табл. 10) были сравнены с наборами последовательностей ГВСІ мтДНК для различных современных популяций -этнических популяций Передней и Средней Азии (N=539) [134], монгол (N=103) [78], этнических популяций Средней Азии (N=205) [21], алтайцев (N=17) [143], кетов и селькупов (N=33) [197], коряков, эвенов, якутов (N=88) [195] и восточных эвенков (N=29) (собств. данные). Митотип 1, найденный у индивидуума 1, не был описан ранее в доступных нам источниках. Однако, характеризующая его комбинация нуклеотидных замен (позиции 16185, 16207, 16223, 16260) была наблюдаема только в монголоидных группах. Данная характерная комбинация замен не встречается у анализированных европейских и переднеазиатских этнических популяций.
Следует отметить, что нуклеотидные замены в указанных выше положениях всегда сцеплены с транзицией в положении 16298. В митотипе 1 эта замена отсутствует. ip& Возможно, что данный митотип представляет провариант распространенного у современных монголоидов сочетания, в случае позднейшего возникновения и распространения замены в положении 16298. Не исключено также, что замена 16298 была утеряна у данного индивидуума вторично, тем более что у другого представителя исследуемой группы (митотип 3) эта замена присутствует. Еще одна замена в положении 16207, характеризующая митотип 1, уникальна и нигде ранее не была обнаружена. В целом, на основе анализа митотипа 1 можно сделать вывод о принадлежности младенца 1 по материнской линии к монголоидной этнической группе. Митотип 2, найденный у индивидуума 2, содержит восемь замен относительно «кембриджской» последовательности. Транзиции 16107, 16147,16150,16227 относятся к уникальным или крайне редким мутациям, отсутствующим в анализированных группах мирового населения. Остающиеся четыре мутации широко встречаются среди различных этнических групп, но частота их встречаемости выше у представителей монголоидной расы. Транзиции 16223, 16290 и 16319 являются тремя из четырех мутаций, характеризующих монголоидную гаплогруппу А [177]. Четвертая характерная мутация (16362), связанная с предыдущими тремя, отсутствует в митотипе 2. Мы можем предположить, что в бронзовом веке существовал вариант монголоидной гаплогруппы А без этой замены, а она появилась и получила распространение в более позднее время. Теоретически возможно и другое объяснение присутствия данного митотипа в группе алтайцев. С одной стороны, гаплогруппа А имеет весьма ограниченное распространение среди современных популяций, населяющих Сибирь [195]. С другой стороны, сцепленные транзиции в позициях 16223 и 16311 достаточно часто встречаются в европеоидных группах, и существует вариант, содержащий замены 16223, 16311 и 16319 (идентифицирован в двух образцах, [134]. Поэтому, хотя европейское происхождение митотипа 2 маловероятно, его нельзя исключить полностью. Следует обратить внимание на очень значительное, применительно к монголоидным группам населения, число нуклеотидных замен в митотипе 2 относительно кембриджской последовательности.
