Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 8
1.1. Феносистематика коринеформной группы бактерий 8
1.2. Геносистематика коринеформной группы бактерий 13
1.2.1. Нуклеотидный состав 13
1.2.2. Размер генома 21
1.2.3. Систематика на основе изучения гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК 24
1.2.4. Систематика на основе изучения структуры РНК 34
ГЛАВА 2. Материалы и методы 39
2.1. Материалы 39
2.1.1. Исследуемые микроорганизмы 39
2.1.2. Реактивы 41
2.2. Методы 42
2.2.1. Культивирование микроорганизмов 42
2.2.2. Выделение ДНК из биомассы 44
2.2.3. Определение нуклеотидного состава . 45
2.2.4. Фрагментирование ДНК 48
2.2.5. Определение размера генома 48
2.2.6. Получение радиоактивномеченых препаратов ДНК 50
2.2.7. Молекулярная ДНК-ДНК гибридизации на фильтрах 54
2.2.8. Определение термостабильности гибридных дуплексов ДНК 55
2.2.9. Молекулярная ДНК-ДНК гибридизация в растворе 56
2.2.10. Математическая обработка результатов экспериментов 56
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований
3.1. Испытание питательной среды и культивирование исследуемых микроорганизмов 59
3.2. Выделение и характеристика препаратов ДНК исследуемых микроорганизмов 62
3.3. Мечение препаратов ДНК радиоактивными изотопами 68
3.4. Нуклеотидный состав ДНК коринеморфных бактерий , 72
3.5. Размер генома коринеморфных бактерий 79
3.6. Определение гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК коринеморфных бактерий 81
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 106
Заключение 125
Выводы 126
Практические предложения 127
Список цитируемой литературы 128
- Нуклеотидный состав
- Культивирование микроорганизмов
- Математическая обработка результатов экспериментов
- Испытание питательной среды и культивирование исследуемых микроорганизмов
Введение к работе
Коринеформные бактерии широко распространены в природе (Го-ЛОВЛЄВД978; Veldkamp, 1970; Keddie, 1978; Goodfellow,Minnikin, 1981; Pitcher, 1983). Группа коринеформных бактерій объединяет как сапрофитные, так и патогенные для животных и растении виды. Интерес к этим микроорганизмам обусловлен прежде всего тем, что среди них имеются возбудители инфекционных заболеваний человека и животных. Кроме того, пристальное внимание отечественных и зарубежных ученых к коринеформным бактериям привлечено наличием среди них, в частности, в роде коринебактерий, отдельных видов, обладающих иммуномодулиругащей активностью (Доклад научной группы ВОЗ, 1978). Систематика представителей коринеформной группы определяется несколькими концепциями и еще далека от совершенства ( Jensen, I952,I966;Yamada,Komagata,1972b; Rogosa et al.,1974;Keddie,1978).
Особенно малосистематизированными остаются морфологически сходные бактерии, изолируемые из крови и органов больных злокачественными образованиями людей, здорового и больного хроническим лимфолейкозом крупного рогатого скота (Крестовникова,1965,1971; Голосова с соавт.,1969,1972; Каган с соавт.,1971; Мартынова с соавт.,1971; Бархударян,1973; Азизов,1974; Jackson, 1954; Seibert et al., 1970, 1972).
Изучение этих микроорганизмов, позволило отнести их к коринеформной группе бактерий (Бархударян,1973; Андреева с соавт., 1981). Однако по данным определения морфологических, тинкториаль-ных и биохимических свойств генетические связи с типичншли корине-бактериями, а также между собой у этих изолятов установлены не были (Андреева с соавт.,1981).
В настоящее время наряду с традиционными методами при систе- матике микроорганизмов обязательно применяются молекулярные характеристики их макромолекул, в первую очередь, нуклеиновых кислот. Теоретической основой использования в систематике молекулярных характеристик служат следующие положения молекулярной биологии: во-первых, информационные молекулы можно рассматривать в качестве молекулярных хронометров, измеряющих не только эволюционные взаимоотношения, но и эволюционные расстояния между организмами; во-вторых, филогенетическая информация "записана" в виде последовательностей в ДНК и РНК; в-третьих, последовательность и число нукле-отидных замен в информационных молекулах отражает историю происхождения и развития организмов (Белозерский,1967; Дуда,1984; Дикерсон,1984).
Представленная работа посвящена определению молекулярных характеристик ДНК группы коринеморфных изолятов для их классификации.
Цели и задачи исследований. Целью наших исследований является определение нуклеотидного состава,молекулярной массы (размера генома), гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК бактерий, выделяемых от здорового и больного хроническим лимфолейкозом крупного рогатого скота, больных злокачественными образованиями людей для использования данных молекулярных характеристик при классификации этих микроорганизмов.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Разработать метод выделения ДНК из коринеморфных изолятов.
Установить нуклеотидный состав ДНК и размер генома микроорганизмов изучаемой группы.
Определить степень подобия нуклеотидных последовательностей ДНК коринеморфных бактерий, изолируемых от животных и человека.
4. Установить на основе молекулярных характеристик ДНК степень сходства и различия представителей этой группы бактерий и нескольких музейных штаммов коринебактерий.
Научная новизна работы. Впервые у значительной группы коринеморфных бактерий, изолированных от здорового и больного хроническим лимфолейкозом крупного рогатого скота, больных злокачественными образованиями людей, определен нуклеотидный состав, молекулярная масса, уровень гомологии нуклеотидных последовательностей их ДНК. Показано значительное отличие по первичной структуре ДНК коринеморфных изолятов от ряда музейных штаммов выбранных видов коринебактерий. Представители исследуемой группы коринеморфных изолятов распределены в несколько подгрупп, в которые отнесены изоляты, имеющие близкие молекулярные характеристики ДНК.
Практическая ценность работы. Проведенные исследования показывают целесообразность использования молекулярных характеристик ДНК для классификации коринеморфных изолятов. Данные по нукле-отидному составу и определению степени гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК могут быть использованы при идентификации морфологических сходных с изученными микроорганизмов. Ускоренный метод выделения ДНК из коринеморфных бактерий вошел в сборник: "Проведение биохимических, иммунокомпетентных клеток, клеточных структур и их компонентов" (Москва, ВАСХНШІ, 1983), Материалы диссертации использованы в методических рекомендациях: "Применив молекулярных характеристик ДНК для идентификации микроорганизмов" (Москва, ВШВ), одобренных секцией "Биология общая и сравнительная патология животных" Отделения ветеринарии ВАСХНИЯ. Разработанная и испытанная питательная среда применяется для культивирования коринеморфных бактерий (Храмова и соавт., в печати).
Апробация результатов исследований. Материалы диссертацион- ной работы доложены на: на конференциях молодых ученых ВИЭВ (Москва, 1983,1984), на I Всесоюзной конференции "Хроматография в Биологии и Медицине" (Москва, 1983J, на Всесоюзной конференции молодых ученых по сельскохозяйственной радиологии (Обнинск,1983), на конференции "Итоги и перспективы внедрения идей и методов биохимии в животноводстве и ветеринарии" - посвященной 60-летию организации А.Н.Бахом лаборатории биохимии сельскохозяйственных животных в ГИЭВе (Москва, 1983), на секции "Биология, общая и сравнительная патология животных" Отделения ветеринарии ВАСХНИП (Москва, 1983), на секции "Биохимия сельскохозяйственных животных" Московского отделения Всесоюзного биохимического общества АН СССР (Москва, 1984), на конференции молодых ученых МГУ (Москва, 1984), на П Всесоюзной конференции по сельскохозяйственной радиологии (Обнинск, 1984).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.
ГМВА І. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ І.І. Феносистематика коринеформной группы бактерий
Первые попытки классификации коринеформных бактерии относятся к 1876 г., когда Lehmann и Neumann по результатам морфологических исследований дифтерийных бкагрії,сформировали род Согу-nebacterium.
Затем сюда же были отнесены морфологически сходные виды, патогенные для человека и животных. Со временем отсутствие строгих границ рода и весомых таксономических критериев при идентификации бактерий привело к накоплению в роде коринебактерій не только паразитических микроорганизмов человека и животных, но и широкого круга сапрофитных форм, изолируемых из почвы, воды и пищевых продуктов; кроме того, сюда вошли фитопатогенные виды бактерий (Clark, 1953; Jensen,1952; Rogoaa et al., 1974; Keddie, 1978; Goodfellow, Minnikin ,1981). По мнению Conn (1947;, гетерогенность рода коринебактерий требовала его разделения как минимум на две части - виды патогенные для животных и виды патогенные для человека. Такая градация оставляла неопределенной не только (и не столько) некоторые сапрофитные виды, но и обширную группу фитопатогенных бактерий ( Gibson, 1953)»
В свою очередь Jensen (1952) предложил следующее решение -объединить виды патогенных для животных и человека под общим названием Corynebacterium sensu stricto , а оставшиеся В Corynebac-terium sensu lato. Им же впервые в научной литературе был применен термин "коринеформный", хотя позднее ( Jensen ,1966) было указано, что это название заимствовано у 0rskov (1923).
Такое деление коринеформных бактерий наряду с морфологичес- - 9 -ними критериями, базировалось и на различиях в среде обитания. Тем не менее зависимость морфологии этих микроорганизмов от клеточного цикла и условий культивирования ( Veldkamp, 1970; Cure, Keddie ,1973), а главное?неопределейность таксономического статуса группы corynebacterium sensu latо f несколько снижала ценность этой классификации (Keddie ,1978).
Другой характеристикой коринеформных бактерий, используемой для таксономии, явилась угловая организация, называемая "Нормами, связанная с расхождением клеток после "щелкающего" деления. Согласно Starr и Kuhn (1962) этот феномен был впервые описан ДЛЯ C.diphteriae Kurth в 1898 Г., НО термин "snapping " -"щелкающее" (Краткий определитель бактерий Берги под ред.Хоулта, 1980) был введен в литературу Hill в 1902 г. Образование V-форм, присущее большинству коринеформных бактерий, не всегда обусловлено расхождением после клеточного деления ( Sguros ,1957; Starr, Kuhn ,I962).Komagata с соавт.(1969) определил "щелкающее" деление, как необходимый признак представителей Corynebac-terium sensu stricto , тогда как у других коринеформных микроорганизмов V-формы могут образовываться путем перегиба - "benging" деление.
В дальнейшем это предположение было подтверждено Yamada и Komagata (1970а), установившие связь между типом деления и составом клеточной стенки коринеформных бактерий.
В 1956 году Kummins, Harris сообщили, что химический состав клеточной стенки Грамм-положительных бактерий может быть использован как таксономический критерий. Несколько позже (Cummins, Harris ,1959; Cummins, 1962,1971) авторы обосновали И развили это предположение применительно к коринеформным бактериям.
В настоящее время химический состав клеточных стенок широко - 10 -применяется для классификации этих микроорганизмов, что нашло
СВОЄ отражение В ряде фундаментальных обзоров ( Yamada, Komagata, 1970а; Keddie, Cure, 1978; Collins et al., 1982).
Исследования антигенного состава клеточных стенок позволили Veldkamp (1970) прийти к выводу о наличии значительного сходства между коринебактериями, мик обактериями и нокардиями. Следует отметить, что аналогичное предположение высказывалось еще Jensen в 1952 г. С 1970 года в литературе для обозначения этих микроорганизмов стал применяться термин "СШ-группа" ( Coxynefcacterium, Mycobacterium, Nocardia )(Barksdale ,1970), получивший В настоящее время широкое распространение. (Fox et al., 1980; Barks-dale, 1981; Danhaive et al., 1982).
Проведенные исследования и сделанные на их выводах таксономические заключения нашли свое отражение в восьмом издании "Определителя бактерий Берги" (1974), где,после упразднения присутствующего в шестом (1948) и в седьмом (1957) изданиях "Определителя" семейства Corynebacteriaceae 7 размещена,так называемая,"Группа коринеформных бактерий" ( Rogosa et al., 1974).
В целом следует сказать, и в восьмом издании "Определителя" широко применяется термин "коринеформный", отражающий морфологическую особенность микроорганизма. Goodfellow , Minnikin (1981) полагают, что это может приводить к накоплению необъективных данных при характеристике Грамм-положительных, неспорообразующих, коротких палочек иррегулярной формы, большей частью аэробного типа дыхания.
Особые затруднения, вследствие ограниченных возможностей фе-нотшшческой классификации коринеформных бактерий, встречались при идентификации вновь выделяемых морфологически сходных микроорганизмов. К числу последних можно отнести бактерии, иногда изолируе- - II - мые от больных проказой людей, отнесенные ранее по результатам биохимических исследований к коринеформной группе бактерий ( Ве-aman et al.,1974).Тем не менее, внутригрупповое распределение изо-лятов оставалось неизвестным. Кроме того, антигенный анализ позволял усомниться в принадлежности изолятов к коринебактериям ( Laub et al., 1978).
Аналогичная ситуация наблюдалась при исследовании обширной группы полиморфных микроорганизмов, выделяемых от больных злокачественными образованиями людей. Причем некоторые из авторов (Крестовникова,1965,1971; Jackson, 1954) относили их к семейству Mycobacteriaceaef другие ( Seibert et al. ,1970,1972) - к коринебактериям, третьи ( Diller ,1962,1970 )-к переходным между ними формам.
В 1973 г. Бархударян охарактеризовал, сходную с описанными выше, группу микроорганизмов, выделяемых от крупного рогатого скота, как условно принадлежащую к семейству Corynebacteriaceae. В дальнейших работах (Гевондян,Бархударян,Карпов,1977,1979) они были названы коринеморфными изолятами. Исследование 72 культур коринеморфных изолятов и морфологически сходных с ними микроорганизмов, выделяемых от больных злокачественными образованиями людей (Андреева и др.,1981), показало принадлежность их к роду коринебактерий. Однако в силу разнообразия биохимических характеристик большинство из культур не было окончательно отнесено к какому-либо определенному виду коринебактерий. Сомнительным оставался вопрос о родственных связах внутри этой группы.
Резюмируя изложенное, МОЖНО СОГЛасиТЬСЯ С Мнением Yamada и Komagata, которые проанализировав клеточное деление (1969), аминокислотный состав клеточных стенок (1970а), нуклеотидный состав ДНК (19706), биохимические и биофизические свойства (1972а),еде- лали заключение о том, что при классификации коринеформных бактерий применяются таксономические критерии весьма различной строгости. Этот факт может указывать на то, что видовые признаки этих бактерий не определены точно, а родовой критерий расширен без достаточных исследований ( Yamada, Komagata, 1972Ъ).
Учитывая приведенные факты, становится очевидным необходимость применения для систематики новых подходов и критериев, позволяющих создать действительно объективную классификацию.
В обзоре книги Goodfellow, Board , написанной по материалам конгресса "Сравнение современных методов классификации и идентификации" ( Book review, 1982), приводится подразделение таксономических критериев, используемых в настоящее время при изучении микроорганизмов. По мнению авторов существуют четыре уровня характеристик, применяемых для классификации. Самый низкий уровень - морфология объекта, далее в порядке возрастания таксономической ценности - анализ клеточных компонентов (пиролитическая хроматография, липидный анализ, состав клеточных стенок и т.п.); электрофорез белков и наконец исследование нуклеиновых кислот. Основными характеристиками нуклеиновых кислот, применяемыми для систематики микроорганизмов, также в порядке возрастания, можно считать: I. Определение нуклеотидного состава как надежный родовой критерий. 2. Размер генома, особенно в сочетании с нуклеотид-ным составом. 3. Определение гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК в различных вариантах.
Наряду с перечисленными характеристиками в последнее время все чаще применяется метод картирования I6Sp-PHK, основным достоинством которого считается возможность установления родства между весьма удаленными друг от друга таксонами.
Исследование нуклеиновых кислот с целью классификации и - ІЗ -идентификации микроорганизмов получило название геносистематики. Краткая характеристика методов и успехов геносистематики в приложении к коринеформной группе бактерий приведена в следующих разделах обзора литературы.
1.2. Геносистематика коринеформной группы бактерий І.2.І. Нуклеотидный состав
Впервые видоспецифичность нуклеотидного состава ДНК на примере микроорганизмов была показана Chargaff (1952). Позднее усилиями советских ученых школы А.Н.Белозерского (Спирин, Белозерский,1956; Спирин с соавт.,1957; Белозерский, Спирин,1962) и параллельно с ними Ли с сотр. ( Lee, Whal, Barbu, 1956) на основании данных исследования первичной структуры ДНК около 80 видов различных бактерий были получены данные, позволяющие сделать вывод о потенциальной возможности использования нуклеотидного состава для систематики микроорганизмов. Вывод базировался на двух основных положениях; вариабильности этого показателя для представителей различных родов бактерий и стабильности - для одного и того же вида. Отношение Г+Ц/А+Т для изученной группы варьировало от 0,35 до 2,7, что соответствовало диапазону суммарного содержания гуанина и цитозина от 26,8 до 74,2, выраженному в молекулярных процентах этих оснований Ыол.% ГЦ состава). В то же время работами Спирина, Белозерского (1956), Lee с сотр.(1956), stuy (1958), Зайцевой (1965) была показана неизменность этого критерия от условий и стадий культивирования.
В ранних исследованиях авторы пытались установить корреляцию между нуклеотидным составом и рядом свойств бактерий ( Lee et al., 1956). Накопленные результаты однако позволяют судить об отсутствии взаимосвязей содержания ГЦ в ДНК и принадлежности бактерий к - 14 -тому или иному крупному кластеру микроорганизмов, будь то аэробы или анаэробы, Грамм-положительные или Грамм-отрицательные бактерии (Куцемакина,19бб; БлохинаДеванова, 1972,1976).
Сравнение фактического материала по нуклеотидному составу ДНК с стенотипическими свойствами позволило Мармуру с сотр. (, Маг-mur et ai.,1963) определить границы применения этого показателя для дифференциации микроорганизмов. Было установлено - идентичность нуклеотидного состава является необходимым, но недостаточным условием действительного генетического родства бактерий. Одним словом, мол.$ ГЦ является "негативным" (Брэдли,Энквист,1977) таксономическим признаком, то есть весомые различия в нуклеотид-ном составе определяют генетическую разнородность микроорганизмов, тогда как подобие в содержании ГЦ пар еще не означает их родства.
С учетом этого ограничения данные, обобщенные в ряде обзоров (Спирин,Белозерский,I95S; БлохинаДеванова, 1972,1976; Marmur et al. , 1963; Hill, 1966; Kolander, Pohl, 1980), дают ВОЗМОЖНОСТЬ заключить, что нуклеотидный состав ДНК - надежный родовой признак.
Кроме абсолютных значении ценную информацию может принести определение колебаний показателей нуклеотидного состава видов того или иного рода. Поскольку существует непосредственная зависимость между специализированностью рода и интервалом ГЦ состава. Виды строго специализированных родов различаются по нуклеотидному составу не более чем на 2%, например, Brucella (Ноуег, McCulough, 1968; Bailive et al., 1973). Менее специализировэнные - на 4-6^, например, Campylobacter (Иренков с соавт.,1981; Veron, Chate-lain,1973; Charleir et al.,1974; Owen et al. ,1981 ;Beland, Trust, 1982); Leptospira - (Ежов, Киктенко, Березов,І975; Артюшин,І98І; Артю-шин с соавт.,1982; Brendle et al. ,1974).Наконец, роды, включающие - 15 -паразитические и сапрофитные виды, такие как Pseudomonas - более чем на 10$ ( Pallroni et al., 1973; Owen et al., 1978,1982). He исключено, что значительная вариабильность нуклеотидного состава обусловлена недостаточно объективной родовой дифференциацией. В этом смысле представляет интерес попытка анализа ГЦ содержания в независимости от традиционного родового деления. На основании данных определения нуклеотидного состава более чем у 7000 штаммов бактерий DeLey (1978) предпринял такую попытку. Им установлено, что, как правило, интервал колебаний содержания ГЦ пар в ДНК не превышает 1% на внутривидовом и 10% на внутриродовом уровнях.
Большую группу методов измерения нуклеотидного состава ДНК можно разделить на две части (Слюсоренко,1972). Первая из них объединяет химические приемы непосредственного установления количественного содержания ГЦ пар в ДНК. В их число входят хроматография гидролизатов ДНК на бумаге, в самых различных модификациях (Ванга-пшнД964; Wyatt, 1955,1957). Простота и надежность этого метода обусловили его широкое распространение особенно в ранних исследованиях нуклеотидного состава. К этой же группе можно отнести хроматографию в тонких слоях различных носителей (Мангольд,1965; Ran-derat, 1962,1965), колоночную хроматографию с применением различных стационарных фаз (Cohn, 1949; Hall, 1962) высокоэффективную жидкостную хроматографию (Каграманова,1980), определение нуклеотидного состава посредством депуринизации (Huang, Rosenberg, 1966) и ряд других реже применяемых способов.
К числу наиболее распространенных физических методов, формирующих вторую часть, можно отнести определения нуклеотидного состава по температуре плавления ДНК ( Marmur, Doty,1962) по плавучей плотности в градиенте хлористого цезия (Мандель,Шильдкраут, Мармур, 1970), по спектру поглощения в ОД М СН3СООН ( DeLey ,1967).
При таких методах определения нуклеотидного состава используются эмпирические формулы, определяющие зависимость содержания ГЦ пар от какого-либо физического явления. В этих случаях требуется высокая эффективность очистки препаратов ДНК (Слюсоренко,1972).
В обзоре Holandei, Pohl (1980) примерно 70-80$ приведенных показателей нуклеотидного состава самых разных бактерий установлено физическим методом, разработанным Marmur, Doty(1962). Такая ситуация сложилась благодаря быстрому развитию лабораторной и, в первую очередь, спектрофотометрической техники, позволяющей во многом автоматизировать процесс определения нуклеотидного состава по температуре плавления ДНК.
Вытеснение химических методов исследования ГЦ состава физическими особенно четко прослеживается на представителях рода коринебактерии. Если в обзоре Блохиной и Левановой (,1972) из более чем 30 результатов по нуклеотидному составу коринебактерии только один ( Hill,1966) определен методом тепловой денатурации Мармура и Доти (остальные бумажной хроматографией), то в обзоре Hoiander и Pohl (1980), напротив, только один показатель из 33 обобщенных за период 1972-1980 годов получен с помощью химического метода ( Mordarski et al., 1977а),тогда как другие большей частью с помощью тепловой денатурации и меньшей частью по плавучей плотности в градиенте хлористого цезия.
К настоящему времени накоплены многочисленные данные по нуклеотидному составу ДНК группы коринеформных бактерий (Барышников
С СОавт.,1982; Tamada, Komogata,1970b; Bouafield,1972; Crorahach, 1972,1974a,1978; Goodfellow, Minnikin,1981; Keddie,Jones, 1981; Suzuki et al.,1981; Pit с her, 1983). Однако значительная вариабиль-ность показателей ГЦ содержания ДНК для ее различных представителей 46-78 мол.$ ГЦ затрудняет частную интерпретацию этого таксоно- - 17 -мического критерия, особенно при характеристике впервые исследуемых коринеформных бактерий. Поэтому мы сочли возможным охарактеризовать этот показатель конкретно для каждого рода, размещенного в данной группе согласно Rogosa et al. (1974), включив сюда на основании соображений, изложенных выше, роды, объединяющие мико-бактерий и нокардий.
Для рода Corynebacterium (см.рис.I) интервал колебаний нук-леотидного состава представлен 48-76 мол.% ГЦ. Причем виды, патогенные для животных и человека, отличаются по этому показателю от фитопатогенных видов. Так, представители первой группы имеют содержание ГЦ пар ДНК порядка 48-64% (Карева,Философова,1966; Кры-
ЛОВа,ЛысенкО,1984; Crombach,1972,1978; DeLey et al.,1978; Barton, Hughens,1980; Barksdale,1981; Suzuki et al.,1981; Pitcher, 1983) представители второй - 65-76%, при подавляющем большинстве в районе 70-73% (Bowie et al.,1972; Starr et al., 1975).
Различия в нуклеотидном составе ДНК типового вида c.diphte-riae ОТ 52,0 М0Л.% ГЦ (Suzuki et al.,1981;Pitcher,1983) ДО 55,0 мол.% ГЦ (Stuart,Welshimer,1974) , по-видимому, обусловлены применением разных методов определения этого критерия. По мнению Crombach (1978), род, обладающий таким диапазоном в показателях ГЦ состава, не может быть гомогенным.
Нуклеотидный состав представителей рода Artrobacter (см. рис.1) ранжируется 59-75 МОЛ.% ГЦ (Skyring, Quadling,1970; Yamada, Komagata,1970b; Bousfield, 1972; Bowie et al., 1972; Crombach, 1972; Suzuki et al., 1981). Однако ТИПОВОЙ ВИД A.globiformis И фенотипически близкие к нему формируют более тесную группу с ГЦ составом порядка 62-70% ( DeSmedt, DeLey,1977;Crombach, 1978).
Нуклеотидный состав видов, входящих в род Brevibacterium (см.рис.1) 46-75 мол.% ГЦ (те же авторы, что и для рода артро-
Коринебактерии "З уш>..яітттчям
Артробаїстерии Бревибактерии Микробактерии Целлюломонады тат?-»*.}*
Микобактерии .ШЖ№Шіш..іш*щі,ш
Нокардий идшш^в^иа »
Мол.% ГЦ
Рис.1. Интервал колебаний ГЦ состава ДНК коринеформной группы бактерий, мик обактерий, нокардий. Линии ниже основного интервала - области наибольшего группирования видов. Линии выше основного интервала - ГЦ состав типовых штаммов. - 19 -бактерий), показывает значительную его гетерогенность. Кроме того, типовой вид в.linens проявляет достаточно широкий интервал содержания ГЦ пар 60-68$ (Yamada, Komagata,1970b; Bowie et al., 1972). Другие авторы ( Skyxing, Quadling,1970; Crombach, 1972; Suzuki et ai.,1981) отмечали более узкое распределение показателя ГЦ состава 61-64$.
При исследовании рода Microbacterium (см.рис.І) Tamada И Komagata (1970в) определили показатель ГЦ для M.lacticum - 69,3$, В ТО время как Collins-Thompson с соавт.(1972) - 62,9$, a De Smedt и DeLey (1977) - 64,1$. В обзоре Hollander и Pohl ДЛЯ штамма M.lacticum АТСС 8180 указана величина - 70,0 мол.$ ГЦ. Goodfellow и Kinnikin (1981) приводят для представителей этого рода показатель - 73,0 мол.$ ГЦ.
Такая вариабильность признака могла бы определять гетерогенность рода, если бы не ограниченное количество исследуемых объектов.
На основании данных по нуклеотидному составу M.fiavum определенных Bousfield (1972) и Collins-Thompson С сотр.(1972) как 56-58 мол.$ ГЦ, Jones (1975) внесла предложение о переименовании Microbacterium flavum В Corynebacterium flavum.
Нуклеотидный состав M.thermosphactum - 36 МОЛ.$ ГЦ ( Collins-Thompson et al.,1972) показывает, что этот вид резко отличается от представителей рода, sneath и Jones (1976) отнесли его в качестве типового и единственного вида в новый род Prohotrix. По их мнению этот род должен быть помещен в семейство Lacto-bacillaceae.
По нуклеотидному составу род Celluiomonas (рис.1) строго гомологичен 72-73 МОЛ.$ ГЦ ( Yamada, Komagata,1970b).Crombach (1978) определил более широкий интервал колебаний ГЦ содержания - 20 -в данном роде 63-75%, отметив, что большинство видов группируются около показателя - 72 мол.% ГЦ. Такое утверждение в основном не противоречит данным 71-75 мол.% ГЦ, приведенным для целлюломонау Keddie, Jones (1981).
В доступной литературе нами не обнаружено сведений по нуклео-тидному составу рода Kurthia.
Содержание Г + Ц в ДНК микобактерий 60-73 мол.% (Брудная с соавт.,1980; Wayne,Gross, 1968; Hill et al.,1972; Baess,Mansa, 1978). Imaeda et al. (1982a)(см.рис.I) приводят нижний предел для представителей этого рода равным 55,8 мол.% ГЦ, a Holander и Pohl (1980) со ссылкой на прежние исследования устанавливают верхний предел - 78,0 мол.% ГЦ. СготЪасп (1978), основываясь на работе Wayne и Gross (1968), предположил бимодальность распределения показателя нуклеотидного состава среди микобактерий. Род представлен двумя группами, куда вошло подавляющее большинство микобактерий, с интервалами ГЦ - содержания 64,1-66,1% и 66,7-70,0%.
Приведенный в обзоре Блохиной и Левановой (1972) интервал колебаний нуклеотидного состава типового вида м.tuberculosis 62,7-70,3 мол.% ГЦ обусловлен, скорее всего, применением различных методов определения этого показателя. Действительно, Holander и Pohl (1980) указывают для этого вида данные 66,2-66,4 мол.% ГЦ, полученные методом Мармура и Доти.
Исследования ряда авторов ( Irgens, 1977; Mordarski et al., 1976,1977a,1977Ъ; Tille et al., 1978; Goodfellow, Minnikin,198l) показали, что нуклеотидный состав рода No-cardia (рис.I) распределен от 62,0 до 72,0 мол.% ГЦ. На основании данных по нуклеотидному составу McClung (1974) разделил но-кардии на 3 группы с интервалами 61-63, 66-68 и 68-72 мол.% ГЦ. Такое деление, по его мнению, в общем коррелирует с морфологичес- кими признаками представителей этих групп. Примечательно, что некоторые штаммы, принадлежащие к одному виду, различаются на 5-6$ по содержанию Г + Ц (Hill, 1966). Типовой штамм N.farcinica различается по этому показателю примерно на 2% - 68-70 мол.% ГЦ (Hill, 1966; Holander, Pohl, 1980).
В заключение следует отметить, что применение такого достаточно общего таксономического критерия как нуклеотидный состав позволяет в некоторых случаях не только совершенствовать существующую классификацию коринеформной группы бактерий ( Pit с her, 1983), но и успешно идентифицировать вновь выделенные из различных источников микроорганизмы, на основе предварительных исследований условно относимые к данной группе ( Danhaive et al., 1982; Coci-to, Poliville, 1983).
Тем не менее, учитывая "негативность" нуклеотидного состава, как систематической характеристики, более объективными, по нашему мнению, следует считать комплексные исследования содержания ГЦ пар ДНК и размера генома изучаемых микроорганизмов.
1.2.2. Размер генома
Размер генома - общая молекулярная масса хромосмной ДНК -является второй генеральной характеристикой, применяемой с целью классификации микроорганизмов. Бактериальный геном в основном состоит из уникальных последовательностей ( Britten, Kohne, 1968). Следовательно родственные микроорганизмы, обладающие одинаковым объемом наследственной информации должны иметь близкий размер генома.
Это теоретическое предположение было подтверждено работой Gilles и сотрудников (1970), установившими, что колебания размеров геномов, как правило, не превышало 10-15% у представителей одногс - 22 -рода. Ими же было установлено, что бактерии с ограниченными ферментативными свойствами обладают достоверно меньшими показателями молекулярной массы их ДНК,по сравнению с более высокоорганизованными микроорганизмами. Herdman с сотрудниками (.1979) на примере изученной ими группы из более чем 100 штаммов цианобактерий, показали наличие четырех дискретных кластеров, формирующихся по величинам размера генома. Причем увеличение среднего значения молекулярной массы ДНК от кластера к кластеру коррелировало с морфологическим усложнением цианобактерий.
Таким образом, обе эти работы явились фактическим подтверждением гипотезы об увеличении количества ДНК в расчете на гаплоидный геном в процессе эволюции микроорганизмов от простых к более сложным ( McCarthy, 1965). Непосредственная зависимость размера генома от эволюции бактерий в свою очередь позволяет считать его объективным таксономическим критерием, а следовательно успешно применять, как для уточнения существующих систем, так и для идентификации и типирования вновь выделяемых микроорганизмов.
Для определения размера бактериального генома был предложен ряд разнообразных методических приемов, к числу которых можно отнести химический и авторадиографический методы, седиментационный анализ, методы, основанные на определении вязкости и светорассеяния растворов ДНК (Эйнгер,1970). Из-за трудоемкости и сложности выполнения их применение в настоящее время ограничено. На наш взгляд, особого внимания заслуживает весьма простой и точный, а главноеfдостаточно быстрый подход,основанный на определении размера генома по кинетике ренатурации ДНК. Метод был разработан Britten и KohneB 1968 году. Gilles с сотрудниками (1970) развили его и предложили в двух модификациях. Сущность метода заключается в совместной ренатурации денатурированных ДНК из разных источников. Поскольку этот процесс подчиняется кинетике реакции второго порядка, можно рассчитать константу скорости реакции, как отношение скорости к квадрату концентрации ДНК. Имея микроорганизм с известным размером генома и учитывая тот факт, что константа реакции ренатурации определяется, в конечном счете, молекулярной массой ДНК, легко вычислить размер генома, проводя последовательную ренатурацию реперного и определяемого микроорганизмов.
Впоследствии,авторами по результатам изучения кинетики ренатурации у микроорганизмов с различным нуклеотидным составом была определена зависимость между ГЦ содержанием в ДНК исследуемых бактерий, их размером генома и константой реакции образования двойной спирали. Полученная ими формула (приведена в соответствующем разделе) позволяет устанавливать молекулярную массу ДНК, обходясь без реперных микроорганизмов.
В настоящее время применение такого метода нашло широкое отражение в таксономии самых разнообразных групп бактерий (Артюшин, 1981; АртюшинДиктенко,Ежов,Лысенко,1982; Baess, Mansa, 1978; Jim et al., 1983).
Результаты исследований размеров геномов представителей ко-ринеформной группы бактерий в современной научной литературе представлены единичными работами. По данным Ашмарин с соавт.(1972), Gilles et al.(1970), Barksdale (1981) размеры геномов предста- q вителей рода коринебактерий соответствуют 2,0-2,8.:10 дальтон.
9 Для артробактерий характерен интервал 1,7-3,6»10 дальтон с большинством видов группирующихся около 2,0»10 дальтон, а для бреви-
9 бактерий-1,6-2,0-10 дальтон согласно СготЪасЬ (1978).
Им же установлено, что не дифференцированные коринеформные бактерии, выделяемые из сыра имеют значение этого таксономическо- го показателя I,6-2,3«10 дальтон.
Прослеживающееся перекрывание диапазонов колебаний величин размеров геномов различных представителей коринеформной группы бактерий, а главное недостаточное количество объектов исследования данной характеристики ДНК, ограничивает, на наш взгляд, успеш-ное ее применение в качестве таксономического критерия для микроорганизмов этой группы.
Несколько иное положение можно наблюдать у микобактерий. По данным ряда авторов (Ашмарин и соавт.,1972; Bradly et al., 1973; Baess, Mansa, 1978; Barksdale, 1981; Imaeda et al.,1982a,Ъ) q размер генома микобактерий заключается в интервале 1,3-4,7*10 дальтон с подавляющим большинством, расположенным в районе 2,5-
3,5.10 дальтон. Эти результаты позволяют высказать два предположения: I. Весьма широкий интервал величин содержания ДНК свидетельствует о значительной гетерогенности рода Mycobacterium (СготЪасп, 1978). 2. Несколько более высокие значения этого таксономического показателя у микобактерий по сравнению с коринебактериями определяют, по-видимому, большую эволюционную организованность первых, Imaeda с сотрудниками (1982а,в) на основании данных по нукле-отидному составу и размеру генома предположили, а затем в реакции ДНК-ДНК гибридизации подтвердили ограниченность родственных связей м. leprae с другими микобактериями. Эта работа явилась замечательным подтверждением исследований, проведенных отечественными учеными (Ашмарин,1979; Ашмарин с соавт.,1972), установившими эффективность систематики микроорганизмов по данным совместного определения нуклеотидного состава и размера генома. Ашмарин и соавт.(1972) отмечали, что характер распределения бактерий по данным двух этих критериев может нести дополнительную ценную таксономическую информацию. Авторы показали, что более тесно группируются виды, близкие - 25 -в систематическом отношении и области группирования тем уже, чем ниже ранг таксономического подразделения.
Несомненно, что совместное использование нуклеотидного состава и размера генома с накоплением данных позволит более широко применять их при классификации представителей коринеформной группы бактерий.
Тем не менее,на данном этапе,определение размера генома в целях систематики позволяет сделать лишь предварительные заключения о степени родства коринеформных бактерий.
Наиболее информативным в этом смысле может явиться сравнение степени подобия нуклеотидных последовательностей методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот.
1.2.3. Систематика на основе изучения гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК
Теоретической предпосылкой к установлению родства микроорганизмов по степени подобия первичной структуры ДНК является тот факт, что их эволюционное развитиеfсопровождаемое изменением фенотипа, в конечном счете,определяется изменением линейной нуклео-тидной последовательности ДНК.
В настоящее время непосредственное определение полной последовательности оснований в бактериальной ДНК представляет технически очень сложную задачу. Однако это методическое затруднение можно обойти, используя способность комплементарных цепей ДНК к реассоциации.
Впервые такой подход был реализован Schildtoaut с сотр. Ц96І). Исследователи реассоциировали в растворе фрагментировэнную одноцепочечнуго ДНК, меченую тяжелым изотопом с аналогично подготовленной, но не меченой ДНК из разных источников. Гибридные мо- - 26 -лекулы фиксировали по плавучей плотности при центрифугировании в градиенте хлористого цезия. Позже ( Marmur et al.,1963) подобный прием был использован для реакции ДНК-РЖ гибридизации. Исследования образуемых между меченой радиоактивной ДНК и одноцепочной ДНК комплексов предприняли Hygaard и Hall (1963). Базовой предпосылкой этой работы явился тот факт, что РНК-ДНК гибридный комплекс фиксируется на нитроцеллюлозных фильтрах, тогда как свободная РНК на них не фиксируется.
Методы гибридизации в растворе получили широкое признание после того, как была разработана хроматография на гидроксиапати-те, позволяющая отделить гетеродуплексы от непрореагировавших од-ноцепочных нуклеиновых кислот ( Bernard!, 1965; Kohne, 1968).
Сущность метода заключается в том, что в фосфатном буфере пониженной молярности двухнитчатые молекулы нуклеиновых кислот связываются с ГАП, а одноцепочечные - нет. Связавшиеся молекулы можно количественно элюировать с ГАП, применяя тот же буфер повышенной молярности.
Несколько иное развитие гибридизация ДНК нашла в экспериментах McCarthy,Bolton (1963), позволивших установить количественные характеристики эффективности реассоциации благодаря использованию метода агаровых колонок, разработанного этими авторами ранее (1962). Они предложили проводить реассоциацию одноцепочечной ДНК, вплавленной в агар, с одноцепочечной меченой ДНК из другого источника. После инкубации гетеродуплексы отмываются от непрореагировавших компонентов. Учет уровня гибридизации проводится разрушением реассоциатов повышением температуры, с последующим измерением выхода метки.
Однако наибольшее распространение определение гомологии нук-леотидных последовательностей ДНК в целях систематики получило - 27 -после предложения Gillespie,Spiegelman (1965) собственного методического приема. Особенностью метода являлось использование в качестве носителя вместо агарового геля нитроцеллюлозных фильтров. Фильтры с иммобилизировэнной на них одноцепочечной ДНК помещаются в инкубационную смесь, содержащую радиоактивные фрагменты ДНК или РНК другого источника. После инкубации фильтры отмываются, сушатся и помещаются в сцинтилляционную жидкость для определения уровня гибридизации.
Б дальнейшем данный метод претерпел ряд модификаций ( Den-hardt,1966; Legualt-Demare, 1967; Gillespie, Gillespie, 1971).
Описанные выше методы наряду с видимыми достоинствами не лишены, к сожалению, некоторых недостатков. К числу последних можно отнести в одних случаях чрезвычайно строгое соблюдение условий реакций, в других необходимость наличия меченых бактериальных препаратов ДНК, что само по себе представляет серьезную методическую сложность. Техническая сторона выполнения приведенных методов и зависимость их применения от конкретной ситуации подробно обсуждаются в ряде обзоров (Петров,1980; Вальехо-Роман,1980; DeLey et al., 1970).
В 1970 г. DeLey с соавт. разработали метод спектрофотомет-рического определения подобий нуклеотидных последовательностей, основанный на измерении начальных скоростей ренатурации, предварительно денатурированных фрагментов ДНК микроорганизмов. Скорость ренатурации устанавливают спектрофотометрически по уменьшению поглощения сначала ДНК двух исследуемых микроорганизмов, а затем -их смеси. Процент гомологщопределягот по приведенной авторами формуле. Несмотря на некоторые ограничения, спектрофотометрический метод определения подобий нуклеотидных последовательностей подкупает быстротой выполнения, а главное - возможностью исключить - 28 -процедуру получения меченых препаратов ДНК.
В результате гибридизации бактериальной ДНК из двух различных источников не всегда могут образовываться строгокомплиментар-ные гетеродуплексы, что приводит к уменьшению термостабильности последних. Таким образом, изменение термостабильности гибридных молекул может скорректировать результаты реакции гибридизации. Определение термостабильности проводят элюцией фрагментов меченой ДНК в зависимости от применяемого метода, либо с ГАП С Brenner et al.,1969),либо с нитроцеллголозных фильтров (Медников,Ахудов,1975) буферным раствором с возрастающей температурой.
Термостабильность в этом случае выражается какЛТэл (разность температур, при которых элюируется 50% связавшейся метки, гомологичного и гетерологичного дуплексов). Элюирование меченых фрагментов обусловлено плавлением гибридных ДНК иЛТэл в этом смысле соответствует температуре плавления (Тпл). Понижение ее величин на 1 соответствует, по данным Laird et al.(1969), наличию 1,5$ неспаренных оснований. По более поздним данным ( Ullman, McCarthy, 1973; СготЪаса, 1974с) - I %.
По мнению ряда авторов (Медников, Турова,1978; Шубина,1980), показательАТэл пригоден лишь в тех случаях, когда распределение гибридных дуплексов по показателям температуры соответствует нормальному, а дисперсии гомологичной и гетеро логичной реакций близки.
Если профиль плавления гибридных молекул не соответствует нормальному, Медников,Турова (1978) предлагают проводить анализ по показателю дивергенции, выведенному ими.
Эффективность спаривания гибридных молекул ДНК можно измерить несколько иным путем. Если проводить реассоциацию одноцепочечных ДНК при температуре более высокой, чем оптимальная, то стабильность полученных гетеродуплексов будет приближаться к стабильно- - 29 -сти гомологичных реассоциатов. Но абсолютное число связей при этом уменьшится (Brenner, cowie, I9S8). По-видимому, такой феномен обусловлен тем, что при высокой температуре ренатурируют только точно комплементарные последовательности, а при более низкой - кроме них и лишь частично комплементарные. Процентное выражение отношений гибридизаций при оптимальной и повышенной температурах может служить мерой дивергенции геномов (Элквист,Бредли,1977).
Количественная оценка определения степени схожести нуклеотид-ных последовательностей ДНК с целью классификации различных групп микроорганизмов затруднена исторически сложившейся неравноценностью таксонов. Так, DeLey (I9S9), Brenner et al. (1969,1971,1974), Brenner (1973), устанавливают внутриродовой уровень гомологии равный 70-90$ для семейства Enterobacteriaceae.
Изучение генотипического родства у других групп микроорганизмов показало несколько иные распределения значений степени гомологии нуклеотидных последовательностей.
Уровень гомологии порядка 56-78$ позволил Примаковой с соавт. (1983) отнести исследуемые объекты психрофильных светящихся бактерий к разным видам одного рода.
На основании изучения значительного числа исследований Мед-никовым и Левановой (1974) была предпринята попытка распределения степеней гомологии ДНК в независимости от традиционных таксономических схем. Авторы пришли к заключению о полимодельноети распределения частот встречаемости уровней гомологии. Ими были отмечены две нетрансгрессирующие области - 0-60$ и 60-10$. Каждая из областей делится на три частично перекрывающиеся подобласти 100-90$, 100-70$, 90-60$, 60-40$, 50-0$, 25-0$. Подобласти 100-70$ и 23-0$ -доминирующие. По мнению авторов, они соответствуют в первом случае - внутривидовым и во втором случае - межродовым связям между - so - организмами.
В работах Baess с соавт. (1978,1982,1983), посвященных классификации микобактерий указывается, что при определении уровня гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК, характерных для одного вида следует учитывать, также данные феносистематики.
Результаты исследования гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК представителей коринеформной группы бактерии освещены в весьма ограниченном круге работ. По охваченному материалу наиболее крупным является исследование японских ученых Suzuki,Капеко и Komagata (1981). Базируясь на предложенном Yamada,Komogata (1972в) делении коринеформных микроорганизмов на несколько групп по результатам хематаксономии и нуклеотидного состава их ДНК, авторы испытали в реакции ДНК-ДНК гибридизации S3 штамма, принадлежащих к различным группам по Ямада и Комагата. Следует отметить, что в определении гомологии ДНК этих 33 штаммов использовано II реперных ДНК - это является убедительным доказательством высокой информативности полученных данных.
Авторами показано, что в группе, включающей в основном кори-небактерии, наблюдается четкое подразделение на два кластера с уровнем гомологии 80-100$. Первый из них образован представителями видов C.equi, c.hoagii, c.fascians. За исключением фитопа-тогенного c.fascians остальные виды этого кластера изолированны из животных источников. Высокий процент гомологии в сочетании с узким интервалом колебания ГЦ состава (64,6-67,8 мол.$ ГЦ) ( Yamada,Komogata,1970t}) и схожести фенотипических признаков ( Komura et al.,1975; Uchida,Aida,1979) позволили авторам доказать весьма близкие генетические отношения между данными видами. Что касается фитопатогенного c.fascians, то здесь уместно обратиться к исследованиям Starr с сотр. (1975). Ими был определен - ЗІ -уровень гомологии для фитопатогенных видов коринебактерий равный 20-40$, в то время как c.fascians проявлял абсолютное отсутствие родственных связей (<5$) с изучаемой группой бактерий. Этот факт является прямым доказательством результатов, полученных Сузуки с сотрудниками.
Второй гомологичный кластер составили 4 штамма бактерий, продуцирующих глутаминовую кислоту (уровень гомологии - 80-100$).Кроме коринебактерий сюда вошли также и отдельные бревибактерии, между которыми И ранее ( Yamada, Komogatа,1972Ъ) наблюдалось фено-типическое сходство,
В роде артробактерий Suzuki et al. (1981) установили сильно-выраженную гетерогенность видов по гомологиям нуклеотидных последовательностей их ДНК. Гетерогенность рода подчеркивалась также Crombacb. (1974а,1978), показавшим значительное различие между группой штаммов A.globiformis и A.simplex. Автором на основании реакции ДНК-ДНК гибридизации и результатов определения размера генома было установлено достоверное отличие одного из штаммов A.globiformis от изученных им микроорганизмов.
Дальнейшим развитием таксономии артробактерий явилась работа stackebrandt,Fiedler (1979,). Ими было показано, что уровень гомологии нуклеотидных последовательностей 17 штаммов артробактерий, принадлежащих к II видам колеблется в очень широких пределах. Тем более, что типовой вид рода A.globiformis проявил схожесть ДНК у отдельных своих штаммов всего лишь в 30$, в то время как представители вида A.simplex оказались весьма гомогенными (уровень гомологии 70-100$). Высокий процент гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК с комплексом A.citreux (70$) проявил штамм бревибактерии вида B.protophormiae (Stackebrandt, Fiedler, 1979). В то же время Suzuki et ai.(I98I) отмечали проявление генетичес- - 32 -ких связей в.linens (30-50$) к группе, образованной представителями рода Коринебактерий. Между штаммами этого вида СготЪасп (1978) и Suzuki et al.(I98I) выявили гомологию ДНК порядка 70-100$, что позволяет сделать вывод о высокой гомогенности типового вида рода бревибактерий.
Достаточно гомогенным (70-100$ гомологии нуклеотидных последовательностей) представляется род целлюломонад ( stackebrandt, Fiedler,1979). Suzuki et al. (1981) подчеркнули, что относительно низкая гомология ДНК целлюломонад с ДНК других коринеформных бактерий, четко ограничивает их род.
Таким образом, на примере изложенных фактов можно убедиться, что определение гомологии нуклеотидных последовательностей зачастую успешно разрешает ряд систематических задач как на уровне родов, так и видов одного рода. Однако применение этой методики позволяет проводить таксономические исследования и на внутривидовом уровне.
В этом смысле, по нашему мнению, особый интерес представляет работа Крыловой и Лысенко (1984), посвященная изучению уровня гомологии ДНК различных культиваров c.diphteriae. Предпосылкой для такого рода исследований явилось предположение авторов (Крылова, Водорацкая,1983) о существовании 3 групп внутри культивара c.diph-teriae v.gravis. Согласно авторам, сформированные по фенотипичес-ким признакам эти 3 группы оказались однородными и по структуре геномов. Во всех случаях гомология ДНК представителей внутри каждой из групп определялась в пределах от 89 до 102$, более того, идентичными были токсигенные возбудители и их нетоксигенные аналоги.
В то же время наблюдались различия в организации геномов между различными группами. Во всех случаях гомология хромосомной ДНК - S3 -штаммов I, П и Ш групп заключалась в интервале 64-81$ при более высоком проценте ложноспаренных оснований, чем внутри каждой из групп.
Такие различия в сочетании с делением на группы по 20 фено-типическим признакам позволили авторам обособить каждую из них как генетически близкие друг другу, но различные виды коринебактерій.
По данным молекулярной гибридизации ДНК Крыловой и Лысенко были выявлены различия в гомологии ДНК порядка 40-60$ между представителями культивара gravis с одной стороны, и культиваров mitis и intermedins с другой. Это, по мнению авторов, отражает внутриродовое родство.
Еще большие различия обнаружены в структуре ДНК между C.diph teriae v.gravis И C.ulcerans (уровень ГОМОЛОГИИ 10-15$), ЧТО позволило авторам заключить - c.ulcerans не может считаться под видом c.diphteriae, как это указано в "Определителе бактерий" Bergey (1974).
Таким образом, в результате проведенных исследований методом молекулярной гибридизации ДНК было показано, что внутри единого по традиционной классификации вида c.diphteriae выявлено 5 видов, в число которых вошли штаммы І, П и III группы культивара gravis, а также культиваров mitis и intermedins.Кроме того, доказана генетическая разнородность на уровне разных родов между этими видами и c.ulcerans (Крылова, Лысенко,1984).
Определение гомологии посредством молекулярной гибридизации ДНК способствует не только уточнению существующих таксономических схем, но и успешной идентификации вновь выделенных микроорганизмов. К числу таких исследований можно отнести работы Cromhach (1974а,1978), изучавшему генетические связи группы не дифференцированных оранжевых коринеформных бактерий, изолируемых из пищевых - 34 -продуктов. Автором показано, что большинство исследованных микроорганизмов, выделенных из сыра, проявляет высокий уровень гомологии ДНК (74-86$) с ДНК в.linens взятого в качестве репера.
Оранжевые коринеформные бактерии, изолируемые из морской рыбы в реакции ДНК-ДНК гибридизации с тем же репером образовали три группы с различными уровнями гомологии (77-90$, 46-69$, 19-26$ соответственно . Несмотря на то, что низкий процент гомологии не позволяет однозначно утверждать гомогенность группы, Crombach (1978) определяет генетическую однородность представителей каждой из групп, опираясь на морфологические исследования (СготЪаса,1974Ъ).
Исследованию уникальной группы микроорганизмов, иногда выделяемых ОТ больных лепрой посвящена работа Danhaive et al. , 1982. В настоящее время убедительно доказана принадлежность этих изоля-тов к роду коринебактерий (Cocito, Deliveile, 1983). Однако таксономический статус внутри группы не был определен. Методом молекулярной гибридизации ДНК Danhaive с сотр.(1982) удалось обособить среди представителей этой группы несколько кластеров видового уровня. В то же время ими была доказана уникальность этих бактерий, поскольку взятые в эксперимент референтные штаммы коринебактерий не проявили сколько-нибудь значительной гомологии с ДНК реперного штамма, выбранного из группы изолируемых от лепроз-ных больных микроорганизмов.
В заключение этого раздела следует подчеркнуть, что метод ДНК-ДНК гибридизации особенно эффективен при таксономических исследованиях на внутриродовом уровне. Именно установление гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК от 70 до 100$ из анализа данных литературы, наиболее часто употребляется для характеристики штаммов одного вида, а интервал в 30-60$ - видов одного рода. Более низкий процент гомологии, хотя и используется для количествен- - 35 -ной оценки родства бактерий, тем не менее не позволяет уверенно систематизировать таксоны более высокого, чем родовой, ранга. Поэтому для более достоверного установления родства удаленных генетически групп микроорганизмов применяется анализ дивергенции нук-леотидных последовательностей не всего генома, а тех его участков, эволюционная вариабильность которых весьма незначительна.
1.2.4. Систематика на основе изучения структуры РНК
К слабовариабильным участкам генома можно отнести цистрон рибосомальной РНК (р-РНК). Нуклеотидный состав р-РНК составляет около 54$ и мало дивергирован у различных микроорганизмов, кроме того, он не зависит от содержания ГЦ пар в молекуле ДНК (мооге, 1974). Такая стабильность обусловливается большей консервативностью рибосомального цистрона по сравнению с нуклеотидной последовательностью тотального генома. Следовательно, этот феномен может быть использован для установления генетического родства таксоно-мически удаленных микроорганизмов.
Способность молекул р-РНК специфически связываться с комплементарными участками ДНК была продемонстрирована Yankofsky, Spie-gelman (І962а,в). В дальнейшем (1963) ими же было установлено, что 16 s и 23 s р-РНК имеют собственные неперекрывающиеся комплементарные сайты ДНК.
На примере Bacillus subtilis Doi et ai.(1955) показали, что процент гомологии нуклеотидных последовательностей рибосомального цистрона среди исследуемых микроорганизмов значительно дивергиро-вавших друг от друга был выше, чем при определении подобий в реакции ДНК-ДНК гибридизации.
Однако этот метод не лишен некоторых существенных недостат- -36-ков. В ряде случаев интерпретация результатов сопряжена с определенными трудностями, обусловленными наличием разного количества цистронов р-РНК у сравниваемых микроорганизмов (Moore, 1974). Вследствие этого возможна парадоксальная ситуация, когда связывание в гомологичной реакции меньше, чем в гетерологичной (Moore, McCarthy, 1967).
В последнее время для определения степени родства эволгацион-но удаленных таксонов успешно применяется метод картирования 16 s р-РНК. Изучение первичной структуры высокомолекулярной рибосомаль-ной РНК представляется наиболее подходящим для анализа эволюции прокариот (Турова,1983), поскольку 16 s р-РНК универсально распределена, функционально постоянна и, кроме того, достаточно консервативна, чтобы устанавливать дальние эволюционные взаимосвязи (Прангишвили,1983). Сущность метода заключается в том, что очи-щенную 16s р-РЖ, меченую Р, обрабатывают рибонуклеазой Tj, полученные олигонуклеотиды разделяют в соответствии с их размером и нуклеотидным составом двухмерным электрофорезом. Таким образом, получают каталоги олигонуклеотидных последовательностей. При помощи математической обработки результатов, проведенной для исследуемых организмов, попарно определяют ассоциативный коэффициент s^g, позволяющий в свою очередь интерпретировать данные как дендрограм-му генеологии исследованных объектов. Fox et ai. ,1977,1980 с помощью данного метода, охарактеризовав структуру 16 s р-РЖ у большого количества микроорганизмов заключили, что прокариоты подразделяются на два больших кластера, приравненных ими к царствам: I. Царство истинных бактерий - эубакте-рий. 2. Царство архзбактерий. Кроме того, авторы обособили группу так называемых "уркариотов" - протоэукариотов.
В отличии от эубактерий, включающих в основном классически известные группировки бактерий, царство арх:Сбактерий составили микроорганизмы, занимающие уникальные экологические ниши, такие как, например, метаногены и термоацидофилы.
Коринеформная группа бактерий согласно Fox et al., 1980 находится в блоке с микобактериями и нокардиями, представляет в схематическом распределении прокариот общую актиномицетную линию эубактерий. Более детальное изучение представителей этой линии было предпринято stackebrandt с сотр. (1980,1981,1982). Авторы показали наличие 5 основных кластеров среди исследуемых микроорганизмов. Первый включает,среди прочих,виды артробактерий, целлюло-монад, микробактерий и бревибактерий. Второй - образован A. simplex. В состав третьего входят представители коринебактерий и артробактерий. Четвертый - составлен в основном микобактериями и нокардиями, а также C.fascians.Ibmrii - Stxeptomyces gxiseus.
Коэффициент сходимости этих кластеров s^g = 0,50. К примеру Е. coli имеет Sm с этими кластерами менее 0,30.
Из представленной stackebrandt et al. (1981) дендрограммы можно сделать ряд таксономических заключений, касающихся корине-формной группы бактерий. Во-первых, типовой вид артробактерий A.glofciformis по коэффициенту сходимости более значительно отличается от A.simplex ( Бда = 0,55), чем от типового вида бревибактерий в.linens ( s^g = 0,65). Этот факт подтверждает предположение Crombach (1978) о гетерогенности рода артробактерий. Во-вторых, коринебактерий, микобактерии и нокардии родственны на уровне Бда е 0,60, что несколько выше, чем общая сходимость пяти кластеров. В-третьих, C.diphtexiae как представитель Corynebacte-r ium sensu stricto и C.glytamaticum - Corynebacterium sensu lato имеет такой же коэффициент S^g = 0,65 как типовые виды родов артробактерий и бревибактерий, что подтверждает классификацию - 38 -Jensen (1952) (см.раздел I.I).
Такім образом, метод картирования I6Sp-PHK позволяет успешно совершенствовать таксономию микроорганизмов и, в частности, коринеформной группы бактерий на межродовом и более высоких уров-нях.
Суммируя факты, изложенные в обзоре литературы, можно заключить, что методы геносистематики такие как анализы нуклеотидного состава, гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК, дивергенции отдельных генов, их полной нуклеотидной последовательности, с учетом фенотипических исследований позволяют исследовать родство микроорганизмов на самых различных систематических уровнях.
Базируясь на том, что картирование 16 S р-РНК в основном направлено на установление эволюционного статуса весьма удаленных таксонов, в то время как молекулярная гибридизация ДНК определяет внутриродовой характер связей микроорганизмов, мы решили для выполнения поставленной задачи остановиться на последнем методе для анализа группы коринеморфных бактерий, изолированных из крови больных злокачественными образованиями людей, здорового и больного хроническим лимфолейкозом крупного рогатого скота.
Нуклеотидный состав
Впервые видоспецифичность нуклеотидного состава ДНК на примере микроорганизмов была показана Chargaff (1952). Позднее усилиями советских ученых школы А.Н.Белозерского (Спирин, Белозерский,1956; Спирин с соавт.,1957; Белозерский, Спирин,1962) и параллельно с ними Ли с сотр. ( Lee, Whal, Barbu, 1956) на основании данных исследования первичной структуры ДНК около 80 видов различных бактерий были получены данные, позволяющие сделать вывод о потенциальной возможности использования нуклеотидного состава для систематики микроорганизмов. Вывод базировался на двух основных положениях; вариабильности этого показателя для представителей различных родов бактерий и стабильности - для одного и того же вида. Отношение Г+Ц/А+Т для изученной группы варьировало от 0,35 до 2,7, что соответствовало диапазону суммарного содержания гуанина и цитозина от 26,8 до 74,2, выраженному в молекулярных процентах этих оснований Ыол.% ГЦ состава). В то же время работами Спирина, Белозерского (1956), Lee с сотр.(1956), stuy (1958), Зайцевой (1965) была показана неизменность этого критерия от условий и стадий культивирования.
В ранних исследованиях авторы пытались установить корреляцию между нуклеотидным составом и рядом свойств бактерий ( Lee et al., 1956). Накопленные результаты однако позволяют судить об отсутствии взаимосвязей содержания ГЦ в ДНК и принадлежности бактерий к тому или иному крупному кластеру микроорганизмов, будь то аэробы или анаэробы, Грамм-положительные или Грамм-отрицательные бактерии (Куцемакина,19бб; БлохинаДеванова, 1972,1976).
Сравнение фактического материала по нуклеотидному составу ДНК с стенотипическими свойствами позволило Мармуру с сотр. (, Маг-mur et ai.,1963) определить границы применения этого показателя для дифференциации микроорганизмов. Было установлено - идентичность нуклеотидного состава является необходимым, но недостаточным условием действительного генетического родства бактерий. Одним словом, мол.$ ГЦ является "негативным" (Брэдли,Энквист,1977) таксономическим признаком, то есть весомые различия в нуклеотид-ном составе определяют генетическую разнородность микроорганизмов, тогда как подобие в содержании ГЦ пар еще не означает их родства.
С учетом этого ограничения данные, обобщенные в ряде обзоров (Спирин,Белозерский,I95S; БлохинаДеванова, 1972,1976; Marmur et al. , 1963; Hill, 1966; Kolander, Pohl, 1980), дают ВОЗМОЖНОСТЬ заключить, что нуклеотидный состав ДНК - надежный родовой признак.
Кроме абсолютных значении ценную информацию может принести определение колебаний показателей нуклеотидного состава видов того или иного рода. Поскольку существует непосредственная зависимость между специализированностью рода и интервалом ГЦ состава. Виды строго специализированных родов различаются по нуклеотидному составу не более чем на 2%, например, Brucella (Ноуег, McCulough, 1968; Bailive et al., 1973). Менее специализировэнные - на 4-6 , например, Campylobacter (Иренков с соавт.,1981; Veron, Chate-lain,1973; Charleir et al.,1974; Owen et al. ,1981 ;Beland, Trust, 1982); Leptospira - (Ежов, Киктенко, Березов,І975; Артюшин,І98І; Артю-шин с соавт.,1982; Brendle et al. ,1974).Наконец, роды, включающие паразитические и сапрофитные виды, такие как Pseudomonas - более чем на 10$ ( Pallroni et al., 1973; Owen et al., 1978,1982). He исключено, что значительная вариабильность нуклеотидного состава обусловлена недостаточно объективной родовой дифференциацией. В этом смысле представляет интерес попытка анализа ГЦ содержания в независимости от традиционного родового деления. На основании данных определения нуклеотидного состава более чем у 7000 штаммов бактерий DeLey (1978) предпринял такую попытку. Им установлено, что, как правило, интервал колебаний содержания ГЦ пар в ДНК не превышает 1% на внутривидовом и 10% на внутриродовом уровнях.
Большую группу методов измерения нуклеотидного состава ДНК можно разделить на две части (Слюсоренко,1972). Первая из них объединяет химические приемы непосредственного установления количественного содержания ГЦ пар в ДНК. В их число входят хроматография гидролизатов ДНК на бумаге, в самых различных модификациях (Ванга-пшнД964; Wyatt, 1955,1957). Простота и надежность этого метода обусловили его широкое распространение особенно в ранних исследованиях нуклеотидного состава. К этой же группе можно отнести хроматографию в тонких слоях различных носителей (Мангольд,1965; Ran-derat, 1962,1965), колоночную хроматографию с применением различных стационарных фаз (Cohn, 1949; Hall, 1962) высокоэффективную жидкостную хроматографию (Каграманова,1980), определение нуклеотидного состава посредством депуринизации (Huang, Rosenberg, 1966) и ряд других реже применяемых способов.
К числу наиболее распространенных физических методов, формирующих вторую часть, можно отнести определения нуклеотидного состава по температуре плавления ДНК ( Marmur, Doty,1962) по плавучей плотности в градиенте хлористого цезия (Мандель,Шильдкраут, Мармур, 1970), по спектру поглощения в ОД М СН3СООН ( DeLey ,1967).
При таких методах определения нуклеотидного состава используются эмпирические формулы, определяющие зависимость содержания ГЦ пар от какого-либо физического явления. В этих случаях требуется высокая эффективность очистки препаратов ДНК (Слюсоренко,1972).
В обзоре Holandei, Pohl (1980) примерно 70-80$ приведенных показателей нуклеотидного состава самых разных бактерий установлено физическим методом, разработанным Marmur, Doty(1962). Такая ситуация сложилась благодаря быстрому развитию лабораторной и, в первую очередь, спектрофотометрической техники, позволяющей во многом автоматизировать процесс определения нуклеотидного состава по температуре плавления ДНК.
Вытеснение химических методов исследования ГЦ состава физическими особенно четко прослеживается на представителях рода коринебактерии. Если в обзоре Блохиной и Левановой (,1972) из более чем 30 результатов по нуклеотидному составу коринебактерии только один ( Hill,1966) определен методом тепловой денатурации Мармура и Доти (остальные бумажной хроматографией), то в обзоре Hoiander и Pohl (1980), напротив, только один показатель из 33 обобщенных за период 1972-1980 годов получен с помощью химического метода ( Mordarski et al., 1977а),тогда как другие большей частью с помощью тепловой денатурации и меньшей частью по плавучей плотности в градиенте хлористого цезия.
Культивирование микроорганизмов
В современной научной литературе приводятся два основных метода разрушения клеточной стенки коринеформных и родственных им микроорганизмов с целью последующей экстракции нуклеиновых кислот. Первый из них предполагает ферментативную деградацию клеточной стенки (Блохина,Леванова,197б; Xamada, Komoyata, 1970b; Danhaive et al.,1982), а второй - механическую (Методы общей бактериологии, 1984).
В связи с этим в предварительных экспериментах нами была проверена эффективность применения того и другого метода при выделении ДНК из исследуемых микроорганизмов.
Сущность ферментативного метода заключалась в быстром троекратном замораживании и оттаивании с последующим инкубированием биомассы в течение 14-16 часов с лизоцимом, добавленным в концентрации 100 мкг/мл, а затем 14-16 часов - с 0,5$ DS-Na и 0,2 мг/мл проназы Р.
Во втором случае 3-5 г влажной биомассы ресуспендировали в 10 мл буфера для лизиса и помещали в предварительно охлажденную до -70С стальную ячейку пресса Хьюга. Замороженный образец продавливали через фильеру ячейки с усилием на поршень порядка 200 атм.
Экстракцию нуклеиновых кислот из лизатов, полученных I и П методами, осуществляли придерживаясь, в основном, метода Магтш? (1961), для чего к ним добавляли проназу Р и DS-Na до конечных концентраций 0,5 мг/мл и 0,5$ соответственно. Образовавшуюся смесь инкубировали I час при 37С. Затем к ней добавляли 5 М Nad до конечной концентрации I М и равный объем реактива Севаго (хлороформ/изоамиловый спирт 24/1). Полученную смесь встряхивали 30 мин при комнатной температуре, затем центрифугировали в режиме 2,5 тыс. о,, 15 мин при 4С. Верхнюю водную фазу собирали, промежуточную фазу осторожно промывали 0,1 ССР (I ССР - стандартный солевой раствор - 0,15 М NaCl + 0,015 М цитрат натрия, рН 7,2) и объединяли с верхней фазой. Нуклеиновые кислоты выделяли из раствора добавлением двух объемов охлажденного этанола. Тяж нуклеиновых кислот извлекали пастеровской пипеткой, последовательно промывали в 70$ и 95% этаноле, спирт-эфире, эфире, высушивали и растворяли в 5-Ю мл 0,1 ССР.
Концентрацию ДНК определяли по поглощению растворов при 260 нм, учитывая, что единица оптической плотности соответствует содержанию 50 мкг ДНК в I мл ( Maniatis et al. ,1982).Чистоту препаратов устанавливали по спектру поглощения в области 220-320 нм и по профилю плавления в интервале температур 45-90С. Спектры поглощения измеряли на спектрофотометре "Hitachi ESP" (Япония). Плавление ДНК осуществляли на спектрофотометре " pye Unicam SP 1800" (Великобритания), снабженном термостатируемой ячейкой. В некоторых случаях проводили дополнительную очистку растворов ДНК посредством хроматографии на ГАП или центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия (0стерман,1981). Нуклеотидный состав ДНК типичных коринебактерий и корине-морфных изолятов измеряли с помощью метода тепловой денатурации ( Marmur, Doty, 1962). Вследствие наличия в Щ паре трех водородных связей в отличии от двух таковых в AT паре, ДНК ГЦ типа имеет большую температурную устойчивость по сравнению с ДНК AT типа. Авторы, экспери ментально установили, что для ДНК, выделенной как из про-, так и из эукариотических клеток, наблюдается линейная зависимость мезвду температурной точкой, в которой происходит 50% увеличение опти ческой плотности (Тпл - температура плавления) и молярным содер жанием ГЦ пар. По результатам значительного числа исследований бы ла предложена формула для рассчета нуклеотидного состава по тем пературе плавления: мол.$ ГЦ = (Тпл - 53,9) х 2,44. В нашей работе, для определения ГЦ содержания, концентрацию ДНК доводили до 20 мкг/мл 0,1 ССР. Такая концентрация была выбрана для того, чтобы при возникновении гиперхромного эффекта, вследствие плавления, область оптических плотностей растворов укладывалась в наиболее чувствительный интервал прибора. Кроме того, при таком содержании ДНК практически исключается возможность агрегации Шандел,МармурДЭ70). Растворы ДНК исследуемых бактерий помещали в термостатируе-мые кюветы спектрофотометра " Pye Unicam SP 1800" (Великобритания), снабженные пришлифованными крышками. Плавление осуществляли в интервале 45-90С со скоростью повышения температуры 0,5%ин v при постоянной длине волны я - 260 нм. Профиль плавления - зависимость оптической плотности раствора ДНК от температуры, регистрировали в виде дискретных точек с интервалом в 90 секунд.
Математическая обработка результатов экспериментов
Для иммобилизации ДНК использовали нитроцеллюлозные фильтры фирмы " Shleicher & Shtill" диаметром 120 мм с размерами пор 0,22 микрона, смонтированными в ячейках для ультрафильтрации ФМ02-І000 отечественного производства. Фильтры предварительно инкубировали в 4 ССР 1,5-2 часа при комнатной температуре, а затем, непосредственно в ячейках, промывали 100-200 мл 4 ССР, оценивая степень отмывки фильтров спектрофотометрически.
Раствор ДНК корине- и коринеморфных бактерий в концентрации 50 мкг/мл объемом 20 мл. денатурировали в присутствии 0,5 М NaOH при 55С 10 мин. Денатурированную ДНК разбавляли ледяным 5 ССР,так чтобы концентрация ДНК составляла 10 мкг/мл. Раствор нейтрализовали добавлением эквимолярного количества HCI и приливали в ячейки со смонтированными в них фильтрами. Иммобилизацию ДНК на нитро-целлюлозных фильтрах контролировали спектрофотометрически по разности поглощений растворов до и после фильтрации. Кроме того, точное количество нанесений ДНК устанавливали по методу Спирина (1958), для чего стандартные сегменты фильтров с иммобилизованной на них ДНК инкубировали 20 мин в 3 мл 15$ НСЮ4 при Ю0С. После охлаждения раствора измеряли его оптическую плотность при 270 и 290 нм. Количество ДНК на фильтрах рассчитывали по формуле Беличины оптической плотности при 270 и 290 нм. Степень связывания ДНК с нитроцеллюлозными фильтрами во всех случаях превышала 90$.
По окончании фильтрования растворов ДНК влажные фильтры диаметром 120 мм при помощи специального штампа делили на фильтры диаметром 24 мм, которые сушили в течение ночи при комнатной температуре, а затем 2 ч при 80С в вакууме. Полученные фильтры с нанесенной на них ДНК сохраняли при 4С.
Реакцию ДНК-ДНК гибридизации проводили по модифицированному методу DeLey, DeSmedt (1975)«
Фильтры с иммобилизированной на них ДНК помещали в бюксы, перекладывая капроновыми сетками, с целью равномерного доступа инкубационной смеси.
В состав инкубационной смеси входили: формамид - 50$, 20 ССР 10$, фрагментированная и денатурированная нагреванием при Ю0С в течение 10 мин меченая ДНК в расчете 2-5 тыс.распадов в мин на фильтр. Общий объем инкубационной среды определяли из соотношения 0,7 мл на фильтр. Бюксы помещали в термостат при температуре 48С и инкубировали при 48С двое суток. По окончании реакции фильтры промывали 2 ССР (по 5 мл на фильтр), подогретого до температуры инкубацией сушили на воздухе» Высушенные фильтры раскладывали во флаконы, содержащие 10 мл сцинтиллятора ЖС-І06. Радиоактивность измеряли на счетчике " Mark II" Nuclear-Chicago (США).
Гомологии нуклеотидных последовательностей рассчитывали на программируемом микрокалькуляторе MK-5S, по разработанным нами программам, принимая за 100% связывание фрагментов ДНК в гомологичной реакции ДНК-ДНК гибридизации.
Термостабильность гибридных дуплексов, получаемых в реакции гибридизации меченой однонитевой ДНК,иммобилизированной на нитро-целлголозных фильтрах,оценивали по разности температур элюции ( Л Тэл) гомологичного и гетерологичного дуплексов (Медников,Турова, 1978).
"Посчитанные" на радиоактивность фильтры отмывали толуолом (в расчете по 10 мл на фильтр) от примесей сцинтилляционной жидкости и высушивали в вытяжном шкафу. Сухие фильтры тщательно измельчали и помещали в термостатируемые колонки. Колонки заполняли 2 мл подогретого до температуры элюции 0,1 ССР. Элюцию проводили в течение 5 мин в интервале температур 60-95С. Смыв собирали во флаконы с 3 мл сцинтиллятора, приготовленного смешиванием I л Тритон Х-ЮО, I л ЖС-І06 с добавлением 1,5 г РРО и 150 мг РОРОР.
По радиоактивности образцов, измеренной на счетчике " Mark її" Nuclear-Chicago (США) определяли динамику разрушения дуплексов. Затем, вычислив относительную радиоактивность элюата для каждой температурной точки, получали интегральные профили элюции гибридных дуплексов. Л Тэл определяли графически в сравнении температур элюции гибридных гетерологичных и гомологичного дуплексов.
Реакцию ДНК-ДНК гибридизацию в растворе проводили по несколько модифицированному методу DeLey et al. (1970). Определение гомологии нуклеотидных последовательностей двух объектов по этому методу требовало постановки трех реакций. По двум из них определяли скорости ренатурации двух искомых микроорганизмов так, как описано в разделе "Определение размера генома". Для постановки третьей реакции фрагментированные ультразвуком денатурированные при Ю0С в течение 10 мин ДНК из обоих источников в строго экви-молярных количествах приливали в кювету так, чтобы конечная концентрация составила 50 мкг/мл в 2 ССР. Со смешанным образцом проводили те же манішуляции, что и при первых двух реакциях. % гомо логии нуклеотидных последовательностей определяли по формуле:
Испытание питательной среды и культивирование исследуемых микроорганизмов
Таким образом, можно сделать следующее заключение. Группа ко-ринеморфных изолятов гетерогенна по нуклеотидным последовательностям ДНК, в ней выявляется ряд подгрупп с различной степенью сходства, изоляты крови больных злокачественными образованиями людей проявляют таксономическую близость к коринеморфным бактериям, выделенным от больного крупного рогатого скота.
Последнее положение позволило нам сконцентрировать внимание на микроорганизмах, изолируемых от животных.
На основании данных определения нуклеотидного состава, размера генома, гомологии ДНК очевидно, что бактерии от больных лейкозом животных представлены несколькими обособленными подгруппами. Поэтому для проведения следующей реакции ДНК-ДНК гибридизации были выбраны изоляты 17 и 26, как представители разных подгрупп.
Результаты опыта, обобщенные в таблице 3.14 показывают, что как 17, так и 26 изоляты обосабливают резко очерченные подгруппы. Причем и в том и в другом случае они образованы в основном бактериями, изолированными от больного лейкозом крупного рогатого скота. Графический анализ таксономического положения изолятов, проявивших гомологичность своих ДНК от 40% и выше (см.рис.9) показал наличие относительно дисперсной подгруппы в реакции ДНК-ДНК гибридизации с реперной 26 культурой. В нее вошли 24, 80, 26 изоляты с уровнем гомологии 43-73%. Однако плотность их распределения по нуклеотид-ному составу (58,1-59,5 мол.% ГЦ), общность источников выделения, а главное отсутствие относительного связывания нуклеотидных последовательностей ДНК с ДНК других коринеморфных бактерий позволяет установить генетическую близость между 24, 30 и 26 изолятами.
При исследовании гомологичности фрагментов ДНК исследуемой группы с реперной 17 культурой была подтверждена высокая гомоген ность подгруппы образованной 17, 20, 19, 9, 22, 21 изолятом. Уровень подобий нуклеотидных последовательностей от 70 до 100$,плотность распределения по нуклеотидному составу - 61,0-62,7 мол.$ ГЦ, общность источников выделения (все, кроме 9, изолированы от больного хроническим лимолейкозом крупного рогатого скота) определяют близкородственность этой подгруппы (сплошной треугольник на рис.9). Представители его, в отличие от 24, 30 и 26 изолятов, генетически ближе к целому кругу оставшихся коринеморфных бактерий. Так, культуры 38, 50, а также ранее обособленная подгруппа 51, ЗВА, 18 и 55, имеют с ними достаточно высокий процент гомологии нуклеотидных последовательностей - свыше 50$ (см.рис.9).
Существенные отличия первичной структуры ДНК 26, 30 и 24 изолятов от ДНК других коринеморфных бактерий позволили нам не проводить определение термостабильности гибридных дуплексов. В то же время такой анализ представлял интерес в случае молекулярной гибридизации ДНК 17 изолята.
Распределение коринеморфных бактерий в зависимости от гомологии их ДНК с ДНК 17 культуры и термостабильности гибридных молекул, приведенное на рис.10, отражает графическое исследование интегральных профилей плавления полученных дуплексов. Последние показали, что форма профилей плавления гетерологичных гибридных молекул ДНК в целом соответствовала таковым в случаях гомологичных гибридов, причем наблюдалось практически идеальное соотношение зависимости увеличения АТэл от уменьшения процента гомологии. Комплексный анализ по двум этим параметрам (см.рис.10) подтвердил обсужденное ранее предположение: изоляты 17, 20, 19, 9, образовали весьма плотную подгруппу, к ним же относится несколько отстоящий 21 изолят. Изоляты 51, 18, 55 и в меньшей степени.. ЗВА представляют иную, но родственную первой, подгруппу, что касается изолята ЗВА, то он является наиболее генетически удаленным, по крайней мере, от 17 реперного микроорганизма.
Таким образом, по результатам проведенных экспериментов было выделено три подгруппы среди коринеморфных бактерий. В их состав вошли как изоляты от людей, так и изоляты от леикозного скота. Однако микроорганизмы, выделенные от здоровых животных, не проявили высокого процента гомологии нуклеотидных последовательностей ни с одним из реперных изолятов. Кроме того, культура 31, выделяемая от леикозного крупного рогатого скота, так же не могла быть охарактеризована, поскольку наибольший процент относительного связывания ее ДНК с ДНК реперных изолятов составил 22$ (см. таблицу 3.14).
