Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1.Физико-химическая характеристика липополисахаридов грамотрицательных бактерий 9
1.1.1. О-специфическая цепь (О-антиген) 10
1.1.2. Состав и структура кора 10
1.1.3. ЛипидА 11
1.1.4. Конформация мономеров эндотоксинов 14
1.1.5. Роль температуры, катионов и рН среды в В <-> а фазовом переходе липида А 16
1.2. Химический состав и заряд мембраны эритроцитов 19
1.2.1. Молекулярная организация мембраны эритроцитов человека 20
1.2.2. Заряд поверхности эритроцитов 24
1.3. Роль белков, фосфолипидов мембраны и заряда поверхности клетки при взаимодействии с ЛПС 25
1.3.1. Специфическое взаимодействие ЛПС с мембраной эритроцитов 25
1.3.2, Липиды как рецепторы эндотоксинов 26
1.4. Влияние встраивания ЛПС на физико-химические свойства мембраны эритроцитов человека 29
1.4.1. Эластичность мембраны клеток при встраивании липида А 29
1.4.2. Влияние эндотоксинов на текучесть мембраны 30
1.4.3. Эффекты ЛПС на морфологию мембраны эритроцитов 31
1.4.4. Модификация заряда клеточной мембраны эндотоксинами 33
Глава 2. Материалы и методы. Объекты и методы исследования 35
2.1. Определение хемотипа бактерий методом агглютинации клеток клеток по Линдбергу 35
2.2. Получение ЛПС из Rb. capsulaius 35
2.3. Определение чистоты препарата ЛПС 36
2.4. Определение содержания КДО в препаратах ЛПС по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (Karkhanis et al., 1978; Osbomet al. 1979) 36
2.5. Определение качественного состава ЛПС методом электрофореза по Крауссе (Krauss et al, 1988) 37
2.6. Определение содержания катионов металлов в ЛПС 38
2.7. Получение флуоресцентных форм эндотоксинов 38
2.8. Встраивание ЛПС в мембраны теней эритроцитов и нативных клеток 39
2.9. Исследование содержания ЯПСж,.свр!!. и ЛПС.С0/,-.в мембранах теней эритроцитов с помощью карбоцианового красителя 39
2.10. Определение электрофоретической подвижности эритроцитов (ЭФП) 40
2.11. Модификация мембраны эритроцитов ферментами 41
2.12. Исследование способности полимиксина В взаимодействовать с ЛПСдй. встроенным в мембрану эритроцитов 41
Глава 3. Результаты и их обсуждение 42
3.1. Сравнительная характеристика ЛПС из Rhodobacter capsulatus PG и из Escherichia coli 42
3.2. Исследование способности Ш1Сяь.еврх. и ЛПСя./,- к насыщению мембран эритроцитов человека 47
3.3. Влияние ЛПС на электроповерхностные характеристики эритроцитов 49
3.3.1. Исследование влияния ЛПС/а,.^. и ЛПСя.т^ на заряд клеточной поверхности 49
3.3.2. Исследование роли гидрофильного фрагмента ЛПС в изменении ЭФП эритроцитов при встраивании эндотоксинов 53
3.4. Влияние поверхностных белков и заряда мембраны эритроцитов на взаимодействие с эндотоксинами 57
3.5. Исследование способности полимиксина взаимодействовать с ЛПСщ.сч,,,., встроенными в мембрану эритроцитов 63
Выводы 66
Список литературы 69
- Роль температуры, катионов и рН среды в В <-> а фазовом переходе липида А
- Эффекты ЛПС на морфологию мембраны эритроцитов
- Исследование способности полимиксина В взаимодействовать с ЛПСдй. встроенным в мембрану эритроцитов
- Сравнительная характеристика ЛПС из Rhodobacter capsulatus PG и из Escherichia coli
Введение к работе
Актуальность проблемы. Взаимодействие липополисахаридов (ЛПС, эндотоксинов) грамотрицательньтх бактерий с клетками млекопитающих приводит к синтезу биологически активных соединений, избыточное высвобождение которых является причиной эндотоксинового шока. Статистические данные свидетельствуют о том, что эндотоксиновый шок занимает 13 место в списке наиболее частых причин смертности людей. Высокий уровень смертности и развитие тяжелых осложнений при эндотоксиновом шоке связаны с отсутствием специфической терапии. Одним из перспективных направлений предупреждения эндотоксинового шока является применение ЛПС из Rhodobacter capsidatus PG (ЛПСдй.^.), который способен блокировать сайты связывания эндотоксически активных молекул ЛПС на поверхности мембраны клеток-мишеней, и тем самым проявлять антагонистическое действие.
Эритроциты представляют преобладающую популяцию клеток крови и, в первую очередь, подвергаются действию эндотоксинов в кровотоке. Вовлечение клеток крови, особенно эритроцитов, в процессы, связанные с патологией кровеносной системы, обусловлено влиянием ЛПС на морфологию и эластичность мембраны, а также на заряд поверхности этих клеток. В процессе жизнедеятельности клетки, а также при различных патологических состояниях мембрана эритроцитов претерпевает биохимические изменения, способные оказывать влияние на взаимодействие с ЛПС (Рязанцева с соавт., 2003; Piagnerelli, 2003; Степовая с соавт., 2004; Рязанцева с соавт., 2004). В кровеносном русле эритроциты с встроенными в мембрану молекулами ЛПС способны взаимодействовать с нейтрофилами, приводя к их активации (Troelstra et al., 1999). Очевидно, что события, развивающиеся на поверхности мембраны клеток крови после взаимодействия с эндотоксинами, определяются составом и физико-химическими свойствами встроившихся молекул ЛПС.
ЛПС грамотрицательных бактерий различаются количеством остатков 2-кето-З-дезокси-О-манно-октулозоновой кислоты (КДО) и остатков фосфорной кислоты (Barclay et al., 1987; Ohno et al., 1989; Muller-Loennies et al., 2003), а также по катионному составу (Coughlin et al., 1983; 1983a), что отражается на общем заряде каждого ЛПС. Кроме того, ЛПС обладают разной длиной кора и полисахаридного фрагмента (Barclay et al., 1987; Ohno et al., 1989). Способность эндотоксинов взаимодействовать с поверхностью клеток и вызывать большинство биологических ответов связана с гидрофобной частью ЛПС -липидом А. Липиды А агонистических и антагонистических ЛПС различаются
химическим составом и информацией молекул. Влияние агонистических форм ЛПС на заряд поверхности эритроцитов описано в некоторых работах (Мирошников с соавт., 1986), тогда как данных об эффекте антагонистических форм ЛПС в литературе нет. В связи с тем значением, которое играют рассматриваемые формы ЛПС в новых лекарственных препаратах против эндотоксемии, представлялось актуальным и обоснованным сравнительное изучение влияния состава антагонистических и агонистических форм ЛПС на поверхностные свойства мембраны эритроцитов при ее взаимодействии с ЛПС.
В связи с вышесказанным, была сформулирована цель настоящего исследования.
Цель и задачи исследования. Изучить изменение поверхностных характеристик мембраны эритроцитов человека после взаимодействия клеток с эндотоксинами разного состава. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Определить способность различных по составу ЛПС из Rhodobacter capsulatus и Escherichia coli к встраиванию в мембраны эритроцитов человека.
Сравнить влияние встраивания ЛПС Rhodobacter capsulatus и ЛПС Escherichia coli на электрофоретическую подвижность эритроцитов.
Изучить роль гидрофильного фрагмента ЛПС, встроившихся в мембрану эритроцитов, в изменении электроповерхностных характеристик клеток.
Оценить роль заряда и поверхностных белков мембраны эритроцитов на встраивание эндотоксина из Escherichia coli.
Выявить способность катионных антибиотиков взаимодействовать с ЛПСм.арх., встроенными в мембрану эритроцитов.
Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе впервые с помощью методов конфокальной лазерной микроскопии и спектрофотометрии показана способность ЛИС Recaps, к встраиванию в мембраны эритроцитов человека.
Впервые установлено, что в отличие от токсического высокоактивного S-ЛПС Escherichia coli (ЛПСе.С0[;) насыщение мембраны исследуемых клеток ЛПСдь.са/и. практически не влияет на заряд ее поверхности. Практическая значимость полученного результата заключается в том, что взаимодействие ЛПСдй.^. при его введении в кровоток с эритроцитами не будет являться причиной агрегации клеток, вызванной изменением заряда поверхности мембраны.
В экспериментах in vitro впервые обнаружено, что катионный антибиотик полимиксин В взаимодействует с ЛПСДй.спр^., встроенным в мембрану эритроцитов,
вызывая высвобождение внутриклеточного гемоглобина. Полученные результаты имеют важное практическое значение в рекомендациях совместного применения антагонистов эндотоксинов и катионных антибиотиков при лечении грамотрицательного сепсиса. Основные положения, выносимые на защиту:
Степень насыщения мембран эритроцитов липополисахаридами из Rhodobacter capsulatus и Escherichia coli зависит от состава их липидов А.
Изменение поверхностных свойств эритроцитов зависит от длины коровой и полисахаридной составляющих ЛПС, встроившихся в мембрану клетки.
Белки поверхности мембраны являются определяющими факторами взаимодействия эритроцитов с эндотоксинами и их последующего встраивания.
Катионный антибиотик - полимиксин В взаимодействует с ЛІЇСль.аіра., встроенным в мембраны эритроцитов, и вызывает частичное высвобождение внутриклеточного гемоглобина.
Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации были представлены и обсуждены на: научно-практической конференции «Инфекционные болезни на рубеже XXI века» (Москва, 2000); VII Путинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003); XVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004); Третьем Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004); VIII международной школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2004); Ш конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004); I международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность)) (Москва, 2004); IX Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2004); «The 2004 Younger European Chemists' Conference» (Italy, 2004); IX международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2005); «International Sarcoma Meeting Stuttgart» (Germany, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ.
Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на 84 страницах машинописного текста,
содержит 18 таблиц и 22__ рисунка и состоит из 5 разделов: введения,
обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, а также списка цитируемой литературы, включающего _187_ источника.
Роль температуры, катионов и рН среды в В <-> а фазовом переходе липидаА
Исследования роли белков и фосфолипидов мембраны во взаимодействии с ЛПС были предприняты в 70-х годах прошлого столетия после установления полной структуры эндотоксина. Наличие в ЛПС гидрофобного фрагмента - липида А, предполагало его непосредственную роль во взаимодействии эндотоксинов с мембранами клеток крови и эритроцитами, в частности. В связи с этим, большинство исследований по влиянию ЛПС на свойства мембраны и ее структурные компоненты выполнены в то время (Ciznar et al., 1971; Warren, 1977; Godin et al, 1982; Warren, et al, 1983; Petrova et al., 1982). Возобновление интереса и необходимость дополнительных исследований роли заряда поверхности клетки, стереохимических факторов мембраны и фосфолипидов бислоя во взаимодействии с эндотоксинами вызваны появлением новых современных данных о молекулярной организации мембраны эритроцитов и роли этих клеток в синдроме сепсиса (Troelstra et al., 1999; Gwozdzinski et al, 2003; Poschl et al., 2003; Murphy et al., 2004). Открытие антагонистических свойств ЛПС фототрофных бактерий: Rb. capsulatus и R. sphaeroides (Golenbock et al., 1991), а также синтетических аналогов липида А: соединений Е5531 (Christ et al., 1995) и E5564 (Lynn et al., 2003) подчеркивает важность дополнительных исследований взаимодействия данных видов ЛПС с мембранами клеток и их последующего влияния на физико-химическое состояние бислоя и физиологию клеток.
Стало известно, что в процессе развития сепсиса эритроциты человека теряют со своей поверхности часть сиаловых кислот (Piagnerelli, 2003). Это может быть вызвано секрецией грамотрицательными бактериями специализированных ферментов, сиалидаз, которые гидролизуют связи сиаловых кислот с углеводами гликопротеинов, тем самым, обеспечивая доступ микроорганизма к местам связывания на поверхности клетки-мишени (Corfield, 1992). Аналогичная картина наблюдается при поражении клеток вирусами гриппа (Львов с соавт., 2006), Снижение отрицательного заряда поверхности мембраны способно влиять на взаимодействие клетки с молекулами ЛПС, присутствующими в кровотоке. В настоящие время большинство исследований посвящено рецептори ой функции сиаловых кислот, тогда как данных о роли заряда мембраны клеток во взаимодействии с ЛПС практически нет.
Показано, что эритроциты, несущие на своей поверхности бактерии или встроенные молекулы ЛПС, взаимодействуют с интегринами и рецептором CD 14 на поверхности нейтрофилов (Troelstra et al., 1999). Авторы наблюдали различия в механизмах активации клеток, зависящие от количества встроенного в мембрану ЛПС и типа его презентации нейтрофилам. Макрофаги узнают и фагоцитируют эритроциты, на мембране которых находится комплекс ЛПС с белком, переносящим липиды (LBP) (Wright et al., 1989). Необходимо отметить, что большинство исследований роли эритроцитов в развитии синдромов грамотрицательного сепсиса проводятся на эритроцитах кроликов, которые значительно отличаются от эритроцитов человека фосфолипидным составом мембраны и зарядом ее поверхности (Черницкий, 1981; Petrova et al., 1982).
Мембрана эритроцитов, сохраняя характерные признаки строения, отличается по структуре и составу среди различных представителей Homo sapiens, являясь отражением физиологического и генетического состояния индивидуума, Известно, что при неврологических нарушениях и старении эритроцита изменяется фосфолипидный состав мембран красных клеток крови (Черницкий с соавт., 1981; Васильева с соавт., 2001). Изменения текучести мембраны описаны для многих типов опухолевых клеток, причем независимо от локализации и типа опухоли, сопутствующие изменения текучести мембраны наблюдались и у эритроцитов (Дятловицкая, 1995; Горопшнская с соавт., 1999). При ряде генетических нарушений на поверхности эритроцитов могут отсутствовать некоторые белки-рецепторы, приводя к изменению стереохимических параметров мембраны (Bufler et al,, 1995; Hiki et al., 1998). Приведенные данные предполагают необходимость расширения исследований по влиянию структуры поверхности мембраны клеток при взаимодействии с ЛПС. Большинство известных в настоящее время эндотоксинов обладают разным суммарным зарядом молекул. Роль заряда ЛПС и собственно структуры мембраны, учитывая ее патофизиологические изменения при взаимодействии с эндотоксинами, в настоящее время требует дополнительного изучения,
Молекулярная организация мембраны эритроцитов хорошо установлена (рис, 9). Внешняя поверхность красных клеток крови в основном образована липидами. Нейтральные полярные липиды (цвиттерионные) фосфатидилхолин (ФХ) и сфингомиелин (СМ) - основные фосфолипиды внешнего листка мембраны эритроцитов, Необходимо отметить, что фосфолипидный состав мембраны эритроцитов близок фосфолипидному составу макрофагов человека, принимающих активное участие во взаимодействии с ЛПС (табл. 3).
Одной из разновидностей доменов мембраны эритроцитов являются липидные островки - рафты. Липидиый состав рафтов в основном представлен сфинголипидами и холестерином, а также гликолипидами: ганглиозидами и сульфатидами (Brown et al., 1992; Prinetti et al, 2000). Высокое содержание холестерина и гликосфинголигшдов характерно и для кавеол - инвагинированных доменов мембраны. Однако эти домены отличаются от рафтов присутствием белка кавеолина-1 (Murataet al, 1995), который обусловливает инвагинацию мембраны (Fra et al, 1995). Рафты существуют в особой жидко-упорядоченной фазе (10), отделяясь от остального бислоя в 1й-фазе (Brown, 1998; Schroeder et al, 1994). Ацильные цепи липидов в 10 фазе вытянуты, плотно упакованы и высокоупорядочены, подобно ацильным цепям в гелевой фазе. Отделение 10 фазы от неупорядоченной 1а фазы обеспечивается присутствием холестерина, т.к. он индуцирует порождение 10 и la фаз в смесях липидов природного происхождения (Ahmed et al., 1997). Присутствие в мембране эритроцитов фосфолипидных доменов, отличающихся фазовым состоянием, способно играть важную роль во встраивании ЛПС в мембрану клетки, поскольку, как описано выше (раздел 1.1.3), жирные кислоты липидов А при физиологической температуре обладают разной степенью подвижности (табл. 2), которая определяется структурой ЛПС. Кроме того, большинство поверхностных белков эритроцитов прикреплено к мембране посредством гликозилфосфатидилинозитола (GPI) (Pugin et al., 1988; Cross, 1990) (табл. 5). Отсутствие трансмембранного и цитоплазматического доменов и наличие GPI-якоря обеспечивает этим белкам высокую латеральную подвижность и сродство к рафтам. В связи с этим поверхностные белки эритроцитов, располагаясь на мембране группами (рис. 9), способны регулировать взаимодействие ЛПС с клетками и последующее встраивание липида А.
Эффекты ЛПС на морфологию мембраны эритроцитов
Мембраны клеток образованы фосфолипидами, индивидуальная конформация которых, комплементарно дополняя друг друга, образует бислойную ламеллярную структуру (Cbristiansson et aL, 1985). Как показано в разделе 1,1.4., липиды А эндотоксинов обладают разной конформацией молекул. Очевидно, что встраивание в мембрану экзогенных липидных компонентов, формирующих неламелляриые агрегированные структуры, будет приводить к нарушениям бислойной структуры мембраны и влиять на морфологию клеток. Обнаружено, что обработка ЛПС щелочью (Щ-ЛПС)(0.1-0.25н NaOH; 60 мин) отщепляет жирные кислоты положений 3 и 3 Glcl и GlcII липида А, тем самым изменяя его конформацию (Ciznar et al., 1971), и повышает аффинность эндотоксина к мембранам эритроцитов (Neteret al,, 1956; Ciznar et al., 1971). Полученный таким образом ЛПС из Е. coli 0127:В8, содержащий только три остатка жирных кислот, при инкубации с эритроцитами (8 мкг/мл) приводит к формированию клетками эхиноцитов стадий 1 и 2 (Warren et al., 1983). Увеличение концентрации ЛПС до 25 мкг/мл усиливало эффект эндотоксина и вызывало формирование эхиноцитов стадии 3. Эти стадии характеризуются появлением на поверхности клетки множества равномерно распределенных по всей мембране длинных и тонких конусообразных выростов в виде шипов с закругленными вершинами.
При концентрации ЛПС 100-200 мкг/мл практически все двояковогнутые эритроциты переходят в стадию сфероэхиноцитов (рис. 11). Поверхность таких клеток покрыта равномерно и довольно густо тонкими, удлиненными выростами конической формы с остроконечной вершиной, напоминающей пальцеобразные выросты или заканчивающиеся на конце округлым пузырьком. Подобные результаты получены при инкубации эритроцитов человека с интактной Re-структурой ЛПС из Е. coli F515 (Poschl et al., 1992). Поскольку Варрен с соавт. показали, что ЛПС не действует на мембраны эритроцитов как ионофор, данные изменения морфологии клетки, по-видимому, обусловлены мембранными белками и фосфолипидами (Warren et al., 1983).
Двояковогнутая форма эритроцитов регулируется комплексом трансмембранного белка полосы 3 с филаментами спектрина (Anderson et al., 1981) и фосфолипидной ассиметрией внешнего и внутреннего листков бислоя мембраны (Sheetz et al., 1974; Sheetz et al., 1976). Взаимдействие гетерополисахарида ЛПС с трансмембранными белками мембраны способно вызывать их кросс-связывание, тем самым, деформируя цитоскелет клетки и изменяя ее морфологию. Другое объяснение предложено Шиитц с соавт. (Sheetz et al., 1974). Анионные амфипатические молекулы, встроенные главным образом внутрь внешней половины липидного бислоя мембраны эритроцитов, растягивают его относительно цитоплазматического листка и, таким образом, способствуют образованию эхиноцитов. Образование пальцеобразных выростов и псевдоподий под действием ЛПС показано также для тромбоцитов (Morrison et al., 1981). Не исключено, что изменение в кривизне мембраны является составной частью механизма, которым ЛПС стимулирует клеточные функции, такие как секреция и фагоцитоз.
Вопрос о влиянии эндотоксинов на электрокинетические свойства поверхности клеток при встраивании ЛПС в мембрану представляет особый интерес, т. к. изменение поверхностного заряда клетки свидетельствует об определенных физико-химических нарушениях, происходящих на поверхности мембраны, развитии патологии кровообращения и биохимических сдвигах в организме. В связи с многообразием ЛПС, различающихся по заряду молекул, вопрос об их влиянии на электрокинетические характеристики поверхности мембраны клеток весьма актуален.
Диссеминированное свертывание крови внутри сосудов является неотъемлемой частью септического шока. Вовлечение клеток крови, и особенно эритроцитов, в образование сгустков крови вызвано снижением электрического заряда поверхности мембран и агрегацией клеток в кровеносном русле (Petrova et al., 1982).
Литературные данные по влиянию ЛПС разной структуры на заряд поверхности мембраны клетки весьма скудны. Большинство работ по этому вопросу относится к мембране тромбоцитов. Электрофоретическая подвижность (ЭФП) этих клеток уменьшалась только при взаимодействии с S-типом ЛПС из Salmonella Minnesota серовар Thyphimurium, тогда как эндотоксины 5, minnesota 595 и S. minnesota 345, не имеющие О-полисахарида и с частичной редукцией кора, не влияли на эту характеристику клеток (Fumarolaetal., 1977).
Исследования влияния ЛПС на ЭФП эритроцитов не многочисленны. Петрова с соавт. показали, что внутривенное введение кроликам S-структуры эндотоксина из Е. coli 0111 :В4 вызывает резкое падение заряда поверхности эритроцитов на ранних этапах шока (Petrova et al., 1982). Иммунизация доноров кишечной вакциной вызывала снижение значений ЭФП их эритроцитов до 0.977 ± 0.04 мкм/с/В/см, которые оставались в этих пределах еще в течение 2 недель. Ко второй неделе после иммунизации среднее значение ЭФП эритроцитов составляло 0.957 ± 0.04 мкм/с/В/см. Следует отметить, что каких-либо существенных изменений в плазме крови (ее рН, соотношение альбуминов и глобулинов и внутриглобулиновых фракций), а также со стороны иммуноглобулинов не отмечено (Козинец с соавт., 1986). До настоящего времени точно не установлено, вызваны ли выше перечисленные эффекты непосредственным встраиванием ЛПС в мембрану клеток, либо опосредованы активностью других клеток крови.
Влияние ЛПС на поверхностный заряд фосфолипидного бислоя при встраивании ЛПС показано с использованием искусственных мембран - липосом. Взаимодействие ЛПС с нейтральными липосомами из фосфатидилхолина повышало заряд последних, тогда как липосомы из фосфатидилсерина становились менее заряженными (Onji et aL, 1979). Авторы предположили, что изменения в заряде поверхности фосфолипидного бислоя влияют на свойства биологических мембран, что может служить сигналом для активации внутриклеточных процессов. В связи с этим, исследования обнаружили уменьшение заряда поверхности мембраны В-клеток селезенки (на 14%) после 4-х часового культивирования с ЛПС in vitro (Dumont., 1975). Впоследствии, когда был активирован синтез ДНК и формирование бластов, заряд повышался на 19-23% в сравнении с контролем независимо, присутствовал ли ЛПС непрерывно в среде инкубирования, или был удален. Таким образом, изменение заряда мембраны при встраивании эндотоксинов различной структуры способно быть частью механизма активации клеток-мишеней, Кроме того, исследование распределения ЛПС среди клеток крови обнаружило предпочтительное связывание эндотоксина с тромбоцитами в крови человека и эритроцитами в крови кроликов, что хорошо коррелирует с зарядом клеточной мембраны этих клеток (Roth et aL, 1993).
Обобщая приведенные данные, можно заключить, что развитие патологии функционирования кровеносной системы зависит от эффектов ЛПС, связанных с их составом, на биохимические, механические и электроповерхностные характеристики мембран клеток крови. Таким образом, особо важными представляются исследования влияния физико-химических свойств разных видов агонистических и антагонистических молекул ЛПС на клетки крови человека.
Исследование способности полимиксина В взаимодействовать с ЛПСдй. встроенным в мембрану эритроцитов
Взаимодействие модифицированных т.о. эритроцитов с ЇЇП.СЕіСОц вызывало дальнейшее уменьшение ЭФП клеток (табл. 17). Снижение ЭФП эритроцитов, обработанных трипсином, после взаимодействия с ЛПСя.С0;,- значительнее в сравнении с эритроцитами, обработанными нейраминидазой, что указывает на увеличение встраивания ЛПС в первом случае. Полученные данные хорошо согласуются с данными Година с соавт, (Godin et al, 1981), показавшими влияние трипсина и нейраминидазы на взаимодействие ЛПС из Е. coli 026:Вб с эритроцитами человека.
Увеличение степени встраивания JlXlCE.c0u после снятия пространственных факторов трипсином обнаруживает роль белков во взаимодействии с эндотоксинами. Обработка эритроцитов этим ферментом, по-видимому, обнажает места встраивания эндотоксинов, располагающиеся в глубине гликокаликса клетки, способствуя взаимодействию с ЛПС. Это предположение является обоснованным в связи с тем, что белки поверхности клетки способны заслонять участки связывания ЛПС, располагающиеся непосредственно у основания белка мембраны. Подобное влияние трипсина на взаимодействие лимфоцитов с ЛПС наблюдалось Кабиром с соавт. (Kabir et al., 1977).
Полученные данные по взаимодействию ЛПС с эритроцитами, обработанными ферментами, позволяют обсудить роль сиаловых кислот во взаимодействии ЛПС с мембранами клеток крови. Сиаловые кислоты эритроцитов располагаются на гликофоринах и гликолипидах мембраны в разных слоях гликокаликса. Сиаловые кислоты гликофоринов находятся на большем удалении от поверхности мембраны, тогда как сиаловые кислоты гликолипидов - в глубоких слоях гликокаликса клетки. Одна молекула гликофорина включает до 16 остатков сиаловой кислоты (Marchesi et al., 1976). В связи с этим, данные сиалогликопротеины эритроцитов формируют участки мембраны с повышенной плотностью отрицательного заряда. Заряд молекул ЛПС, как отмечалось выше, зависит не только от количества КДО и остатков фосфорной кислоты, а также от присутствия катионов. Наиболее отрицательные молекулы ЛПС, вследствие электростатического отталкивания, будут направлены к участкам мембраны клетки с пониженной электронной плотностью, тогда как менее отрицательные молекулы ЛПС - к участкам мембраны с повышенной электронной плотностью, Поскольку клетки крови различаются по количеству сиалопротеинов и заряду поверхности, описанный механизм электростатического взаимодействия будет действовать на уровне клеток разных популяций (Roth et al., 1993).
Из предложенного механизма электростатического взаимодействия поверхности мембраны и ЛПС следует, что ЛПС со сниженным зарядом молекулы (ЛПСдься/».) обладают большей способностью к взаимодействию с эритроцитами в сравнении с ЛПС с высоким отрицательным зарядом молекулы. Однако после электростатического взаимодействия ведущая роль во встраивании ЛПС в мембрану клетки обусловлена структурой и составом его гидрофобной составляющей - липиду А.
Катионные антибиотики, такие как полимиксин В, взаимодействуют с отрицательно заряженными фосфатными и карбоксильными группами эндотоксинов (Сагг et al., 1985). Лизис клеток полимиксином В наблюдается только при его взаимодействии с Re - Ra- встроенными в эритроциты структурами ЛПС, тогда как О-антиген S-структуры ЛПС стерически препятствует связыванию антибиотика с ЛПС и лизису клетки. Действие полимиксина В, приводящее к гемолизу эритроцитов, несущих на своей поверхности ЛПС, показано ранее Карром и Моррисоиом (Сагг & Morrison, 1985). Однако эти исследования были выполнены только с токсичными формами ЛПС на эритроцитах кролика, которые значительно отличаются от эритроцитов человека как по фосфолипидному составу (Черницкий с соавт., 1981), так и по заряду поверхности мембраны (Petrova et al., 1982; Козинец с соавт., 1986). Поскольку нами показано встраивание в мембраны эритроцитов человека антагонистического ЛПСщ., ., который обладает SR-структурой и сниженным отрицательным зарядом, представлялось необходимым исследовать способность связывания полимиксина В с данным антагонистом в связи с возможным гемолизом эритроцитов.
При используемой концентрации ЯПСнь.сарх. 10 мкг/мл, которая значительно ниже доз, предложенных для лечения эндотоксинового шока препаратами аналогичного химического состава (Lynn et al, 2004), высвобождение гемоглобина, индуцированное полимиксином В, наблюдалось через 1 ч инкубирования эритроцитов с ЛЛС ., .. Свободный гемоглобин составлял 0.65% от общего количеста гемоглобина эритроцитов (5 106 клеток). Повышение концентрации Я11Сяьхвр1_ в среде до профилактической дозы 30 мкг/мл (Lynn et al., 2004), соответствующей концентрации насыщения мембран эритроцитов, существенно усиливало эффект полимиксина В на высвобождение гемоглобина (табл. 18).
Анализ данных, представленных в табл. 18, показывает, что максимальное высвобождение гемоглобина наблюдается после15 мин инкубации клеток с ЛПСщ,., . и сохраняется при более длительной инкубации, вплоть до 1ч. Способность полимиксина В взаимодействовать с Ш{Сцьспр!. на поверхности эритроцитов предполагает наличие доступных отрицательных зарядов, расположенных в области КДО и диглкжозамина липида А исследуемого антагониста. Поскольку эффективность проникновения а,у-диаминомасляной кислоты полимиксина В в фосфолипидный бислой и связанный с этим лизис клеток определяются непосредственной близостью расположения КДО и фосфатных остатков липида А эндотоксинов к фосфолипидному бислою мембраны, то полученные нами данные подтверждают встраивание ЛПСм,.сар1. в мембраны эритроцитов человека.
Несмотря на использование антагониста в концентрации, близкой к порогу насыщения мембраны, в наших экспериментах не наблюдался полный лизис эритроцитов со встроенным ЛПСДЙ.СЯ/JJ.! индуцированный полимиксином В. Это, по-видимому, объясняется тем, что полимиксин В индуцирует кратковременные (до 100 миллисекунд), достаточно большие флуктуирующие поры (2.4 нм) в мембранах, сформированных из фосфолипидов и ЛПС (Schroder et al., 1992; Falla et al., 1996; Halevy et al., 2003). В эритроцитах, мембраны которых обладают цитоскелетом, деструкция бислоя может быть локальной и сопровождаться процессом репарации (Miller et al., 1978). Исходя из этого, мы предположили, что высвобождение гемоглобина (эффективный радиус диффузии 32,5 A; Mr 68 кДа) из эритроцитов, несущих на своей поверхности ЛПСлб.ся ., под действием полимиксина В происходит по описанному механизму (Pappenheimer, 1955). Однако возможность полного разрушения отдельных клеток эритроцитов вследствие значительного нарушения целостности мембраны не исключена.
Сравнительная характеристика ЛПС из Rhodobacter capsulatus PG и из Escherichia coli
Форменные элементы крови человека обладают отрицательным зарядом клеточной поверхности, который обеспечивает электростатическое отталкивание клеток и их состояние в кровотоке (Маркосян с соавт., 1977; Cartron et al., 2001). Фосфорилэтаноламин и значительное содержание Са2+ в составе ЛПСД&. caps. снижают общий отрицательный заряд молекулы, что при встраивании ЛПС может влиять на электроповерхностные свойства мембран клеток-мишеней.
Влияние встраивания эндотоксинов на заряд клеточной поверхности исследовали по изменению электрофоретической подвижности клеток (ЭФП) методом клеточного микроэлектрофореза. Инкубация теией эритроцитов с ЛПСта ,caps_ при концентрации, близкой к порогу насыщения мембраны, вызывала снижение ЭФП теней на 4%, тогда как инкубация с ЛПС. шц - на 11 % в сравнении с контролем. Однако, значительная гетерогенность значений ЭФП в популяции контрольных теней эритроцитов (рис. 16А) существенно затрудняла интерпретацию результатов по изменению электроповерхностных свойств мембран после встраивания эндотоксинов. В связи с этим, исследования влияния ЛПСдг,, .. и ЛПСЕ. П на электрофоретическую подвижность клеток в дальнейшем проводили на интактных эритроцитах, значения ЭФП которых колеблются в более узком диапазоне (рис. 16Б).
На рисунке 17 представлены значения ЭФП контрольных эритроцитов и эритроцитов после инкубации с исследуемыми ЛПС. Из рисунка 16а видно, что контрольные клетки включают несколько популяций, различающихся по значениям ЭФП. Это указывает на существование в контрольной пробе клеток, различающихся по содержанию сиаловых кислот на поверхности мембраны и измененным состоянием белковых молекул. Из литературных данных известно, что данные изменения на мембране эритроцитов связаны с возрастом клетки или с перенесенными заболеваниями (Кау, 1985; Hadengue et а!., 1998). Инкубация эндотоксинов с эритроцитами вызывала увеличение гетерогенности значений ЭФП в популяции контрольных клеток как в случае с ЛПСя. сон, так и с ЛЛСяй, caps., что связано со встраиванием исследуемых ЛПС в мембраны клеток (рис. 17). Наблюдаемая гетерогенность значений ЭФП внутри популяции клеток, инкубированных с каждым из рассматриваемых ЛПС, предполагает встраивание различного количества ЛПС в мембраны эритроцитов. Причиной этого являются различия биохимического состава плазматических мембран эритроцитов (Bratosin et al., 1998; Васильева с соавт., 2001).
Зависимость электрофоретической подвижности эритроцитов от концентрации ЛПС в среде инкубации представлены в табл. 12.
Из полученных данных видно, что насыщение мембраны эритроцитов ЛИСщ, .caps. достигается при концентрации эндотоксина 30 мкг/мл, что подтверждено нами в экспериментах по порогу насыщения мембран (раздел 3.2). Из табл. 12 следует, что насыщение мембран эритроцитов ЛПСяь,сарі. незначительно влияет на электроповерхностные свойства мембраны в сравнении с ЛПСС0;,-. Увеличение времени инкубации до 4-х часов заметно влияло на значения ЭФП только эритроцитов, обработанных ЛПС& соц. При концентрации ЛПС.С0;, 30 мкг/мл (4 ч, 37 С) ЭФП эритроцитов снижалась на 10% (-1.16 ± 0.01;р 0.001), при концентрации 70 мкг/мл- 16% (-1.08±0,01;р 0.001) в сравнении с контролем (-1.29 ±0.006). Повышение концентрации ЛПСг. сои и времени инкубации, по-видимому, приводит к встраиванию в мембраны дополнительного количества этого эндотоксина, что сказывается на значениях ЭФП.
Разное влияние ЛПС№. caps. и ЛПС, юи на ЭФП эритроцитов может объясняться как особенностями S- и SR-структуры исследуемых ЛПС, так и способностью к насыщению мембраны эритроцитов. В связи с этим, мы исследовали роль гидрофильного фрагмента ЛПС в изменении ЭФП эритроцитов.
ЛПСл;,. mps. и ЛПС. СПц отличаются не только по составу липида А, но и структурой кора и полисахаридного фрагмента ЛПС (Barclay et al., 1987; Ohnoet al., 1989) (Рис. 18). С целью исследования влияния этих составляющих молекул ЛПС были использованы коммерческие Re-, Ra- и S-структуры эндотоксинов из Е. coli. Данные структуры отличаются составом кора и полисахарида ЛПС, но обладают идентичной структурой липида А, что позволяет исключить влияние последнего на взаимодействие и последующее встраивание ЛПС в мембрану эритроцитов. Влияние внутреннего кора на ЭФП клеток может быть обусловлено его заряженными группами, тогда как внешнего кора и полисахаридного фрагмента, вследствие их размера - экранированием поверхностного заряда клеток.
Инкубацию Re-, Ra- и S-форм ЛПСся// с эритроцитами проводили аналогично экспериментам с ЛПСдй. caps. Из данных, представленных в табл. 13, видно, что только взаимодействие S-формы ЛПС.С0;; с эритроцитами достоверно уменьшает значение ЭФП клеток в сравнении с контролем, тогда как инкубация клеток с Re- и Ra-структурами ЛПС не влияет на электроповерхностные характеристики эритроцитов.
