Введение к работе
Исследование биологических жидкостей человека традиционно играет важную роль в развитии представлений о нормальном функционировании и дисфункциях соответствующих органов и систем. Данные о биохимическом составе биологических жидкостей человека дают для практической медицины новые инструменты, позволяющие проводить клиническую лабораторную диагностику на качественно новом уровне [Луцкий Д. Л., 2000, Дмитриев Г. А., 2003, Молчанов О. Л. и др., 2004].
Из всех биологических жидкостей организма человека и животных (кровь, моча, слюна, молоко, ликвор и др.) одной из самых малоизученных остается влагалищная жидкость [Кудрявцева В. Л. и др., 2001, Rutllant J. et al., 2001]. В отечественной и зарубежной литературе встречаются лишь отдельные работы, посвященные биохимическому изучению состава влагалищной жидкости в норме и при различных патологических состояниях [Марцишевская Р. Л. и др., 1990, Молчанов О. Л., 2000, Raffi R. О., Nussbaum A. A. et al, 2003].
Изучение биохимического состава влагалищной жидкости имеет как фундаментальное, так и прикладное значение. Являясь, по сути, интегральной средой, состав влагалищной жидкости может косвенно отражать состояние всей женской репродуктивной системы. Изучение биохимических показателей влагалищной жидкости и их динамики способно пролить свет на закономерности формирования патологических процессов, развивающихся в репродуктивной системе женщины и, следовательно, наметить новые подходы, как в диагностике, так и в лечении заболеваний у женщин [Elitsur Y. et al., 1998, Levin R. J. et al., 2004].
Цель исследования
Комплексная биохимическая и иммунохимическая оценка состава влагалищной жидкости здоровых, небеременных женщин.
Основные задачи исследования
Исследовать динамику уровня неорганических веществ (кальций, магний) влагалищной жидкости на протяжении менструального цикла у здоровых женщин.
Исследовать динамику уровня низкомолекулярных азотистых веществ (мочевина, креатинин, мочевая кислота), пигментов (билирубин общий, билирубин пря-
мой), углеводов (глюкоза), липидов (триглицериды) на протяжении менструального цикла у здоровых женщин.
Исследовать динамику активности ферментов (а-амилазы, аспартатаминотранс-феразы, аланинаминотрансферазы, у-глутамилтрансферазы, креатинкиназы, кислой фосфатазы, щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы) на протяжении менструального цикла у здоровых женщин.
Изучить динамику уровня лактоферрина влагалищной жидкости здоровых женщин.
Оценить возможность определения фаз менструального цикла и периода овуляции на основе исследования биохимического состава влагалищной жидкости.
Научная новизна
Впервые исследована динамика уровня неорганических веществ (кальций, магний), низкомолекулярных азотистых веществ (мочевина, креатинин, мочевая кислота), пигментов (билирубин общий, билирубин прямой), углеводов (глюкоза), липидов (триглицериды) влагалищной жидкости на протяжении менструального цикла здоровых женщин.
Впервые исследована динамика активности ферментов (а-амилазы, аспарта-таминотрансферазы, кислой фосфатазы, щелочной фосфатазы, креатинкиназы, аланинаминотрансферазы, у-глутамилтрансферазы, лактатдегидрогеназы) на протяжении менструального цикла у здоровых женщин.
Впервые с учетом выявленных динамических изменений биохимического состава влагалищной жидкости проанализированы регуляторные механизмы синтеза и секреции биохимических компонентов на протяжении менструального цикла здоровых женщин.
Практическое значение работы
Предложены новые методы определения фаз менструального цикла и периода овуляции на основе исследования биохимического состава влагалищной жидкости. Описано качественное и количественное изменение биохимического состава влагалищной жидкости у здоровых женщин во время менструального цикла. Приведены нормальные значения концентрации неорганических веществ (кальций, магний), низ-
Как видно из представленной схемы, подавляющее большинство биохимических компонентов влагалищной жидкости (84,2%) периодически изменяют концентрацию или активность на протяжении менструального цикла здоровых женщин. Из них в 56,2% случаев удалось выделить гормоны, оказывающие основное регулирующее действие на рассматриваемые биохимические компоненты. Причем, по полученным нами данным, наиболее часто регулирующее действие (положительное или отрицательное) оказывает прогестерон и его метаболиты (67% случаев), реже эстрогены (22% случаев) и еще реже другие гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон.
Полученные данные имеют, на наш взгляд, не только теоретическое, но и большое практическое значение, так как позволяют избегать ошибочных заключений при интерпретации клинико-лабораторных данных биохимического исследования влагалищной жидкости. Например, в ряде исследований [Кира Е. Ф., Молчанов О. Л. 1996-2004], авторами делаются выводы о диагностической значимости при бактериальном вагинозе ряда биохимических компонентов влагалищной жидкости (мочевина, глюкоза, магний, кальций, аспартатаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза, креатинкиназа, лактатдегидрогеназа, ot-амилаза, щелочная фосфатаза и др.). Действительно, по данным этих авторов [Кира Е. Ф., Молчанов О. Л. 1996-2004], во влагалищной жидкости при бактериальном вагинозе по сравнению со здоровыми женщинами происходят изменения биохимического состава,(например, уровень кальция изменяется в 1,34 раза по сравнению со здоровыми женщинами, а активность аспарта-тамино-трансферазы в 4,31 раза) авторы проводят на основание этого диагностику, дают рекомендации по тактике лечения, осуществляют контроль над качеством проводимой терапии.
Однако если учесть полученные нами данные о физиологических изменениях концентрации только этих двух показателей влагалищной жидкости на протяжении менструального цикла (изменения в 2,98 раза и 27,05 раза соответственно), то становится ясно, что авторами [Кира Е. Ф., Молчанов О. Л. 1996-2004] непроизвольно допущена ошибка из-за игнорирования физиологических циклических изменений биохимического состава влагалищной жидкости. Все это ставит под сильное сомнение выводы авторов о диагностической значимости указанных биохимических парамет-
Апробация результатов
Результаты работы представлены и доложены на:
I Всероссийском конгрессе «Актуальные вопросы оперативной гинекологии и репродукции человека» (Краснодар, 2001 г.)
V Международной конференции «Эколого-биологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия» (Астрахань, 2002 г.);
VI и VIII Международных конференциях «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря» (Астрахань, 2003 г., 2005 г.);
Итоговых научных конференциях ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» (Астрахань, 2002-2005 г.г.);
IX International Scientific Conference «Family Health In The XXI Century» (China, Dalyan, 2005).
Публикации и изобретения
По теме диссертации опубликованы 8 печатных работ. Внедрение результатов исследования в практику
Полученные результаты используются в практической работе Центра планирования семьи и репродукции человека г. Астрахани при лабораторной диагностике женской репродуктивной функции, при формировании групп риска развития субфер-тильности, в практической работе диагностической лаборатории ООО МФВФ «Тех-номед», в практической работе исследовательской лаборатории ООО НПЛ «Новые технологии».
Результаты диссертационной работы используются в качестве учебного материала для студентов, интернов и ординаторов ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия».
Объём и структура диссертации
Диссертация изложена на 110 страницах, содержит 15 таблиц и 18 рисунков. Она состоит из введения; четырёх глав, включающих обзор литературы, описание методов исследования, изложения фактического материала и обсуждения полученных
результатов; заключения; выводов, практических рекомендаций; указателя использованной литературы. Библиографический указатель содержит 168 источников, из них 124 на иностранных языках.
Объектами нашего исследования были влагалищная жидкость человека и ее компоненты.
Донорами влагалищной жидкости стали здоровые, нерожавшие, небеременные, не принимающие гормональные контрацептивы женщины (n = 23) репродуктивного возраста (от 20 до 24 лет, средний возраст 21,7±1,4 года). Женщины имели достаточно стабильный менструальный цикл (средняя продолжительность 27,4±0,8 дней).
Материалом исследования служила влагалищная жидкость. Отбор проб влагалищной жидкости проводился по стандартной методике с применением автоматического микродозатора. Для предотвращения контаминации влагалищной жидкости, цервикальный секрет под визуальным контролем удаляли с использованием ватно-марлевого тампона в соответствие с рекомендациями [Молчанов О. Л., 2000]. Материал исследования (влагалищная жидкость) разрабатывался поэтапно. На первом этапе проводили исследования физико-химических свойств. На втором этапе начинали исследование иммунохимического и биохимического состава. При необходимости образцы до исследования хранили в морозильной камере при постоянной температуре -18С. Сбор образцов влагалищной жидкости осуществляли с 2000 по 2005 годы в НПМК «Экологическая медицина» ООО «Астраханьгазпром», Центре планирования семьи и репродукции г. Астрахани и лаборатории ООО МФВФ «Техномед».
Было исследовано 583 образца влагалищной жидкости. Физико-химические методы исследования включали в себя определение рН влагалищной жидкости рН-метром «Hanna Piccolo Plus» с разрешающей способностью 1,00-13,00±0,01. Наблюдения за «феноменом кристаллизации цервикального секрета» (тест арборизации) проводили с использованием микроскопа «Микмед-2 вар.2» фирмы «ЛОМО». Для измерения удельной активности ферментов влагалищной жидкости использовали Условные Единицы (УЕ), которые были равны отношению активности фермента выраженной в Международных Единицах - ME (то есть мкмоль/(мин-л)) к количеству
общего белка в исследуемых образцах влагалищной жидкости в граммах. Определение концентрации общего белка в исследуемых образцах влагалищной жидкости проводили на автоматическом биохимическом анализаторе «Alcyon Analyzer- 300».
Определение активности а-амилазы (ЕС 3 2.1.1.) во влагалищной жидкости проводили унифицированным амилокластическим методом (по W. Т. Caraway). Измерение активности аспартатаминотрансферазы (ЕС 2.6.1.1) и аланинаминотрансферазы (ЕС 2.6.1.2) проводили на автоматическом биохимическом анализаторе фирмы «Nittefo) модель «Super Z-818». Унифицированный метод основан на определении суммарной экстинкции динитрофенилгидразонов пировиноградной кислоты, являющейся продуктом реакции, и а-кетоглутаровой кислоты, служащей исходным веществом при реакции переаминирования. у-Глутамилтрансфераза (ЕС 2.3.2.2) определялась по расщеплению L-y-глутамил-п-нитроанилида. Для определения активности креатинкиназы (ЕС2.7.3.2.) был использован метод с использованием креатинфосфа-та в качестве субстрата. Измерение активности щелочной фосфатазы (ЕС 3.1.3.1.) проводили на автоматическом биохимическом анализаторе фирмы «Nittek» модель «Super Z-818». В основе лежит метод Бессея-Лоури-Брока с п-нитрофенилфосфатом натрия в качестве субстрата. Измерение активности кислой фосфатазы (ЕС 3.1.3.2.) также проводили на автоматическом биохимическом анализаторе фирмы «Nittek» модель «Super Z-818». В основе лежит метод Бессея-Лоури-Брока с п-нитрофенилфосфатом натрия в качестве субстрата, но в отличие от метода определения щелочной фосфатазы в субстратно-буферной смеси используется цитратный, а не глициновый буфер. Активность лактатдегидрогеназы (ЕС 1.1.1.27.) определяли унифицированным методом по реакции с 2,4-динитрофенилгидразином (Севела-Товарека).
Методом иммуноферментного анализа в образцах влагалищной жидкости проводили определение лактоферрина. В работе были использованы коммерческие иммуноферментные тест-системы «Лактоферрин-стрип» (ЗАО «Вектор-Бест»). Определение проводили на спектрофотометре «Униплан». Для калибровки и внутренних стандартов был использован препарат человеческого лактоферрина выделенный и очищенный по методу А. А. Николаева.
Определение концентрации всех низкомолекулярных органических веществ
(мочевины, мочевой кислоты, креатинина, билирубина, глюкозы, триглицеридов) в исследуемых образцах влагалищной жидкости проводили при стандартных условиях на автоматическом биохимическом анализаторе «Alcyon Analyzer - 300».
Определение концентрации ионов кальция и магния во влагалищной жидкости проводили на автоматическом биохимическом анализаторе фирмы «Nittek» модель «Super Z-818».
