Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Особенности биохимического состава и физико-химических свойств суставного хряща человека в контроле и остеоартрозе 11
1.1. Структурные особенности суставного хряща 11
1.2. Современные представления о структуре и функциях коллагена хрящевой ткани 17
1.3. Организация протеогликанов матрикса хряща 25
1.4. Изменения биохимического состава хряща при остеоартрозе.. 28
Глава 2. Влагообменные процессы в хрящевой ткани 36
2.1. Общие закономерности поглощения воды биополимерами... 36
2.2. Роль воды в структурной организации коллагена 40
2.3. Влияние гликозаминогликанов на водопоглощающую способность матрикса хряща 46
2.4. Особенности состояния воды в матриксе хряща 48
Экспериментальная часть.
Глава 3. Материалы и методы исследования 53
3.1. Материалы исследования 53
3.2. Биохимические методы исследования 56
3.2.1. Выделение протеогликанов... 56
3.2.2. Определение уроновых кислот 57
3.2.3. Определение гексозаминов 57
3.2.4. Определение оксипролина 58
3.2.5. Определение белка по методу Лоури-Фолина 58
3.2.6. Фракционирование коллагена хряща 59
3.2.7. Определение степени гликозилирования коллагена хряща 59
3.2.8. Определение устойчивости структуры нерастворимой фракции коллагена хряща к действию денатурирующих агентов 60
3.2.9. Определение ферментативной устойчивости коллагена хряща 60
3.2.10. Гель-хроматография углеводного и белкового компонентов хряща 61
3.3. Акваметрические и калориметрические методы определения содержания воды в биополимерах 62
3.3.1. Калориметрический метод оценки состояния воды в хрящевой ткани 62
3.3.2. Метод определения сорбции паров воды 63
3.3.3. Титриметрическое определение воды с реактивом К.Фишера 66
3.4. Статистическая обработка результатов 66
Результаты исследования и их обсуждение.
Глава 4. Биохимические характеристики суставного хряща 67
4.1. Изменения биохимических характеристик протеогликанов хряща при остеоартрозе 67
4.2. Изменения биохимических характеристик коллагена хряща при остеоартрозе 70
4.2.1. Протеолитическая устойчивость коллагена хряща при остеоартрозе 70
4.2.2. Изменение степени гликозилирования коллагена при остеоартрозе 73
4.2.3. Изменение фракционного состава коллагена хряща при остеоартрозе 77
4.2.4. Устойчивость коллагена хряща к действию денатурирующих агентов 80
Глава 5. Изменения влагообменных процессов при остеоартрозе 81
5.1. Особенности состояния воды в хряще 81
5.2. Гидратация основных компонентов матрикса хрящевой ткани 88
5.3. Влагообменные процессы в модельных системах матрикса хряща 94
Глава 6. Биохимический состав и характер влагообменных процессов поверхностного слоя хряща 104
Глава 7. Особенности модифицирующего действия формальдегида на биохимический состав и влагообменные процессы
остеоартрозного хряща 108
Выводы
Список сокращений 114
Список литературы 115
- Структурные особенности суставного хряща
- Влияние гликозаминогликанов на водопоглощающую способность матрикса хряща
- Определение устойчивости структуры нерастворимой фракции коллагена хряща к действию денатурирующих агентов
- Изменения биохимических характеристик протеогликанов хряща при остеоартрозе
Введение к работе
Актуальность проблемы. Остеоартроз (ОА) является одной из распространенных форм суставной патологии [90, 140, 331]. О большом интересе к этой проблеме свидетельствуют многочисленные работы с использованием биохимических, физико-химических, морфологических и других методов исследования [180, 224, 228, 297].
Биохимический состав хрящевой ткани и ее -физико-химические свой
ства практически полностью определяются ее матриксом, основными ком
понентами которого являются коллагеновые фибриллы, погруженные в ин-
тегративно - буферную среду, состоящую из протеогликанов и воды, в кото
рой растворены неорганические и органические соли [23, 48, 75, 285]. Изме
нения биохимических характеристик основных компонентов хряща сопро
вождается увеличением влагосодержания и ухудшением его механических
- свойств [226, 227]. Однако, до сих пор ряд аспектов развития и течения этой
патологии окончательно не установлены.
В частности, недостаточно изучены структурные изменения основных биохимических компонентов матрикса хряща и их взаимосвязь с нарушением влагообменных процессов при остеоартрозе [74, 248, 310].
При изучении особенностей гидратации хрящевой ткани недостаточное внимание уделялось участию в этом процессе отдельных структурных компонентов, количество и биохимические характеристики которых меня-"eei:?:' ''-'ibT:^''^w':&cf^u^rrpbM''X25T^V^^]- Сочетание избыточной гидратации и обеднение матрикса хряща протеогликанами представляется парадоксальным, так как считается, что высокая гидрофильность протеогликанов обеспечивает гипергидратированное состояние хряща [244, 294].
Высказывается предположение, что одной из причин повышения вла
госодержания хряща при остеоартрозе является изменение структуры колла-
Ь гена. До сих пор эта гипотеза не получила подтверждения [323]. Однако, для
обеспечения -необходимых амортизационных функций важно не только необходимое содержание воды в ткани, но и определенная форма ее связи со структурными биополимерами хряща. В литературе приводятся немногочисленные и противоречивые данные о природе воды, содержащейся в хряще, о количественном соотношении различных форм тканевой воды и ее зависимости от изменения основных биохимических компонентов в хрящевой ткани при остеоартрозе [227, 323].
Остаются недостаточно изученными вопросы, связанные с изменениями биохимических свойств и влагообменных процессов хрящевой ткани при ее консервации и, в частности, при формальдегидной фиксации, которая используется в трансплантологии, а также при длительном хранении биоматериалов [13]. При этом, важным является вопрос, как структурные и биохимические изменения хряща при остеоартрозе отражаются на стабильности структуры коллагена и влажностных характеристиках матрикса хряща при обработке консервирующими реагентами.
Такие исследования представляют также интерес при подборе препаратов, обладающих хондропротекторным действием, так как для коррекции деструктивных нарушений суставного хряща часто используются препараты, содержащие альдегидные группы [57].
Сведения об энергии и формах связи воды с биополимерами ткани, наряду с биохимическими характеристиками, могут быть полезными при установлении причин возникновения и развития данной патологии, в поиске методов диагностики и разработке способов коррекции мётШсШйчёёкйх нарушений хрящевой ткани.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение изменений биохимических и влагообменных характеристик суставного хряща человека при остеоартрозе.
В задачи исследования входило:
разработать комплексный подход оценки состояния коллагена, гликоза-миногликанов и различных форм связанной с ними воды в суставном хряще человека при патологии и консервации;
изучить изменение биохимических характеристик коллагена и протеогли-канов хряща при остеоартрозе;
исследовать изменение влагообменных процессов в хрящевой ткани и ее модельных системах при остеоартрозе;
изучить влияние дезорганизации углеводно-белковых комплексов in vitro на биохимический состав и природу воды в хрящевой ткани;
исследовать биохимический состав и влагообменные процессы в поверхностном слое суставного хряща;
провести сравнительные исследования влияния формальдегидной фиксации на биохимические свойства и влагообменные процессы остеоартроз-ного хряща.
Положения, выносимые на защиту.
Разработана научно-методическая основа комплексной оценки биохимических характеристик и влагообменных процессов тканей животного происхождения.
При остеоартрозе происходит уменьшение протеолитической устойчивости коллагена, степени его гликозилирования, количества комплексов протеогликанов хряща и их разрушение.
Дезорганизация основного вещества хрящевой ткани приводит к увеличению содержания воды и изменению степени ее связывания с биополимерами матрикса хряща.
На модельных системах коллаген - гликозаминогликаны (ГАГ) показана возможность регулирования соотношения фракций свободной и связанной воды за счет введения в систему различных количеств ГАГ, что по-
зволяет научно обосновать использование медикаментозных препаратов для лечения заболеваний, связанных с потерей гликозаминогликанов.
5. Большая влагоемкость поверхностного слоя хряща является результатом повышенного содержания фракции связанной воды. Истончение и разволокнение поверхностного слоя при остеоартрозе вносит свой вклад в изменение влагообменного баланса хрящевой ткани и, в частности, в уменьшение фракции связанной воды.
6: Образование поперечных сшивок при формальдегидной фиксации, о чем свидетельствует увеличение протеолитической устойчивости, в определенной мере восполняет межструктурные связи, утраченные при остеоартрозе, и приводит к некоторому уменьшению количественного соотношения свободной и связанной воды.
Научная новизна. Изучены закономерности изменения биохимического состава суставного хряща и влагообменных процессов при остеоартрозе, которые являются одной из актуальных проблем фундаментальной и прикладной биологии, травматологии, биотрансплантологии и косметологии.
Использование комплекса биохимических и акваметрических методов исследования позволило оценить взаимозависимость изменений некоторых биохимических характеристик основных компонентов суставного хряща и состояния воды при остеоартрозе, а также при дезорганизации белково-полисахаридного комплекса in vitro и формальдегидной фиксации.
Впервые дана количественная оценка различных форм воды, содержащейся в суйтавйотй хряще, природа и соотношение которых меняются при разрушении и восстановлении внутри- и межмолекулярных связей биополимеров матрикса хряща. Вода, находящаяся в межструктурных пространствах (кластерах) матрикса остеоартрозного хряща, ограничена деполимеризован-ными биополимерами коллагена и обладает большей подвижностью, чем в контрольном хряще. Выявлены отличительные особенностиности гидрата-
ции суставного хряща различной локализации и его основных компонентов (коллаген, хондроитинсульфат натрия, гиалуронат калия).
Высказывается предположение, что для обеспечения нормальной биомеханической функции хряща необходим определенный оптимум соотношения фракций свободной и связанной воды, который в значительной мере зависит, как от первичной, так и от надмолекулярной организации основных структурных компонентов хрящевой ткани.
Установлена наличие-в компонентах хрящевого матрикса. нескольких фракций связанной воды, различающихся по степени связывания. При максимальной относительной влажности в коллагене практически вся вода связана с активными группами биополимеров, а в гликозаминогликанах помимо связанной воды обнаружены, по крайней мере, две кристаллические формы замораживаемой, то есть свободной воды. Очевидно, перераспределение фракций связанной и свободной воды в пользу последней при остеоартрозе является результатом возникающего при этом дефицита гиалуроновой кислоты. Истончение и разволокнение поверхностного слоя может внести свой вклад в изменение влагообменного баланса хрящевой ткани при остеоартрозе и, в частности, в уменьшение фракции связанной воды.
В результате разработанного научно-методического подхода можно получить данные о биохимических характеристиках, энергетических формах и связях воды в биологических тканях и установить характер их изменений при патологии.
расширяют современные представления об изменении состояния биохимических компонентов и влагообменных процессов суставного хряща бедренной кости человека при остеоартрозе.
Снижение структурной стабильности коллагеновых молекул, разрушение углеводно-белковых комплексов, уменьшение фракции связанной и повышение количества свободной воды взаимозависимы и могут быть от-
несены к причинам, вызывающим разволокнение коллагеновой сети при остеоартрозе и уменьшение ее устойчивости к механическим нагрузкам.
Образующиеся при обработке раствором формальдегида метиленовые мостики восполняют в определенной мере межструктурные связи в биополимерах матрикса хряща, утраченные при остеоартрозе. Образующиеся при этом замкнутые пространства (кластеры), ограниченные "сшитыми" биополимерами, внутри которых заключена вода, уменьшают ее подвижность, что должно способствовать повышению амортизационных функций воды в составе матрикса хряща.
Высказано предположение, что перераспределение фракций связанной и свободной воды в пользу последней при остеоартрозе является результатом возникающего при этом дефицита гиалуроновой кислоты и может быть учтено при разработке методов лечения остеоартроза.
Показанная на модельных системах коллаген - гликозаминогликаны возможность регулирования соотношения фракций свободной и связанной воды за счет подбора различного содержания гликозаминогликанов позволяет научно обосновать использование медикаментозных препаратов хондро-протекторного действия, стимулирующих репаративные процессы для лечения заболеваний, связанных с потерей гликозаминогликанов, таких как: "Инолтра", "Структум", "Дона", "Хондроксид", в которых основными действующими веществами, способствующими регенерации хряща являются хондроитинсульфаты, глюкозаминсульфаты и гиалуронаты. Результаты ис-следования влияния обработки хрящевой ткани сшивающими реагентами (на примере формальдегида), дают возможность обосновать поиск новых препаратов, в составе которых имеется альдегидная группа [140].
Исследование взаимозависимости влагообменных процессов и биохимических характеристик, наряду с морфологическими и другими показателями, имеют важное значение при диагностике и разработке способов коррекции метаболических нарушений хрящевой ткани.
Данная работа соответствует одному из приоритетных направлений исследований по отделению медико-биологических наук РАМН (утверждено в 1999 г.): "Изучение иммунных, генетических, молекулярных, биохимических, физиологических основ процессов жизнедеятельности в норме и патологии с целью профилактики заболеваний, их диагностики, лечения и восстановления нарушенных функций", а также программы Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в Женеве на 2000-2001 годы: "Разработка стратегии улучшения здоровья тт качества жизни у лиц с патологией коетно-суставного аппарата" [73].
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 7 работ. Основные результаты доложены и обсуждены на ежегодных конференциях "Биомедицинские технологии" Межведомственного научного Совета по медицинской биотехнологии, г. Москва, 2000 г., 2001 г.; на Всероссийской конференции с международным участием "Патофизиология и современная медицина", г. Москва, 2000 г.; на VIII Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", г. Москва, 2001 г. Апробация работы проведена на конференции Научно-исследовательского и учебно-методического Центра биомедицинских технологий ВИЛАР.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 146 страницах, содержит 11 таблиц, 26 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы (2 гл.), экспериментальной части (5 гл.), выводов и списка литературы, включающего 332 источника, из которых 259 зарубежных.
Структурные особенности суставного хряща
Хрящевая ткань является одной из разновидностей, соединительной ткани и выполняет опорную функцию. Особенности структуры хряща на молекулярном и морфологическом уровнях обеспечивают его прочность и эла-стоупругие свойства [97, 112, 138, 249].
Хрящ состоит из клеток (хондроцитов) и межклеточного вещества (матрикса), содержащего волокна и основное вещество [30, 85]. В зависимости от преобладания коллагеновых или эластических волокон и степени их маскировки основным веществом различают гиалиновый, эластический и волокнистые хрящи [48, 56]. Известно, что суставной хрящ относится по общепринятой классификации к гиалиновым хрящам. Структура матрикса в настоящее время подробно и полно изучена на молекулярном, надмолекулярном и тканевом уровнях [110, 160, 179, 241, 316]. Матрикс хряща человека состоит из волокнистого коллагенового каркаса, погруженного в гель протеогликанов (ПГ) и воды, в котором растворены органические и неорганические соли [186, 261]. Соотношение коллагена, протеогликанов и воды в хряще составляет (20 - 25 %):(5 - 10 %):(65 - 85 %) [85, 302].
В суставном хряще человека интерстициальное (межволокнистое и межклеточное) пространство представляет единую систему своеобразных каналов, стенки которых образованы коллагеновыми фибриллами [114]. Каналы заполнены основным веществом - интегративно-буферной метаболической средой, имеющей гелеобразную консистенцию, главными компонен # тами которой являются вода и протеогликаны [175, 317]. Эта система явля 12 ется вторым звеном микроциркуляции. Правомерно также рассматривать ее как пути перемещения не только метаболических продуктов, но и тканевой жидкости под действием механического давления, капиллярных и осмотиче ских сил [149], что во многом определяет метаболизм соединительной ткани и ее биомеханическую функцию. В свою очередь, свойства основного веще ства определены, главным образом, количественным и качественным соста вом ПГ, их структурной организацией в нативной ткани и взаимосвязью с коллагеновыми фибриллами [114,259]. — -- Учитывая, что в хрящевой ткани клетки составляют всего 2 %, химический состав хряща и его физико-химические свойства практически полностью определяются матриксом. Коллаген является основным компонентом матрикса хрящевой ткани и отличается необычным полиморфизмом [56, 60]. В нормальной хрящевой ткани доминирует коллаген типа II, молекулы которого составляют 85 - 90 % от их общего количества [120]. Наряду с коллагеном типа II, в матриксе хряща может присутствовать коллаген I типа и III типа, функция которых в настоящее время недостаточно изучена [41, 219]. Уникальная комбинация молекул коллагена с гликозаминогликанами, структурными гликопротеинами, мукополисахаридами представлена фибриллами, архитектоника которых тесно связана с выполнением физиологической функции внеклеточного матрикса хрящевой ткани.
Волокна коллагена типа II в матриксе хряща разнообразны по диаметру, но, как правило, они тоньше, чем волокна коллагена типа І в сухожилиях или дерме и не"образуют плотных пучков [2567 237]. Такая надмолекулярная организация способствует связыванию воды и тем самым поддержанию ги-пергидрации ткани [328]. Коллагеновый каркас матрикса выполняет структурную, опорную, стабилизирующую роль по отношению к протеогликанам и воде [50, 169], находящимся в состоянии геля в петлях волокнистого каркаса. Кроме того, коллагеновые волокна матрикса расположены по принципу трехмерной сети и обладают большой упругостью по отношению к силам растяжения и играют основную роль в растяжения и играют основную роль в ограничении степени набухания [90, 149]. Густая сеть тонких коллагеновых волокон располагается в очень концентрированном водном растворе протеогликанов, именуемым гелем [264]. Разделить этот вязкий гель на его компоненты удается с большим трудом, что свидетельствует о прочной связи коллагеновых фибрилл и агрегатов протегликанов, которая с возрастом увеличивается [105, 228].
Обращает на себя внимание необычайно высокая концентрация в хрящевом" матриксё" Гёксозаминов и уроновых кислот. Гликозаминогликаны представлены главным образом сульфатированными разновидностями -хондроитин-4-сульфатом, хондроитин-6-сульфатом и кератансульфатом. Кроме того, в матриксе содержится несульфатированный гликозаминогли-кан - гиалуроновая кислота [176]. На ее долю приходится лишь 1 % уроновых кислот матрикса, но она играет важную роль в формировании надмолекулярной структуры матрикса.
В хрящевом матриксе присутствуют и гликопротеины - белки, к полипептидным цепям которых присоединены небольшие углеводные группы (олигосахариды), состоящие из гексозамина, а также гексоз [98]. Гликозами-ногликаны не существуют в соединительной ткани в свободном состоянии. Как правило, они связаны с белками [79]. Не составляет исключения и гиалуроновая кислота, поскольку даже наиболее очищенные ее препараты содержат около 2 % белка [261]. Все остальные гликозаминогликаны входят в состав протеогликанов - комплексных макромолекул, построенных из стержня,"" к" которому прикреплены полипептидныё" цепочки ГАГ (хонд-роитинсульфаты - 80-90 % и небольшая часть кератансульфаты). На рис. 1 приведена схема строения агрегата протеогликанов [48].
Влияние гликозаминогликанов на водопоглощающую способность матрикса хряща
При объединении коллагеновых фибрилл в первичные, а затем и во вторичные волокна они не сливаются друг с другом и даже полностью не сближаются. Наличие промежутков между фибриллами объясняется тем, что они окружены водно-гликозаминогликановым слоем [309].
Эти прослойки между фибриллами и волокнами коллагена экранируют и скрепляют элементы структуры белка, что приводит к частичному обезвоживанию в стадии образования. Это объясняется интенсивным осмотическим всасыванием воды из окружающих фаз посредством гликозаминогликанов (ГАГ) [42]. Предложено несколько структурных моделей взаимодействия коллагена с белково-полисахаридными комплексами. В одних рассматривается взаимодействие коллагена только с протеогликанами, в других - в структуру включены и гликопротеиды [24, 325]. Доказано, что почти все аминогруппы глюкозамина, содержащегося в гепарине, сульфатированы. В отличие от гепарина в гепарансульфате большая часть аминосахаров аце-тилирована по аминогруппе [21, 23]. Этому показателю уделяется большое внимание, так как от степени сульфатированности зависит величина сорбци-онной емкости протеогликана.
Полиэлектролитный (полианионный) характер ГАГ определяет их способность связывать огромное количество воды. Показано, что объем воды, связываемый гиалуроновой кислотой в 10000 раз превышает объем ее сухого вещества [312]. В результате исследований было установлено, что хондроитин и гиалуроновая кислота, лишенные сульфатных групп характе ризуются низким содержанием аномальной воды по сравнению с другими мукополисахаридами (МПС), в состав которых входит сульфатная группа [103]. Показано, что содержание незамерзающей воды, то есть связанной с МПС, составляет от 0,4 до 0,7 г/г сухого биополимера. Такое содержание воды характерно для большинства гидрофильных полимеров. Следовательно, огромное количество воды, удерживаемое МПС, является связанной и, очевидно, располагается в кластерах, которые образуются разветвленными мо-лёкуЛамйМПС. Роль отдельных ГАГ во взаимодействии хряща с водой еще окончательно не выяснена. Однако, в настоящее время, способность поглощать и транспортировать воду хряща связывают с гиалуроновой кислотой, состоящей из повторяющихся фрагментов глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина [32, 103]. Ее молекулярный вес колеблется от 2х104 до 8x106 Да и зависит от участка ткани, из которой она выделена [128]. Хотя факт прямой зависимости между количеством ГАГ в ткани и степенью ее гидратированности является доказанным [213], имеются и некоторые факторы, нарушающие эту закономерность. Так, показано, что в дегенеративном суставном хряще с пониженным содержанием ГАГ, количество воды увеличено по сравнению с нормой [36].
Изотермы сорбции паров воды ГАГ имеют форму типичных изотерм многослойной адсорбции, для анализа которых используют уравнение Бру-науэра-Эммета-Теллера (БЭТ) [27]. Показано, что количество гидратносвя-занной воды увеличивается со степенью сульфатирования ГАГ [186]. По сорбционной способности ГАГ при низких значениях относительной влажности можно расположить в следующем порядке: гепарин = х-6-с = дерма-тансульфат = х-4-с. Однако, при высоких значениях относительной влажности х-6-с связывает больше влаги, чем гепарин. Величины otm, подсчитанные из уравнения БЭТ, выраженные в молях НгО на моль дисахаридной повторяющейся единицы, составляют: 2,4 - для гепарина, 2,2 - для х-6-с; 1,9 - для дерматансульфата и 1,2 - для х-4-с. Следует подчеркнуть, что сорбционная способность ГАГ изучалась, в основном, на изолированных препаратах, в то время как в матриксе хряща значительная часть активных групп ГАГ связана с белком. Очевидно, сорбционная емкость изолированных препаратов и механизм их взаимодействия с водой иной, чем у целого хряща.
Из анализа литературных данных видно, что роль гликозаминоглика-нов во влагопоглощающей способности хрящевой ткани значительна, однако механизм взаимодействия их с водой еще не совсем ясен.
Вода является одним из основных компонентов суставного хряща человека и составляет 60-80 % массы ткани. В связи с этим принято говорить о гипергидратированном состоянии хряща [153, 226, 227]. Гипергидра-тированное состояние матрикса является, в конечном счете, решающим фактором в формировании физико-химических и биомеханических свойств хряща [225]. С помощью радиохимических и биохимических методов были охарактеризованы топографические колебания содержания воды в суставном хряще человека. Показано, что в поверхностоной зоне содержится наибольшее количество воды, которое уменьшается в последующих зонах. При этом содержание гликозаминогликанов в этом же направлении увеличивается [280].
Высокое содержание воды в значительной мере обеспечивается полианионной природой ГАГ, их насыщенностью свободными кислотными (карбоксильными и сульфатными) группами, несущими одноименный, отрицательный заряд [239]. Уровень гидратации хряща определяется балансом между обводненностью (силой набухания) протеогликанов и упругостью кол-лагенового каркаса [223]. С помощью меченой воды было показано, что большая часть воды в хрящевой ткани свободно обменивается и полностью доступна для малых молекул [182].
Вода, как практически несжимаемая жидкость, обеспечивает достаточную жесткость хряща, а ее перемещения обусловливают равномерность распространения нагрузок, а также их ослабление и обратимость [191].
Лишь небольшое количество воды связано с биополимерами хряща и является неподвижной. Поскольку протеогликаны способствуют удержанию воды в хрящевом матриксе, становится понятным существование выраженной положительной корреляции между концентрацией в хряще протеоглика-нов и его прочностью на сжатие. Чем больше отношение протеогликан/вода, тем ниже степень потери воды при контактном давлении. Содержание внут-рифибриллярной воды в коллагене хряща человека измерялось по экваториальным расстояниям при различном уровне осмотического давления [225]. Показано при этом, что гидратация коллагеновых фибрилл, определяемая, как масса внутрифибриллярной воды не постоянна и является функцией осмотического давления. Отношение между внутрифибриллярным и межфибриллярным давлением обусловлено активностью протеогликанов в межфибриллярных пространствах и зависит от изменений внешнего давления. При повышении давления происходит снижение общей и межфибриллярной воды в хряще. В ряде работ показано, что нормальный хрящ сжимается и возвращается обратно (восстанавливается), когда начальный объем хряща уменьшается не более чем на 5 % [169, 227, 291]. Сетка коллагена действует как сила, удерживающая протеогликаны в широком влажностном интервале [153, 165]. При увеличении нагрузки на хрящ биосинтез протеогликанов уменьшается, а содержание воды увеличивается [315].
Определение устойчивости структуры нерастворимой фракции коллагена хряща к действию денатурирующих агентов
К 5 мг лиофильно высушенного образца коллагена добавляли 3 мл 8 М мочевины и нагревали при 100 С на водяной бане в течение 30 мин. Затем смесь отфильтровывали и в гидролизате определяли содержание оксипроли-на[193].
Для определения ферментативной устойчивости коллагена хрящевой ткани использовали образцы хряща с предварительно удаленными протеог ликанами. Ферментный протеолиз коллагена проводили препаратами фирмы і - u Serva: бактериальной-коллагеназой (КФ 3.4.23.3), проназой и пепсином (КФ 3.24.23.1) [99, 130].
Условия ферментного протеолиза: отношение фермент : субстрат -1:10, температура 37 С, продолжительность 24 ч, буфер 0,05 М трис-НС1 рН 7,6, содержащий 0,014 М СаСЦ для коллагеназы и проназы, и 0,5 М СНзСООН для пепсина.
Контролем служила проба, не содержащая фермент. После окончания протеолиза нерастворимый белок удаляли из инкубационной смеси фильтрованием и определяли содержание оксипролина.
За 100 % было принято количество оксипролина в нативных препаратах хряща после их полного кислотного гидролиза. Продукты гидролиза характеризовали методом гель-фильтрации на колонке с Toyopearl-HW 55 [295].
Образцы хряща с удаленными протеогликанами после ферментного и щелочного гидролиза, а также растворы, полученные после обработки образцов детергентом (8 М мочевина, 30 мин, при 100 С) наносили на колонку Toyopearl-HW 55. Размер колонки 60 х 0,8 см, элюирующий раствор -0,lMNaCl, скорость элюции-30 мл/ч, регистрировали поглощение при X = 215 нм. Для исследования продуктов гель-фильтрации на выходе колонки через каждые 6 мин собирали фракции, в которых определяли содержания оксипролина и белка. На основании полученных результатов строили профили элюции.
Калибровочную кривую строили по маркерам: Dextran Blue 2000 кДа, Albumin 67 кДа, Chymotrypsinogen 25 кДа.
Для качественной характеристики агрегатного состояния протеогли-канов, выделенных из хряща, также применяли метод гель-хроматографии на колонке Toyopearl-HW 75 размером 45 х 1,6 см, элюирующий раствор -0,1 М NaCl [1]. Скорость элюции - 30 мл/ч, регистрировали поглощение при А, = 278 нм. Собирали фракции через каждые 8 мин, в которых проводили определение содержания уроновых кислот и белка при оптической плотно 62 сти X = 278 -нм. На основании полученных результатов строили профили элюции [1]. Калибровочную кривую строили по маркерам Dextran Blue (2000 кДа), Ferritin (450 кДа), Cytochrome С (12,3 кДа).
Для изучения особенностей гидратации хрящевой ткани была впервые применена комплексная методология, включающая акваметрические методы: дифференциальную сканирующую калориметрию (ДСК), сорбционный метод исследования и титрование с реактивом Фишера [34].
Калориметрические исследования фазовых переходов воды, связанных с ее испарением и плавлением проводились на дифференциальном сканирующем калориметре фирмы "Perkin-Elmer", модель DSC-2. Точность при определении температуры составляла ±0,1 %.
Образцы тканей (5-7 мг) помещали в специальные алюминиевые кю веты и запечатывали. Термограммы изучались в температурном интервале от J - 30 С до 350 С в токе азота"при чувствительности 10 - 20 мкал/сек и ско рости сканирования 10-20 градусов/мин. Фазовые превращения (испарение и плавление воды) в исследуемых образцах регистрировались самописцем в виде эндо- и экзотермических пиков, по площади которых количественно оценивали тепловые эффекты превращений.
Изменения биохимических характеристик протеогликанов хряща при остеоартрозе
Из приведенных данных следует, что по содержанию гликозаминогли-канов образцы суставного хряща различной локализации практически не отличаются между собой.
При остеоартрозе хряща головки бедра количество гексозаминов и уроновых кислот уменьшается в 1,5 и 1,2 раза, соответственно.
Из приведенных данных следует также, что в результате обработки гуанидинхлоридом из контрольного хряща удаляются 56 % гексозаминов и 36 % уроновых кислот, а из остеоартрозного хряща 73 % и 40 %, соответственно. Полученные данные свидетельствуют о том, что в результате остеоартроза связь между коллагеном и протеогликанами ослабляется.
Результаты оценки агрегатного состояния протеогликанов, выделенных из контрольного и патологически измененного хряща, с помощью метода гель-фильтрации, приведены на рис. 6 (а, б, в). На графиках отчетливо видно уменьшение молекулярных масс углеводного и белкового компонентов в препарате патологического хряща.
Так, на рис. 6 а показаны достоверные различия по величине и соотношению основных пиков УФ-поглощающего материала, выходящего с колонки при 278 нм. По сравнению с контролем для патологического хряща характерно резкое уменьшение пиков и преобладание низкомолекулярных компонентов. Оценка количества уроновых кислот во всех фракциях элюата контрольных образцов хряща (рис. 6 б) показала, что протеогликаны представлены одним пиком с молекулярной массой 10 млн Да, а при остеоартрозе основная часть уроновых кислот определяется в виде широкого гетерогенного пика с молекулярной массой от 200 тыс Да до 5 млн Да. При анализе содержания общих белков во всех фракциях элюата выявлено (рис. 6 в), что большая часть их в остеоартрозном хряще находится в диапазоне молекулярных масс 10000 - 30000 Да, а в контрольном хряще молекулярная масса общих белков составляет более 5 млн Да.
Изменение степени агрегации протеогликанов хряща. Характерные профили элюции фракций хряща после экстракции 4 М гуанидинхлоридом: — контроль, — остеоартроз.
Таким образом, на основании проведенных экспериментов можно сделать однозначный вывод, что при остеоартрозе происходит выраженная дезагрегация протеогликанов суставного хряща, распад агрегатов протеог-ликанов на мономеры с последующей деградацией и деполимеризацией углеводного и белкового компонентов.
В результате исследований установлено, что содержание коллагена в образцах хряща головки бедра, мыщелка и надколенника бедренной кости составляет около 55 г/100 г сухой ткани и практически не меняется при остеоартрозе.
Известно, что тип и локализация поперечных связей, а также присутствие связанных протеогликанов являются основными факторами, определяющими чувствительность коллагена к ферментному гидролизу [52]. Для оценки изменения стабильности молекулы коллагена при остеоартрозе была проведена сравнительная оценка степени гидролитической деструкции коллагена хрящевой ткани. На рис. 7 приведены результаты этих исследований.
Из представленных данных видно, что структура коллагена хряща наименее устойчива к действию специфической протеазы - коллагеназы. Проназа и пепсин разрушают этот белок в два раза слабее. При остеоартрозе резко уменьшается устойчивость коллагена хрящевой ткани головки бедра к действию коллагеназы и при этом в 1,5 раза увеличивается величина протео лиза под действием проназы и пепсина. Снижение устойчивости коллагена остеоартрозного хряща к действию коллагеназы является показателем того, что при патологии наряду с отщеплением телопептидных участков коллагена происходит ослабление межмолекулярных поперечных связей, находящихся в спирализованной части молекул коллагена.
