Введение к работе
Актуальность темы.
Огромное разнообразие опухолей, в сочетании с генетической стабильностью и связанной с ней высокой приспособляемостью опухолевых сток, осложняет проблему лечения злокачественных новообразований. В последние пы внимание ученых привлекают физиологические механизмы, воздействуя на торые препаратами, обладающими сравнительно низкой токсичностью, возможно лностью блокировать, или хотя бы замедлить рост злокачественных івообразований. Одним из таких механизмов, бесспорно, является ангиогенез.
-. Ангиогенез определяется как процесс ответвления новых капилляров от нее существуюшмх кровеносных сосудов. Ангиогенез практически не происходит в юрмировавшемся здоровом организме, однако сопровождает целый ряд тологических процессов. Наболее яркими примерами являются атеросклероз венная болезнь , некоторые аутоиммунные заболевания.
Данные, накопленные за последние несколько десятилетий, убедительно жазывают небходимость ангиогенеза для роста подавляющего большинства окачественных опухолей. Капиллярная система первоначально развивается в іилежащих тканях; которые позднее замещаются клетками опухоли. Такая лиллярная сеть формируется из клеток нормального эндотелия, однако отличается нормальной по морфологии, плотности, и проницаемости сосудов. Плотная сеть лилляров снабжает растущую опухоль кислородом и необходимыми питательными ществами, позволяет выводить продукты жизнедеятельности клеток. Наличие яиллярной сети облегчает внедрение и распространение метастазирующих клеток. !ким образом, для того чтобы злокачественная опухоль превысила в толщину ^сколько слоев живых клеток, необходима специализированная система капилляров, кспериментальные данные последних лет позволяют предположить, что подобная ть образуется в ответ на определенные сигналы, вырабатываемые опухолевыми іетками. Лишенные возможности индуцировать образование новых капилляров, ;рвичные и метастатические опухоли не увеличиваются в размерах.
Механизмы индукции ангиогенеза опухолями в значительной мере (учены: большинство опухолей выделяет, так называемые, ангиогенные факторы, згорьте диффундируют в направлении близлежащих кровеносных сосудов, и, іязьіваясь с рецепторами клеток эндотелия, инициирует последовательность эоцессов, приводящих к образованию новых капилляров. Несмотря на то, что не ;е клетки опухоли одинаково активно секретируют ангиогенные факторы, рагменты опухолей, также как и клонированные линии опухолевых клеток, имулируют ангиогенез в экспериментальных системах. Существует также ряд еханизмов, косвенно влияющих на ангиогенез: прогеазы, выделяемые опухолями, лсвобожцают связанные ангиогенные факторы; макрофаги, привлеченные тухолями, выделяют дополнительные стимуляторы ангиогенеза.
Биологически активные вещества, не влияющие на рост клеток опухоли, но
нарушающие рост или целостность капиллярной сети, задерживают или прекращают развитие опухоли. Конъюгаты антител, направленных против опухолевых микрокагшлляров, с бактериальным токсином замедляют рост опухолей у мышей, с полным излечением значительной части животных. Другим примером вещества, избирательно уничтожающего делящиеся клетки эндотелия, являются антитела, связывающиеся с интегрином шгьфа-5-бета.-З на поверхности клеток , и приводящие к апоптозу и гибели клеток Напротив, стимуляторы ангиогенеза, в условиях, позволяющих избирательно воздействовать на клетки эндотелия, не затрагивая трансформиованных клеток, повышают скорость роста опухолей.
Опухоли развиваются из нормальной, здоровой ткани сформировавшегося организма, где микрокалилляры находятся в состоянии покоя. Покой подцержизается за счет преобладания анти-ангиогенных факторов над про-ангиогенными. Среды, кондиционированные культурами клеток нормальных тканей, в большинстве случаев подавляют ангиогенез. Список' ингибиторов ангиогенных процессов постоянно растет, причем большинство из них вызывает задержки роста экспериментальных опухолей. Так например, скорость роста клеток карциномы человека, с искусственно повышенным уровнем экспрессии ингибирующего ангиогенез громбоспондина (TSP), in vitro не отличается от скорости роста родительской линии. В то же время, формирование опухолей и эффективность метастазирования in vivo у них существенно понижена. Аналогичный эффект был обнаружен в клетках ангиомы мышей.
При переходе от нормальной ткани к злокачественной опухоли, на определенном этапе прогрессии должно произойти переключение ангиогенного фенотипа клеток, составляющих ткань. Исходя из того, что суммарный ангиогенный потенциал клеток'есть результирующая про- 'и анти- ангиогенных сигналов, можно предположить, что равновесие может сместиться в сторону индукции либо за счет повышения уровня положительных стимулов либо в результате понижения уровня отрицательных.
Как правило, в результате злокачественной трансформации in vitro или in
vivo, клетки приобретают способность индуцировать ангиогенез. Многие
иследователи отмечают резкое поышение экспрессии как факторов широкого спектра
действия, так и узко спещфичных для эндотелия. Активированные онкогены
влияют на ангиогенный фенотип трансформированных клеток хозяина через факторы, стимулирующие сборку капилляров de novo. Известно несколько возможных сценариев. Ряд онкогенов кодирует факторы роста, стимулирующие ангиогенез. Многие онкогены стимулируют синтез проангиогенных факторов. Так, например, ras повышает уровень экспрессии VEGF, IGF-I или TNF-a в различных биологачеких системах. Возможны также непрямые эффекты активации онкогенов через ферменты, разрушающие клеточный натрикс: в результате деградации матрикса высвобождаются индукторы ангиогенеза, ранее недоступные для эндотелия.
Список примеров контроля супрессоров над ингибиторами ангиогенеза постоянно растет. ' Неизвестный на сегодняшний день . опухолевый * супрессор регулирует синтез аналога TSP в культуре клеток ВНК. Нормальный вариант антионкогена р53 поддерживает высокий уровень экспрессии ингбитора ангиогенеза
)мбоспондина - в фибробластах и эпителии молочной железы, анти-онкоген, сализованный на коротком плече хромосомы 10 генома человека - в клетках глии. 3 регулирует также уровень неизвестного пока ингибитора, ангиогенеза, который іачивается на ранних стадиях прогрессии астроцитом человека. Аналогичный фект наблюдается в случае ретинобластомы, где анти-онкоген Rb модулирует эдукцию неизвестного ингибитора ангиогенеза.
Цель работы и задачи исследования.
Целью настоящей работы являлось изучение постепенных изменений
иогенного фенотипа культивированных клеток человека в ходе развития
бросаркомы. При этом особое внимание уделялось внеклеточным белкам,
;авлятощим развитие кровеносных сосудов, и их влиянию на формирование
>иферических. метастазов.- -".'-.
В работе ставились следующие задачи: количественный анализ про- и анти- ангиогенного потенциала
клеток фибросаркоиы на различных стадиях развитая и определение основных
белковых факторов, ответственных за кумулятивный ангиогенный фенотип, создание экспериментальной модели количественной и качественной оценки
влияния первичной опухоли на формирование удаленных метастазов, демонстрация способности анти-ангиогенного белка тромбоспондина подавлять
рост метастазов в использованной модельной.системе.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В данной работе произведен систематический анализ последовательных іенений положительных и отрицательных составляющих суммарного ангиогенного енциала клеток в ходе прогрессии злокачественной опухоли. Выявлены основные сгоры, определяющие ангиогенный фенотип клеток на различных стадиях вития опухоли. Показано, что потеря клетками способности подавлять іазование капилляров de novo является критическим условием прогрессивного та опухоли.
Обнаружено, что анти-ангиогенный белок громбоспондин, выделяемый тками первичной опухоли, попадая в кровоток, успешно задерживает рост периментально индуцированных метастазов на периферии организма. Несмотря все возрастающий объем информации, проблема лечения" злокачественных ообразований все еще не решена окончательно. Современные методы не воляют обнаружить и своевременно устранить единичные трансформированные пси, отделившиеся от первичной опухоли. Именно в связи с этим, исследование анизмов ангиогенеза и естественных анти-ангиогенных факторов может найти жиданно широкое применение в клинической практике. Хроническое применение ибиторов. ангиогенеза после удаления первичной опухоли, могло ' бы дотвратить прогрессивный рост микрометастазов, и, тем самым, возобновление зой стадии болезни.
Апробация работы.
Материалы работы были представлены на секции по онтогенезу
метастазированшо XI Гордоновской конференции в Род Айленде в 1995г., на сесси
"Опухолевые супрессоры и метастазы" Симпозиума по количественным методам
биологии в Колд Спринт Харборе в 1996 г. и на семинаре отдела кинетик
химических и биологических процессов Института Химической .Физики РАН
Черноголовке в 1996г. "~\
Структура и объем работы.
