Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы.
1.1. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток .
1.1.1. Множественная лекарственная устойчивость, определяемая функцией белка Pgp.
1.1.2. Экспрессия Pgp в нормальных тканях и клетках
1.1.3. Экспериментальные подходы к обращению Pgp-МЛУ.
1.1.4. Роль ключевых генов, контролирующих апоптоз, в лекарственной устойчивости опухолевых клеток.
1.2. Дендритные клетки и их роль в индукции клеточного противоопухолевого ответа.
1.2.1. Дендритные клетки человека и их свойства.
1.2.2. Методы получения дендритных клеток in vitro.
1.2.3. Методы количественного определения антигенспецифических Т-лимфоцитов .
1.2.4. Опухолеспецифические антигены человека, распознаваемые Т-лимфоцитами.
1.3 Заключение.
Глава 2. Материалы и методы.
Глава 3. Результаты и обсуждение.
3.1. Характеристика исследуемых линий опухолевых клеток-мишеней.
3.1.1. Характеристика чувствительных и резистентных линий клеток-мишеней по уровню экспрессии MDR1.
3.1.2. Исследование чувствительности клеток аденокарциномы молочной железы человека линий MCF-7 и MCF-7AdrR и аденокарциномы яичнника линий SKOV3 и SKVLB к доксорубицину.
3.1.3. Исследование возможности преодоления МЛУ с помощью верапамила и направленного транспорта ДР с использованием конъюгата АФП-ДР.
3.1.4. Характеристика чувствительных и резистентных линий клеток-мишеней по уровню экспрессии белков Вс1-2 и Вах.
3.2 Получение и характеристика зрелых дендритных клеток человека.
3.2.1. Оптимизация условий получения зрелых ДК с помощью препарата "Лейкинферон".
3.2.2. Характеристика зрелых ДК.
3.3. Индукция специфических цитотоксических Т-лимфоцитов с помощью аутологических ДК и анализ их цитотоксической активности в отношении чувствительных и резистентных опухолевых клеток.
3.3.1. Индукция специфических цитотоксических Т-лимфоцитов с использованием опухолеспецифических пептидов и анализ их цитотоксической активности в отношении чувствительных и резистентных опухолевых клеток.
3.3.2 Индукция специфических цитотоксических Т-лимфоцитов с использованием лизатов опухолевых клеток и анализ их цитотоксической активности в отношении чувствительных и резистентных опухолевых клеток .
3.3.3. Индукция специфических цитотоксических Т-лимфоцитов с использованиемсуммарной опухолевой РНК и анализ их цитотоксической активности в отношении чувствительных и резистентных опухолевых клеток.
3.3.4. Анализ количества антигенспецифических лимфоцитов, индуцируемых с помощью ДК, нагруженных лизатом опухолевых клеток или их РНК.
3.4. Заключение.
Выводы.
Список литературы.
- Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток
- Методы количественного определения антигенспецифических Т-лимфоцитов
- Характеристика чувствительных и резистентных линий клеток-мишеней по уровню экспрессии белков Вс1-2 и Вах.
- Индукция специфических цитотоксических Т-лимфоцитов с использованием лизатов опухолевых клеток и анализ их цитотоксической активности в отношении чувствительных и резистентных опухолевых клеток
Введение к работе
Актуальность проблемы. Недостаточная эффективность химиотерапии
злокачественных опухолей, обусловленнная низкой селективностью
противоопухолевых препаратов по отношению к раковым клеткам и развивающейся в короткие сроки устойчивостью клеток опухоли к лекарственному воздействию, является основным препятствием для успешного лечения онкологических заболеваний. Использование в современной химиотерапии комбинации лекарственных средств, принадлежащих к разным классам и действующих на разные клеточные мишени, выдвигает на первый план проблему преодоления множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) опухолевых клеток. МЛУ может определяться включением различных биохимических механизмов, характеризующих разные этапы осуществления токсического действия химиопрепарата на клетку - от ограничения накопления лекарства внутри клетки до ингибирования программы гибели опухолевой клетки [10,34]. К ним относятся повышение экспрессии генов трансмембранных транспортных белков, выводящих противоопухолевые препараты из клетки (например, Р-гликопротеина, Pgp); активация ферментов системы глутатиона, инактивирующих цитотоксические препараты; изменения генов и белков, контролирующих процессы апоптоза опухолевой клетки (р53, семейство BcI-2, IAP и др.).
Вещества различной химической структуры: блокаторы кальциевых каналов (верапамил), ингибиторы кальмодулина, стероиды, антибиотики, иммуносупрессоры, транквилизаторы способны в той или иной степени обращать МЛУ [3,64,128]. Однако клинические испытания таких модуляторов МЛУ не привели к желаемым результатам из-за их высокой токсичности [66,110]. В настоящее время на основе исследований биохимии рецептор-опосредованного эндоцитоза разрабатываются новые способы противоопухолевой терапии, которые позволяют избирательно убивать клетки опухоли и должны обращать МЛУ, обусловленную функционированием Pgp. Одной из перспективных разработок в этой области может быть система направленного транспорта, в которой в качестве вектора используется онкофетальный белок альфа-фетопротеин (АФП), рецептор которого является опухолеспецифическим белком и представлен только на раковых клетках [114,167].
В предупреждении и элиминации развившихся опухолей большие надежды связывают с развитием методов иммунотерапии [54,98,149]. Показано, что при LAK-терапии клетки, устойчивые к противоопухолевым препаратам в результате
гиперэкспрессии MDR1, могут быть чувствительны к активированным NK-клеткам [67,162,170]. Однако способность опухолеспцифических Т-лимфоцитов элиминировать опухолевые клетки с фенотипом МЛУ не изучена.
Одним из перспективных направлений в индукции специфического клеточного противоопухолевого иммунитета является разработка методологии, основанной на использовании дендритных клеток (ДК) - эффективных антигенпредставляющих клеток (АПК), обладающих уникальной способностью представлять антигены наивным Т-клеткам и вызывать их дифференцировку в антигенспецифические цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) [52,147,176]. Панель опухолеспецифических антигенов (ОСА), распознаваемых ЦТЛ, уже идентифицирована [54,31,193] и их список продолжает пополняться и известны требования, предъявляемые к ДК для эффективной индукции опухолеспецифических ЦТЛ [79,100,138,182].
В связи с этим, целью данного исследования явилось изучение чувствительности исходных и резистентных опухолевых клеток человека к действию опухолеспецифических ЦТЛ, индуцированных с помощью ДК в экспериментах in vitro.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
характеристика модельных линий опухолевых клеток человека по содержанию белковых продуктов генов MDR1, Bcl-2, и Box;
анализ чувствительности исследуемых линий опухолевых клеток человека к доксорубицину (ДР) и возможности её изменения с помощью модулятора активности MDR1 верапамила и системы направленного транспорта ДР в виде его коньюгата с АФП;
оптимизация метода приготовления зрелых ДК из фракции моноцитов периферической крови человека;
изучение эффективности индукции опухолеспецифических ЦТЛ с помощью иммуногенных ДК, приготовленных с использованием HLA-рестриктированных пептидов опухолеспецифических антигенов, лизатов и РНК опухолевых клеток;
- изучение активности опухолеспецифических ЦТЛ, индуцированных иммуногенными
ДК, в отношении чувствительных и резистентных линий опухолевых клеток человека в
экспериментах in vitro
Научная новизна работы. Впервые показано, что количество белка Вс1-2 в клетках высокорезистентных линий SKVLB и MCF-7AdrR, экспрессирующих ген MDR1, ниже, чем в исходных чувствительных клетках SKOV3 и MCF-7.
Впервые показано, что мутация, обнаруженная в гене Вах в клетках линии SKOV3, приводит к инактивации проапоптотической активности белка Вах и вносит вклад в устойчивость этих клеток к действию ДР.
Впервые показано что ЦТЛ, индуцированные с помощью ДК, нагруженных опухолевоспецифическим пептидом, лизатом или РНК чувствительных клеток высоко активны как в отношении чувствительных к ДР клеток, так и в отношении высоко резистентных опухолевых клеток, экспрессирующих ген МЛУ MDR1 и ген MDR1 в сочетании с инактивированным в результате мутации геном Вах. Практическая значимость исследования.
Оптимизирован метод приготовления зрелых иммуногенных ДК благодаря использованию препарата "Лейкинферон" в качестве источника цитокинов для индукции созревания ДК.
Выявлен нетоксичный диапазон концентраций лизатов опухолевых клеток для приготовления иммуногенных ДК.
Обнаруженная чувствительность высокорезистентных опухолевых клеток к действию ЦТЛ, индуцированных с помощью ДК, нагруженных опухолеспецифическими антигенами, позволяет рекомендовать использование данного метода иммунотерапии при высокорезистентных опухолях.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на XXV Съезде международного общества по изучению онкофетальной биологии и медицины (1997 г., Монтрё), на Международном симпозиуме "Биология клетки в культуре"(2001 г., Санкт-Петербург), на XIV Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра." (2002 г., Санкт-Петербург), на I Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия рака» (2002 г., Москва), на VII Международном симпозиуме по дендритным клеткам (2002 г., Бамберг), на III Международном симпозиуме по генетическим противоопухолевым препаратам (2002 г., Амстердам), на Седьмом и Восьмом Всероссийском форуме с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (2003 г., 2004 г., Санкт-Петербург).
Апробация работы состоялась на научном семинаре МНИИМЭ 25 октября 2004 г. Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ. Структура диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение,
выводы, список цитированной литературы, включающий 203 источника. Работа иллюстрирована 32 рисунками и 14 таблицами.
Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток
Экспрессирован в разных тканях организма по-разному - от очень низкого, неопределимого уровня (например, клетки эпидермиса, пневмоциты) до высокого (например, клетки коры надпочечника, слизистая кишечника) [113]. Степень экспрессии гена MDR1 в этих тканях различается в десятки раз. Иммунохимические исследования выявили в экспрессирующих Pgp тканях выраженную и относительно гомогенную окраску. Это относится к коре надпочечников, эпителиальным клеткам, выстилающим полости (слизистая кишечника, клетки почечных канальцев, трофобласты плаценты), а также к клеткам эндотелия сосудов мозга и яичек. Разная степень экспрессии Pgp относится и к клеткам системы кроветворения. В нормальном костном мозге стволовые клетки и ранние предшественники, несущие антиген CD34, экспрессируют функционально активный Pgp [45]. Затем по мере созревания клеток миелоидного ряда постепенно снижается как экспрессия этого белка, так и его функциональная активность [99]. Поэтому новообразования, происходящие из Pgp-экспрессирующих клеток, будут обладать предсуществующей МЛУ, а произошедшие из неэкспрессирующих Pgp клеток, изначально МЛУ обладать не должны.
Опыты с мышами, «нокаутированными» по гену MDR1, показывают, что основной физиологической функцией этого белка в организме является его защита от токсических воздействий [163]. Pgp несет «барьерные» функции, защищая лежащие ниже клетки от вредных веществ, содержащихся, например, в полости кишок. Считают, что он поддерживает необходимый уровень стероидных гормонов в надпочечниках. Характер экспрессии Pgp и белка MRP в эпителии хороидного сплетения мозга свидетельствует об их роли в функционировании гематоэнцефалического барьера [135]. По-видимому, высокая индуцибельность MDRlfPgp связана с физиологическими функциями Pgp в организме.
В связи с клинической значимостью Pgp работы по поиску путей ингибирования его активности привлекли внимание многих исследователей и фармацевтических компаний. Было найдено немало разнообразных соединений, преодолевающих в эксперименте Pgp-МЛУ: блокаторы кальциевых каналов (верапамил, нифелдипин и др.), гипотензивные средства (резерпин), антибиотики (цефалоспорины, грамицидин, пуромицин), иммуносупрессоры (в первую очередь циклоспорин и его производные) и многие другие гидрофобные препараты [157,22]. Их объединяют лишь низкая молекулярная масса, гидрофобность и наличие ароматического кольца в молекуле. Для некоторых из них (например, для верапамила) показаны связывание с молекулой Pgp и конкуренция за связывание с лекарствами - субстратами Pgp. Все эти многочисленные блокаторы Pgp найдены в опытах in vitro с использованием культур клеток, отобранных на Pgp-МЛУ. Опыты с культурами показывают, что проблема преодоления Pgp-МЛУ сложна: так, влияние верапамила на клетки с 200-кратной устойчивостью к винбластину приводило к снижению резистентности примерно вдвое, однако перекрестная устойчивость к доксорубицину почти не изменялась [24]. Клинические испытания показали, что для большинства модификаторов Pgp-МЛУ не удается получить в крови больных концентрации, необходимые для преодоления лекарственной устойчивости, так как повышение дозы дает тяжелые осложнения [157]. Разрабатываются менее токсичные и более эффективные модуляторы Pgp, к ним принадлежат производное циклоспорина PSC-833 и производное верапамила R-верапамил. С этими препаратами также не получено положительных результатов в клинике, по-видимому, потому, что чаще всего МЛУ определяется не только одним Pgp, но и другими белками. В последние годы в качестве модификаторов Pgp-МЛУ начали применять моноклональные антитела к Pgp, однако пока они находятся в стадии проверки [131,190].
К настоящему времени показано, что препараты направленного транспорта, представляющие собой конъюгаты белка-вектора с доксорубицином (ДР) обладали цитотоксической активностью в отношении некоторых клеточных линий с фенотипом MDR [77,126,127,166]. В отличие от свободного ДР, проникающего в клетку в результате свободной диффузии, перенос в клетки ДР в составе конъюгата с векторной молекулой осуществляется по механизму рецептор-опосредованного эндоцитоза и при этом не активируется Pgp-опосредованный транспорт [126,127]. В результате увеличивается накопление препарата клеткой и, соответственно, возрастает цитотоксическая активность ДР [77]. В качестве молекулярного вектора для доставки препаратов в опухолевые клетки могут быть использованы некоторые факторы роста, гормоны и онкофетальные белки, в частности, АФП. р53 и множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток.
Важнейшим элементом ответа клетки на стрессорные воздействия, в том числе на воздействие химиотерапевтических препаратов, является ген р53 и регулируемые им гены. Нормальный р53 активируется в ответ на различные повреждающие клетку воздействия, что приводит к остановке пролиферации клеток или к апоптозу. Таким образом, поврежденные клетки либо удаляются из популяции, либо у клеток появляется возможность репарировать поврежденную ДНК [12]. Изменения р53, весьма частые в опухолях, обусловливают нарушения его нормальной функции и нарушение способности клеток вступать в апоптоз или останавливаться в некоторых точках клеточного цикла в ответ на повреждение. Таким образом, нарушения функции р53 могут привести к изменениям чувствительности опухолевых клеток к воздействию химиотерапевтических препаратов, в частности к МЛУ [10,12,44].
В число индукторов, активирующих нормальный р53, входят агенты, разными способами повреждающие ДНК, изменяющие пул рибонуклеотидов в клетке, редокс-потенциал (например, накопление атомов активного кислорода в клетке), разрушение веретена деления и др. [69]. Поскольку механизмы действия ряда противоопухолевых препаратов связаны именно с такими воздействиями на клетку, многие из цитостатиков должны являться активаторами р53. Действительно, в исследовании Национального ракового института США, включившего 60 линий культивируемых опухолевых клеток и более 100 противоопухолевых препаратов, обнаружена прямая корреляция между статусом р53 в клетках и их чувствительностью к цитотоксическому действию лекарств [124]. Клетки с мутантным р53 чаще всего были более резистентными к препаратам с разным механизмом действия (например, к цисплатину и 5-фторурацилу), чем клетки, обладавшие р53 дикого типа. Эти данные свидетельствуют о существенной роли р53 в определении чувствительности злокачественных новообразований к химиотерапии.
Исследования регуляции р53 показывают, что характер модификаций, активирующих этот белок в ответ на стимулы, зависит от стрессорного воздействия, от тканевой и видовой принадлежности клеток, от типа аминокислотной замены в мутантном р53 [69]. Разные повреждающие воздействия не только разными способами активируют р53, но и эта активация осуществляется через разные сигнальные пути [69]. Особенности регуляции р53 определяют существенные различия ответа разных опухолевых клеток на одни и те же воздействия и различия в результатах влияния на р53 одних и тех же клеток разных повреждающих агентов. Белки, синтез которых контролирует транскрипционный фактор р53 (p21waf , MDM, Fas, Вах и др.), также могут влиять на чувствительность клеток к цитостатикам. Факты, полученные в пользу их значения для лекарственной устойчивости опухолевых клеток, сходны с полученными для р53. Влияние генов семейства Bcl-2 на лекарственную устойчивость опухолевых клеток.
Методы количественного определения антигенспецифических Т-лимфоцитов
При гистологическом исследовании опухолей было отмечено, что инфильтрация опухоли ДК коррелирует с увеличением выживаемости больных и снижением количества метастазов при различных опухолях - при раке эндометрия [53], желудка [189] и легкого [200]. Однако значимость этого индикатора в качестве прогностического признака не может быть абсолютной, так как обнаружено, что часто у ДК, вьщеленных от онкологических больных, снижена антигенпредставляющая способность из-за снижения экспрессии ко-стимулирующих поверхностных молекул CD80 и CD86 [48,155].
Кроме того, известно, что многие спорадические опухоли секретируют ИЛ-10, который препятствует созреванию ДК и блокирует антигенпредставляющую активность ДК для Т-лимфоцитов [196]. Созревание ДК в опухоли может блокировать фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), секретируемый многими карциномами. Этот фактор, кроме того, нарушает дифференцировку гемопоэтических предшественников в ДК [65]. In vitro показано, что опухолевые клетки секретируют факторы, подавляющие дифференцировку CD34+ предшественников в ДК. Оказалось, что такой активностью обладают интерлейкин-6 и макрофагальный колониестимулирующий фактор (М-КСФ) и, что они действуют, подавляя экспрессию рецептора ГМ-КСФ [86,108]. Поэтому подавление активности ДК в спорадических опухолях может быть одним из факторов иммуносуппрессии. Обнаружение уникальных особенностей биологии ДК и возможности регуляции активности этих клеток для использования их способности презентировать ОСА Т-лимфоцитам и индукции специфической активации ЦТЛ стало основой развития экспериментальных и клинических подходов для создания методов иммунотерапии опухолей с использованием ДК человека. Для этого были разработаны специальные методы приготовления препаратов ДК.
Незрелые ДК, находящиеся в периферической крови, обладают способностью захватывать антигены и продуцировать иммуногенные МНС-пептидные комплексы. В ответ на стимулы, индуцирующие созревание ДК, такие как цитокины воспаления (сигнал "опасность"), незрелые ДК превращаются в клетки, активно стимулирующие Т-лимфоциты (Т-стимуляторы). Одновременно такие ДК мигрируют во вторичные лимфоидные органы для индукции и стимуляции антиген-специфических Т- лимфоцитов. Изолированные из периферической крови ДК после обработки in vitro выбранным антигеном становятся зрелыми ДК и in vivo после их возврата в организм могут инициировать иммунный ответ. Эти данные позволили рассматривать ДК в качестве эффективных адъювантов для случаев отсутствия иммунного ответа на развивающуюся опухоль или вирусную инфекцию. Для развития методов и подходов к вакцинации на основе ДК необходима разработка способов приготовления больших количеств ДК in vitro из кроветворных клеток-предшественников. Такие методы были созданы и успешно адаптированы для получения ДК из костного мозга мышей. Это стало возможным после открытия того, что ГМ-КСФ является ключевым цитокином для наработки ДК in vitro.
У человека, как было отмечено выше, ДК получают либо из малочисленных С034+-предшественников ДК с помощью стимуляции их пролиферации цитокинами ГМ-КСФ и ФНО-сс или из непролиферирующих предшественников СВ14+-клеток (моноцитов) периферической крови при их культивировании в присутствии комбинации цитокинов ГМ-КСФ + ИЛ-4 [147].
Последний метод чаще всего используется в экспериментальных исследованиях и, по ряду соображений, он кажется наиболее подходящим для целей иммунотерапии. Во-первых, при этом методе отсутствует необходимость в предварительном введении больным цитокинов, таких как Г-КСФ, что приходится делать для увеличения количества С034+-клеток в периферической крови в случае их использования в качестве предшественников ДК. Во-вторых, при использовании этого метода ДК оказываются более гомогенными и дифференцированными, или зрелыми. В-третьих, показана возможность исключения чужеродных для человека белков в процессе приготовления ДК, таких как, фетальная сыворотка крупного рогатого скота и получения полностью зрелых и стабильных ДК при использовании для стимуляции созревания ДК среды, кондиционированной аутологичными моноцитами. Это очень важный момент, т.к. фетальная сыворотка постоянно является потенциальным источником опасности осложнений из-за большой вероятности контаминации микроорганизмами и высокой иммуногенности. Использование зрелых ДК для иммунотерапии предпочтительнее использования незрелых по ряду причин. Так только у зрелых ДК отсутствует рецептор М-КСФ, и они остаются стабильными в отсутствие ГМ-КСФ и ИЛ-4. Зрелые ДК в отличие от незрелых устойчивы к действию ингибирующих факторов, таких как ИЛ-10 или VEGF. Кроме того зрелые ДК обладают лучшей способностью индуцировать Т-клеточный ответ in vitro. В качестве источника С014+-клеток целесообразно использовать фракцию, получаемую при лейкаферезе, а не с помощью повторных процедур отбора периферической крови. Для контроля и идентификации ДК важно знать свойства этих клеток в полученных препаратах.
При выделении и культивировании ДК их принято характеризовать по набору поверхностных антигенов клеточной мембраны. Фенотип ДК человека зависит от их происхождения, степени очистки и стадии активации. ДК, выделенные из периферической крови, характеризуются следующим набором поверхностных антигенов: CD 14 , CMRF-44+, CD83+, CD40+, CD80/86+, RelB+. Незрелые ДК, полученные из моноцитов, характеризуются фенотипом CD14+", CMRF-44+/", CD83 RelB+, зрелые - CD 14", CMRF-44++, CD83+, CDl , CD80/86+, RelB+. Все ДК имеют лейкоцитарный антиген CD45 [90]. Определение набора таких антигенов используют для идентификации ДК. Изменение экспрессии набора поверхностных маркеров ДК в процессе дифференцировки представлено на схеме (Рис.б).
Характеристика чувствительных и резистентных линий клеток-мишеней по уровню экспрессии белков Вс1-2 и Вах.
Благодаря развитию методов клеточной биотехнологии стало возможным приготовление препаратов ДК онкологических больных в достаточном количестве для их использования в виде вакцинных препаратов аутологичных ДК.
Для стратегии генетической иммунизации ДК используются различные подходы, которые подробно анализируются в последних обзорах литературы [39,98,115,122].
Для введения антигенов в ДК используются следующие способы: 1) инкубация с пептидами ОСА [19,118,119,151-153]; 2) коинкубация с ДНК [17] или РНК [29], кодирующими нужный антиген; 3) инкубация с опухолевыми лизатами [117,125]; 4) слияние ДК с опухолевыми клетками [70] и 5) трансфекция ДК с использованием вирусных векторов, содержащих генетическую информацию об интересующем гене ОСА [25].
Эффективность каждого из рассматриваемых подходов была продемонстрирована экспериментально и некоторые из них уже используются в клинических испытаниях.
Инкубация ДК in vitro с различными рестриктированными по МНС I пептидами (peptide-pulsed DC) имеет следующие недостатки: 1) зависимость от МНС ограничивает круг лиц, для которых может быть использован этот вид терапии; 2) отсутствие известных эпитопов ОСА, рестриктированных по МНС II. При использовании пептидов простатаспецифического мембранного антигена (PSMA) для специфической активации ДК были достигнуты определенные успехи в процессе клинических испытаний вакцинации с помощью ДК [151-153].
Инкубация ДК с опухолевыми экстрактами, слияние ДК с опухолевыми клетками и использование препаратов суммарной ДНК и РНК опухолевых клеток предполагают возможность исходного получения опухолевого материала больного.
Очень интересные результаты получены с использованием препаратов опухолевой РНК. Но следует отметить, что потенциально при этом методе есть возможность презентации эпитопов, гомологичных эпитопам нормальных белков тканей человека, что может привести к развитию аутоиммунного процесса. В то же время этот метод считают крайне привлекательным из-за возможности амплификации РНК, выделенной даже из очень небольшого количества опухолевой ткани и возможности элиминации последовательностей, соответствующих нормальным тканям, с помощью специальных методов гибридизации.
Для введения в ДК генов ОСА многие авторы предпочитают использование ретровирусных векторов, так как трансфицированные ретровирусными векторами ДК смогут конститутивно экспрессировать и процессировать ОСА и длительно презентировать ОСА in vivo. При использовании ретровирусной трансфекции генов ОСА в ДК были получены специфические в отношении трансдуцированных ОСА ЦТЛ [137].
Ограничениями при использовании ретровирусных векторов для трансдукции генов в ДК являются трудности в получении супернатантов, содержащих высокие титры ретровирусных частиц, что необходимо для клинического использования, низкая эффективность трансдукции (15-20% ДК) и теоретический риск онкогенной трансформации ДК (риск, касающейся как больного, так и персонала) [122].
Аденовирусные векторы для этих целей кажутся особенно привлекательными, так как с их помощью возможна трансфекция как реплицирующихся, так и покоящихся клеток, с этими вирусами удобно обращаться и легко получать достаточно высокие титры, необходимые для их клинического применения.
Трансдукция генов ОСА в ДК позволяет в последующем индуцировать ОСА-специфические ЦТЛ. Таким образом, по-видимому, нельзя считать, что существует на сегодняшний день единый оптимальный доступный способ введения ОСА в ДК. Очень перспективным представляется использование для этих целей РНК опухолевых клеток, но этот путь может оказаться очень дорогостоящим. Наиболее доступным представляется использование лизатов аутологичных опухолевых клеток и петидов ОСА, распознаваемых ЦТЛ.
Анализ литературы позволяет заключить, что одним из наиболее перспективных методов индукции опухолеспецифических ЦТЛ является метод, основанный на использовании ДК человека, нагруженных ОСА и способа введения выбранного ОСА в ДК В этой области получены первые обнадеживающие клинические результаты и не вызывает сомнений продолжение развития этого способа противоопухолевой вакцинации и иммунотерапии. Однако данные об эффективности таких методов иммунотерапии в отношении высокорезистентных опухолевых клеток в литературе отсутствуют. В связи с этим целью настоящей работы явилось изучение чувствительности исходных и резистентных опухолевых клеток человека к действию опухолеспецифических ЦТЛ, индуцированных с помощью ДК в экспериментах in vitro.
Клетки эритролейкоза человека линии К562, Т-В-клеточной гибридомы линии Т2, аденокарциноми яичника человека линии SKOV3 (исходная линия), SKVLB (резистентная) культивировали в пластиковых флаконах ("Costar") в среде RPMI 1640 с добавлением 10% ФСК, 50 мкг/мл гентамицина при температуре 37С в СОг инкубаторе при содержании СОг 5% и влажности 95%. Клетки аденокарциномы молочной железы исходной - MCF-71 и резистентной - MCF-7Adr линии, клетки меланомы человека линии SK-MEL-1 - в среде DMEM при тех же условиях. Линия SKVLB получена в результате селекции по устойчивости к винбластину, линия MCF-7A г получена в результате селекции с использованием доксорубицина (ДР). Резистентность клеток поддерживали путем ежемесячной селекции с ДР (0.5 мкг/мл). Клетки эритролейкоза человека линии TF-1, полученной из АТСС (CRL-2003) культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия, 4,5 г/л глюкозы, 1,5 г/л бикарбоната натрия, 2 нг/мл рекомбинантного ГМ-КСФ и 10% ФСК, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
Индукция специфических цитотоксических Т-лимфоцитов с использованием лизатов опухолевых клеток и анализ их цитотоксической активности в отношении чувствительных и резистентных опухолевых клеток
Полученные результаты представлены на Рис.18. Оказалось, что через 24 часа после трансфекции клеток линии SKOV3 наблюдается гиперэкспрессия этого белка в погибших (открепившихся от подложки) к этому времени клетках и повышенный по сравнению с исходным уровень эксперессии Вах в живых клетках. Полученные результаты прямо свидетельствуют о том, что гибель клеток этой линии зависит от уровня экспрессии трансфицированного нативного гена Вах. В тоже время после селекции трансфицированных клеток уровень экспрессии Вах в клетках линии SKOV3 не отличался от контроля (Рис.10), что свидетельствует о гибели всех трансфицированных клеток. По-видимому те клетки линии SKOV3, которые были живы через 24 часа после трансфекции, но содержали повышенный уровень экспрессии Вах, погибали в более поздний период. При исследовании чувствительности к доксорубицину клеток, полученных в результате селекции в среде с пуромицином, оказалось, что чувствительность трансфицированных Вах клеток линии SKOV3, в которых отсутствовала повышенная экспрессия этого белка, не отличалась от контрольных клеток (Рис.19). Таким образом, гиперэкспрессия нативного гена Вах приводила к гибели опухолевых клеток в случае линии SKOV3.
Полученные данные о гиперчувствительности клеток линии SKOV3 к трансфекции нативным геном Вах позволяют заключить, что обнаруженная мутация приводит к инактивации проапоптотической активности белка Вах.
Присутствие инактивирующей мутации в гене Вах в клетках линий SKOV3 и SKVLB, по-видимому, вносит дополнительный вклад в их устойчивость к цитотоксическим препаратам, так как по уровню экспрессии гена Bcl-2 эти клетки не отличались от MCF-7 и MCF-7AdrR, хотя, разумеется, возможно наличие и других, не исследовавшихся нами механизмов устойчивости для этих пар чувствительных и резистентных клеток.
Таким образом, исследование выбранных нами двух пар чувствительных и резистентных опухолевых клеток показало, что эти линии клеток различаются не только по уровню экспрессии MDR1, но и по наличию инактивирующей мутации в гене Вах в клетках аденокарциномы яичника человека. Полученные результаты позволили выбрать клетки линий SKOV3 и SKVLB и линий MCF-7 и MCF-7AdrR для одновременного исследования в качестве опухолевых клеток-мишеней для сравнения эффективности элиминации чувствительных и резистентных опухолевых клеток с помощью ЦТЛ, индуцированных ДК, нагруженными опухолеспецифическими антигенами.
В настоящее время однозначно установлено, что для оптимальной индукции клеточного иммунного ответа и in vivo и in vitro необходимо использовать зрелые ДК. В качестве индукторов созревания используют среду, кондиционированную моноцитами (СКМ), содержащую ФНОа, ИЛ-ір и другие цитокины, или рекомбинантные ФНОа, ИЛ-13, Ифу [100,175], что существенно повышает стоимость приготовления ДК. В то же время в клинической практике в качестве имммунокорректора успешно применяется препарат "Лейкинферон", содержащий природный комплекс цитокинов Ифа, Ифу, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ФНОа в их естественном соотношении, синтезированных лейкоцитами из крови клинически здоровых доноров с последующим химическим обеззараживанием и очисткой [5]. Состав этого препарата аналогичен составу СКМ, что позволило предположить возможность его использования в качестве стандартного препарата для индукции созревания ДК.
Для выбора условий использования ЛФ в экспериментах по индукции созревания ДК, степень дифференцировки ДК после инкубации с этим препаратом оценивали по изменению уровня экспрессии костимулирующих молекул CD80 и CD86. Концентрацию ЛФ выбирали по его активности, которая стандартизуется по соджержанию активности Ифа в 1 мл среды. Зависимость уровня экспрессии CD80/CD86 от концентрации ЛФ и времени инкубации незрелых ДК с этим препаратом представлена в Табл.9.
Из полученных результатов следует, что все исследованные концентрации ЛФ (50-200 ЕД/мл) уже через 24 ч индуцировали созревание ДК, регистрируемое по повышению уровня экспрессии как CD80, так и CD86. При фазово-контрастной микроскопии такие клетки имели звездчатую форму и вуалевидные образования. Увеличение времени инкубации с этим препаратом до 72 ч приводило к усилению экспрессии CD80 и не влияло или даже снижало уровень экспрессии CD86. Анализируя данные, представленные в Табл. 9, можно сделать вывод, что после 72 ч инкубации ДК характеризовались более высоким уровнем экспрессии молекулы CD80, однако максимальная экспрессия CD86 наблюдалась через 24 ч. Увеличение концентрации ЛФ с 50 ЕД/мл до 100 ЕД/мл существенно не влияло на уровень экспрессии как CD80, так и CD86, но при концентрации 200 ЕД/мл через 24 ч (CD80) и через 72 ч (CD80, CD86) инкубации были получены более низкие показатели экспрессии костимулирующих молекул. Суммируя полученные данные можно заключить, что оптимальной для получения зрелых ДК является концентрация ЛФ, равная 100 ЕД/мл.
При сравнении индукции созревания ДК под действием СКМ (20%) и ЛФ (100 ЕД/мл) обнаружено (Табл.10), что ЛФ раньше (уже через 24 ч) индуцирует созревание ДК с более высоким уровнем экспрессии молекул CD80/CD86, чем СКМ. При инкубации ДК в присутствии ФНОа (50 нг/мл) наблюдается такой же уровень экспрессии молекул CD80, CD86, HLA DR и отсутствие экспрессии CD14, как и в присутствии ЛФ (100 ЕД/мл), а наиболее оптимальным было сочетание этих факторов (Табл.11). При комбинированном действии ФНОа и ЛФ отмечен наиболее высокий уровень экспрессии CD80. Для инкубации с индукторами созревания в этих экспериментах были использованы незрелые ДК, полученные на 6-е сутки культивирования с рГМ-КСФ и рИЛ-4. Полученные данные позволяют заключить, что использование ЛФ в качестве фактора, индуцирующего дифференцировку ДК, наиболее эффективно в комбинации с ФНОа. Поэтому для приготовления зрелых ДК из моноцитов периферической крови in vitro вместо СКМ использовали сочетание ЛФ (100 ЕД/мл) и ФНОа (50 нг/мл), которые добавляли к незрелым ДК на 6-е сутки инкубации.
