Введение к работе
. Актуальность проблемы.
По данным Всемирной Организации Здравоохранения онкологические заболевания являются одной из самых распространенных причин смерти на Земле. Несмотря на многолетние изучения проблемы рака, терапия онкологических заболеваний сталкивается с рядом трудностей, одной из которых является множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток к различным противоопухолевым препаратам. МЛУ опухолевых клеток, обусловленная откачкой из клеток противоопухолевых препаратов транспортными белками, является одним из главных факторов снижающих эффективность химиотерапии опухолей. Поэтому изучение регуляции экспрессии и активности транспортных белков в опухолевых клетках важно для химиотерапии опухолей.
В последние десятилетия возросло внимание ученых к изучению эффектов активных форм кислорода (АФК). В качестве мессенжеров они влияют на множество клеточных процессов, в том числе г МЛУ. В литературе существуют работы, посвященные эффекту АФК на синтез транспортных белков, ответственных за МЛУ. Однако результаты этих работ противоречивы. Показано, что АФК могут, как увеличивать (Karen I., 2000), так и снижать (Wartenberg М. et al., 2000; Wartenberg М. et al., 2003) экспрессию генов транспортных белков, ответственных за МЛУ. Противоречивость эффектов АФК на экспрессию транспортных белков обусловлена, по-видимому, спецификой опухолевых клеток, экспрессирующих разные типы транспортных белков, а также разным уровнем создаваемого окислительного стресса. Изменение экспрессии транспортных белков сказывается на МЛУ через 15-20 часов после воздействия окислительного стресса, и такие данные также существуют в литературе.
При большом количестве работ о влиянии АФК на синтез транспортных белков, ответственных за МЛУ, нами не было обнаружено работ о влиянии окислительного стресса, как на активность самих транспортных белков, так и о связанных с этим изменениях МЛУ. Эти изменения МЛУ должны быть быстрыми, в отличие от обусловленных изменением экспрессии генов.
Одним из основных условий выполнения поставленной задачи являлось количественное определение уровня АФК в клетках, поскольку при одинаковом воздействии, например перекиси водорода, уровень АФК в разных типах клеток может существенно отличаться. Кроме того, концентрация АФК в клетках зависит от состава сред, условий культивирования и т. д. Одним из наиболее чувствительных методов определения АФК в клетках является флуоресцентный: нефлуоресцирующее соединение превращается во флуоресцирующее после окисления АФК. Этот метод известен только в микроскопическом варианте, при котором результаты могут существенно искажаться за счёт фотоокисления исходного соединения. Поскольку уровень АФК в клетках значительно варьирует, а микроскопическим методом определяется АФК в отдельной клетке, то для получения среднего значения необходимо промерить достаточное количество клеток. За время этих измерений фотоокисление может существенно исказить (завысить) результат. Поэтому для определения среднего содержания АФК в клетках в различных
условиях необходимо было разработать не микроскопический флуоресцентный метод. Метод был основан на превращении нефлуоресцирующего 2',7'-дихлордигидрофлуресцеина (2',7'- дихлорфлуоресцина) во флуоресцирующий 2',7'-дихлорфлуоресцеин.
Подытоживая вышесказанное, целью данной работы было исследовать немедленный и отсроченный эффекты окислительного стресса на активность транспортных белков и МЛУ опухолевых клеток: мышиного лимфолеикоза P388VR и рака гортани человека НЕр-2. Параллельно с этим нужно было разработать метод определения АФК в клетках с помощью 2',7'-дихлорфлуоресцина диацетата и определить уровень АФК в норме и при различных воздействиях.
Задачи исследования:
1. Разработать метод определения АФК в клетках с использованием
2',7'-дихлорфлуоресцин диацетата и определить АФК в клетках в норме и при
воздействиях, вызывающих окислительный стресс (радиация, перекись
водорода).
-
Изучить влияние окислительного стресса на активность транспортных белков и лекарственную устойчивость клеток мышиного лимфолеикоза P388VR.
-
Изучить влияние ионизирующего излучения на активность транспортных белков и лекарственную устойчивость клеток рака гортани человека НЕр-2.
Практическая значимость. В работе было показано, что окислительный стресс сразу после воздействия может снижать МЛУ опухолевых клеток. Этот факт указывает на возможность увеличения эффективности химиотерапии опухолей с множественной лекарственной устойчивостью при сочетании противоопухолевых препаратов с окислительным стрессом, причём препараты должны применяться одновременно или сразу после окислительного стресса. При сочетании химиотерапии с радиотерапией следует иметь в виду, что после облучения может увеличиваться экспрессия генов транспортных белков, что приводит к увеличению МЛУ. Этот эффект развивается за время сопоставимое с длительностью клеточного цикла и применение противоопухолевых препаратов в это время после облучения менее эффективно, чем без облучения.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на конференциях: «V съезд по радиационным исследованиям», 2006 (Москва); «The 35th Annual Meeting of the European Radiation Research Society», 2006 (Киев).
Публикации. По результатам работы опубликовано 5 статей в рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка, 1 таблицу и список литературы из 158 ссылок.
