Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Ингибиторы ГМГ-КоА редуктаэы и пробукол как представители наиболее эффективных современных антигиперхолестеринемических препаратов 10
1.2. Влияние гиполипидемических препаратов на ЦНС in vivo 16
1.3. Теоретические основы нейротропного действия гиполипидемических препаратов 18
1.3.1. Проникновение липофильных соединении через гематоэнцефалический барьер 18
1.3.2. Особенности метаболизма холестерина в ЦНС 22
1.4. Культура нервной ткани как адекватная модель для изучения нейротропных эффектов гиполипидемических препаратов 27
1.4.1. Способы культивирования клеток нервной ткани и их применение 29
1.4.2. Бессывороточное культивирование клеток нервной ткани 39
1.4.3. Клетки животных и клетки человека 40
1.5. Заключение 42
2. Материалы и методы 44
2.1. Материалы 44
2.2. Методы 46
3. Результаты 57
3.1.1. Получение "чистых" нейрональных культур 5
3.1.2. Выбор оптимальных условий культивирования астроцитов человека 63
3.1.3. Выбор оптимальных условий культивирования для определения уровня синтеза холестерина в астроглиальных клетках человека 69
3.2.1. Влияние ингибиторов ГМГ-КоА редуктазы и пробукола на синтез холестерина в клетках ЦНС человека 72
3.2.2. Влияние ловастатина и пробукола на активность ЛНП-рецепторов в астроглиальных клетках человека 84
3.2.3. Влияние ловастатина и пробукола на пролиферацию иммортализованных астроцитов ASCh-7 86
3.2.4. Влияние ловастатина и пробукола на нейрито-генез и выживаемость клеток в мчистых" культурах нейрональных агрегатов 89
3.2.5. Ультраструктурный анализ эксплантатов головного мозга человека, культивируемых в присутствии ловастатина и пробукола 94
3.2.6. Совместное влияние ловастатина и пробукола на чистые культуры нейрональных агрегатов 101
5. Выводы 116
Список литературы 117
- Ингибиторы ГМГ-КоА редуктаэы и пробукол как представители наиболее эффективных современных антигиперхолестеринемических препаратов
- Особенности метаболизма холестерина в ЦНС
- Выбор оптимальных условий культивирования астроцитов человека
- Влияние ловастатина и пробукола на пролиферацию иммортализованных астроцитов ASCh-7
Введение к работе
Актуальность проблемы
Применение гиполипидемических препаратов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с нарушением липидного обмена и высоким содержанием холестерина в крови, в настоящее время приняло массовый характер. Активно ведутся разработки ноеых лекарственных препаратов, способных эффективно понижать содержание липидов, в первую очередь холестерина, в крови.
Одним из наиболее эффективных и перспективных классов антиги-перхолестеринемических препаратов в настоящее время считается группа ингибиторов ГМГ-КоА редуктазы, называемых также "статинами" или "монаколинами". Среди препаратов этой группы наиболее широкое распространение получил ловастатин (мевинолин, Мевакор) и его структурные аналоги.
Другим широко используемым препаратом является антиоксидант пробукол, обладающий гиполипидемическим и антиатерооклеротическим действием. Он является одним из немногих средств, эффективных при лечении гомозиготной семейной гиперхолестеринемии.
При оценке эффективности гиполипидемических препаратов обычно исследуется их способность снижать содержание холестерина в экстрацеребральном компартменте, в первую очередь - в сосудистом русле. При этом, как правило, вне поля зрения исследователей остается возможность проникновения препаратов в ЦНС и их влияния на клетки мозга пациентов, находящихся на постоянной гиполипидеми-ческой терапии.
К настоящему времени, однако, накоплено достаточное количество фактов, свидетельствующих о влиянии некоторых гиполипидемических препаратов на нервную систему. Так показано, что у пациен- тов, принимавших ловастатин и его липофильные аналоги, наблюдалось сокращение продолжительности и нарушения сна, а также заметно ухудшались некоторые психомоторные реакции.
Пробукол также способен оказывать влияние на процессы, происходящие в нервной системе, однако характер его воздействия существенно отличается от эффектов ловастатина и его аналогов.
Литературные данные свидетельствуют о том, что высоколипо-фильные препараты способны достаточно легко проникать через клеточные мембраны, в том числе и ГЗБ, а относительная автономность метаболизма холестерина в ЦНС делает ее уязвимой для высокоэффективных препаратов, которые способны влиять на отдельные стадии синтеза, транспорта и утилизации холестерина в мозгу и, тем самым, нарушать его гомеостаз.
Очевидно, что в условиях целостного организма практически невозможно оценить степень и характер воздействия данных препаратов на нейроны и глию ЦНС человека. В то же время, использование культур нервной ткани позволяет о высокой степенью достоверности смоделировать in vitro ситуацию, имитирующую проникновение в мозг ли-пофильных гиполипидемических препаратов и оценить степень их непосредственного воздействия на нейрональные и глиальные клетки. Это дает возможность объяснить на клеточно-молекулярном уровне нейротропные эффекты, которые наблюдаются при приеме некоторых из этих препаратов, а также обнаружить эффекты, не выявляемые при наблюдениях in vivo.
Несмотря на то, что влияние этих препаратов на клетки различных тканей достаточно широко изучается на моделях in vivo и in vitro, в литературе практически отсутствуют данные о непосредственном влиянии "терапевтических" концентраций этих препаратов на клетки нервной системы человека и животных и о характере такого воздействия на клеточном уровне.
Вместе с тем, современные методы культивирования позволяют получить различные типы клеточных культур и разработать на их основе адекватные модели для изучения различных аспектов функционирования клеток мозга человека и нейротропных эффектов фармаколо-*< гических препаратов, проникающих в мозг.
Цеди и задачи исследования
Целью настоящего исследования явилось изучение влияния "терапевтических" концентрации ловастатина и его аналогов, а также про-букола на культивируемые in vitro клетки ЦНС человека.
В задачи исследования входило: получение различных типов культур нервной ткани человека; разработка на основе культивируемых клеток мозга человека (нейронов и астроцитов) адекватных моделей in vitro, которые позволили бы изучать эффекты тестируемых препаратов на клеточно-моле-кулярном уровне; изучение непосредственного влияния тестируемых препаратов на различные процессы жизнедеятельности неирональных и глиальных клеток ЦНС человека, в частности: отдельные стадии метаболизма холестерина, пролиферативную активность, рост и выживаемость, уль-траструктурную организацию.
Положения, выносимые на защиту
Разработаны новые методы получения нейронов и астроцитов ЦНС человека, способных к длительному существованию в условиях клеточной культуры.
На основе культур клеток головного мозга человека созданы модели, позволяющие в условиях in vitro изучать: синтез холестерина и активность ЛНП-рецепторов в клетках нервной ткани человека; функционально- морфологические характеристики основных типов клеток мозга человека в процессе их развития
Выявлен нейротокоический эффект ловастатина на культуры клеток мозга человека при концентрациях препарата, которые присутствуют в организме пациентов в процессе лечения.
Установлено, что пробукол стимулирует рост и дифференци-ровку нервных клеток, а также увеличивает срок их жизни в культуре.
Показано, что пробукол заметно нивелирует негативные цито-токсические эффекты ловастатина в культурах нейронов человека при комбинированном применении этих препаратов.
Научная новизна работы
В процессе исследования были разработаны оригинальные методы получения и долговременного культивирования клеток ЦНС человека.
Впервые в условиях in vitro была смоделирована ситуация долговременного непосредственного воздействия "терапевтических" концентраций ловастатина и пробукола на клетки мозга человека, что-позволило продемонстрировать выраженный негативный эффект ловастатина на нейрональные и глиальные клетки ЦНС человека и стимулирующее влияние пробукола на рост и развитие нейрональных клеток.
Научно-практическое значение полученных результатов
Полученные в ходе данного исследования результаты могут быть использованы для выработки рекомендаций по практическому применению гиполипидемических препаратов с учетом их возможного действия на центральную нервную систему человека.
Разработанные в ходе исследования культуральные модели могут быть использованы для тестирования новых лекарственных препаратов на стадии предклинических испытаний, что позволит существенно сократить сроки их внедрения в практику здравоохранения. Данные модели дают возможность за относительно короткий срок обнаружить возможные побочные эффекты препаратов, для выявления которых в кли-ннике требуются годы.
Обнаруженный нейритстимулирующий эффект пробукола после дополнительных исследований может быть использован для стимуляции регенерационных процессов в нервной системе.
Апробация работы
Научные результаты, представленные в диссертации, были доложены на II Всесоюзном симпозиуме "Возбудимые клетки в культуре ткани" (Пущино, 1989 г.) и XIY ежегодной конференции университета г. Сиднея (Австралия, 2-4 февраля 1994г.). Тезисы работы были опубликованы в сборнике "Возбудимые клетки в культуре ткани "(1990) и Трудах Австралийского общества нейронаук (Proceedings of Australian Neuroscience Society, 1994, V. 5).
Структура диссертации
Диссертация изложена на 139 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения и выводов. Работа содержит 21 рисунок и 8 таблиц. Список литературы включает 189 источников.
Ингибиторы ГМГ-КоА редуктаэы и пробукол как представители наиболее эффективных современных антигиперхолестеринемических препаратов
Кроме того, молекулы всех соединений этой группы несут еще один участок, напоминающий ГМГ-КоА (фрагмент 1 -5 на Рис.1). Это сходство позволяет им достаточно прочно связываться с ферментом и эффективно ингибировать превращение ГМГ-КоА в мевало-нат (Рис.2). Константа ингибирования составляет 0,2-2,2 нМ, что сравнимо с константой Михаэлиса (4 мкМ) для субстрата реакции -ГМГ-КоА С47]. Результатом является угнетение процесса образования холестерина в клетке и увеличение количества рецепторов к ЛНП на поверхности клетки С963.
Поскольку основной клеточной мишенью ингибиторов ГМГ-КоА ре-дуктазы ЯЕЛЯЮТСЯ клетки печени - гепатоциты, усиление в них ЛНП-рецепторной активности приводит к повышенному захвату холестерин- содержащих ЛНП из плазмы крови. В итоге наблюдается зависимое от дозы препарата снижение концентрации холестерина плазмы [47, 178].
В последние годы в клинической практике широко используется препарат из класса антиоксидантов - пробукол (4,4-(изопропилиден-дитио)бис(2,6-ди-1:-бутилфенол)) (Рис.3), обладающий гиполипидеми-ческим и антиатеросклеротическим действием. По сравнению с другими гиполипидемическими препаратами пробукол обладает средней эффективностью, но имеет более широкий спектр действия. Он является одним из немногих средств, эффективных при лечении гомозиготной семейной гиперхолестеринемии С74, 171, 178, 186].
Являясь ловушкой активных форм кислорода, пробукол эффективно ингибирует окисление и модификацию липопротеинов и тем самым предотвращает их захват макрофагами [31], проявляя таким образом ан-тиатерогенные свойства.
Кроме того, показано, что пробукол оказывает ярко выраженное антигиперхолестеринемическое действие, снижая уровень холестерина в крови [31, 172]; при этом уменьшается содержание холестерина как в ЛНП, так и в ЛВП [30, 1783. Механизмы терапевтического действия пробукола до сих пор недостаточно изучены. Исследователи, изучающие влияние пробукола на метаболизм липидов, часто получают разноречивые данные. Так, в одних экспериментах пробукол заметно снижал уровень синтеза холестерина в клетках [30, 50, 74], тогда как в других такой эффект не обнаруживался [172]. Naruszewicz е.а. [143] предполагают, что пробукол снижает уровень ЛНП в крови, усиливая их захват печенью, однако Trezzi е.а. [180] сообщали об отсутствии влияния пробукола на скорость катаболизма ЛНП у кроликов.
Эти противоречивые результаты могут быть частично объяснены использованием в опытах интактных животных, у которых непосредственное влияние препарата на липидный метаболизм печени может маскироваться другими эффектами на внутрисосудистый метаболизм липопротеинов. Опыты in vitro позволяют получить более однозначные результаты и изучить непосредственное воздействие препарата на клетки, исключив влияние со стороны других органов и тканей.
Исследования в культуре гепатоцитов показали, что пробукол снижает секрецию липидов, в первую очередь свободного и этерифици-рованного холестерина, а также подавляет включение 14С-ацетата в холестерин и его эфиры [74]. Это свидетельствует либо об ингибиро-вании внутриклеточного синтеза холестерина на ранних стадиях, либо об усилении катаболизма липидов под действием препарата. Авторы предполагают, что пробукол, влияя на секрецию холестерина гепато-цитами, снижает таким образом и секрецию холестерин-содержащих липопротеинов.
Другой группой исследователей было показано, что пробукол в терапевтических концентрациях стимулировал рецептор-опосредованный захват холестерин-содержащих ЛВПг в культуре гепатоцитов [30].
Причиной этому, по-видимому, служит обогащение ЛВП2 аполипопротеи-ном Е, синтез и секреция которого увеличивается в 1,5-3 раза после 24-часовой инкубации клеток с 100 мкМ пробукола.
Факт стимуляции пробуколом синтеза апоЕ заслуживает особого внимания, так как может служить ключом к раскрытию внутриклеточных механизмов действия пробукола и объяснению по крайней мере некоторых из терапевтических эффектов препарата. Одним из предполагаемых механизмов действия пробукола является его воздействие на экспрессию различных генов, участвующих в регуляции метаболизма липопротеинов, в частности гена апоЕ. В пользу этой гипотезы свидетельствуют результаты, полученные разными группами исследователей. Так было продемонстрировано увеличение уровня іМРНК апоЕ в некоторых тканях кролика, в том числе нервной, в результате воздействия пробукола [453, а также показано влияние пробукола на экспрессию генов ало А-IV и ЛНП-рецептора у крыс [1713.
Таким образом, в настоящее время на основании имеющихся данных можно предположить два наиболее вероятных механизма, которые обусловливают терапевтические эффекты пробукола. Первый связан с его антиоксидантними свойствами. Являясь "ловушкой" активных форм кислорода, пробукол препятствует процессу перекисного окисления липидов и тем самым оказывает защитное воздействие на клетки и блокирует образование модифицированных липопротеинов как в кровотоке, так и в тканях. Второй возможный механизм действия пробукола - регуляция липидного метаболизма на уровне генома.
При оценке эффективности гиполипидемических препаратов обычно исследуется их способность снижать содержание холестерина в экстрацеребральном компартменте, в первую очередь - в сосудистом русле. В центре внимания в этом случае оказывается печень как орган, играющий ключевую роль в метаболизме липопротеинов плазмы. При этом, как правило, вне поля зрения исследователей остается возможность проникновения препаратов в ЦНС и их влияния на клетки мозга пациентов.
К настоящему времени, однако, накоплено достаточное количество фактов, свидетельствующих о влиянии некоторых гиполипидеми-ческих препаратов на нервную систему. В первую очередь это касается липофильных ингибиторов ГМГ-КоА редуктазы - ловастатина и его аналогов. Сообщалось, что у пациентов, принимавших ловаотатин, наблюдалось сокращение сна на 1-3 часа С166]. Это согласуется с результатами исследований, в которых о помощью объективных лабораторных измерений были зафиксированы нарушения сна у людей, принимавших ежедневно 40 мг ловастатина в течение 2 недель и более С1833. Бессонница и повторяющиеся нарушения сна наблюдались у больных, принимавших ловаотатин и другой его аналог - симвастатин С563. Использование в качестве контроля другого гиполипидемическо-го препарата, колестипола, исключало вероятность того, что наблюдаемые эффекты связаны со снижением уровня холестерина в крови. В опытах на лабораторных животных было установлено, что ловаотатин и симвастатин, в отличие от правастатина, сокращают сон и увеличивают периоды бодрствования у крыс [129].
Roth е.а. [1583 изучали влияние ловастатина и правастатина на дневную активность и показали, что ловаотатин, в отличие от правастатина, заметно ухудшает некоторые психомоторные реакции пациентов, что проявлялось в увеличении времени реакции при выполнении специальных тестов.
Особенности метаболизма холестерина в ЦНС
Достаточно легко проникая в нервную ткань, липофильные гипо-липидемические препараты, эффективно снижающие уровень холестерина в плазме крови, не могут не оказывать в той или иной мере влияния на метаболизм холестерина в ЦНС. Чтобы оценить степень возможного воздействия этих препаратов на мозг, необходимо принимать во внимание особенности внутримозгового метаболизма холестерина, которые делают ЦНС весьма уязвимой для данных препаратов.
Нервная ткань отличается высоким содержанием липидов, в частности, холестерина, который является одним из основных компонентов мембран нейрональных и глиальных клеток. Пул холестерина в ЦНС составляет около 20-30% всех липидов во взрослом мозгу [35,1613 и 35-40% всего холестерина организма [92,1843. Результаты экспериментов по введению радиоактивного холестерина in vivo свидетельствуют о наличии в организме нескольких пулов холестерина, которые различаются по скорости обмена с холестерином плазмы [92]. При этом пул холестерина ЦНС является наиболее стабильным и взаимодействует с холестерином плазмы в очень незначительной степени и о крайне низкой скоростью [92,160,184]. ЦНС входит в группу органов, в которых практически не удалось определить какой-либо захват (как рецепторный, так и нерецепторный) холестерин-содержащих ЛНП из плазмы [76], по-видимому, в первую очередь за счет низкой проницаемости ГЭБ для липопротеинов плазмы. Так или иначе, очевидно, что потребность мозга в холестерине удовлетворяется в значительной мере или полностью за счет собственного синтеза холестерина de novo клетками ЦНС [76,1023.
Результаты многочисленных исследований позволили сделать вывод о наличии в нервной ткани млекопитающих автономной системы синтеза, транспорта и перераспределения холестерина, физически и функционально отличной от системы транспорта липопротеинов в плазме крови. Судя по всему, центральную роль в метаболизме холестерина и других липидов в нервной сиотеме играет апо Е, который участвует в транспорте липидов и в экстрацеребральном компартменте [124,1253. На это указывает высокое содержание мРНК этого белка в различных отделах мозга животных и человека, что свидетельствует о достаточно высоком уровне синтеза апоЕ в мозгу [783. Это подтверждается наличием большого количества иммунореактивного белка апоЕ в нервной ткани, причем основная доля его связана с клетками астрог-лиальной природы [623. АпоЕ был обнаружен как в аппарате Гольджи астроцитов, так и в межклеточном пространстве [623, что свидетельствует о секреторной активности этих клеток.
В экспериментах in vitro была непосредственно продемонстрирована способность астроцитов синтезировать и секретировать апоЕ в культуральную среду [1493. Несмотря на то, что апоЕ, обнаруживаемый в ЦСЖ и ткани мозга, является продуктом того же гена, который кодирует апоЕ плазмы, имеются дополнительные свидетельства того, что апоЕ продуцируется в самой нервной системе, а не проникает в мозг из плазмы. Так сообщалось что апоЕ, экстрагированный из ткани мозга, и апоЕ, синтезируемый астроцитами in vitro, содержит большее количество опаловых кислот на молекулу белка, чем апоЕ плазмы. Таким образом, апоЕ нервной системы имеет большую молекулярную массу и представляет собой более кислую иэоформу, чем апоЕ плазмы [1493. Кроме того, концентрация апоЕ в ЦСЖ гораздо выше, чем это можно ожидать для белка, фильтрующегося из плазмы [62]. Тот факт, что апоЕ и другой транспортный белок ЦСЖ, апоА-1, не синтезируемый в нервной системе и попадающий в ЦСЖ из плазмы, всегда обнаруживаются в составе различных липопротеинов, также свидетельствует об их различном происхождении [150].
Все вышеприведенные факты убедительно свидетельствуют о наличии в ЦНС собственной автономной системы, обеспечивающей нервную ткань необходимым количеством апоЕ.
Кроме этого, в мозгу существует и собственная система синтеза холестерина. С помощью гибридизации in situ было показано наличие в мозгу кроликов очень высокого уровня мРНК ключевого фермента в биосинтезе холестерина - ГМГ-КоА редуктазы [102]. Уровень мРНК ГмГ-КоА редуктазы особенно высок в период активной миелинизации, однако, по окончании этого процесса он снижается лишь на 50-60%, что свидетельствует о достаточно высокой потребности зрелого мозга в холестерине и значительной холестерин-синтетической активности нервной ткани [176]. Система эндогенного синтеза холестерина в мозгу, по-видимому, обладает значительными потенциями. Об этом свидетельствует тот факт, что дефекты ЛНП-рецепторов у людей или у кроликов Watanabe не вызывают заметных нарушений в ЦНС. Клетки мозга, по-видимому, компенсируют недостаток поступления холестерина извне за счет повышения уровня эндогенного синтеза [176]. В среднем уровень синтеза холестерина в мозгу ниже, чем в печени и надпочечниках, но выше, чем в почках и скелетных мышцах. В некоторых участках ЦНС (моторные ядра, таламус и гипоталамус, кора) синтез холестерина может достигать гораздо более высокого уровня [176]. Иммуноцитохимическими методами было показано наличие ЛНП-рецепторов в мозгу обезьян и крыс С1503. Согласно этим данным, ЛНП-рецепторы экспрессируются как астроцитами, так и нейронами. Клетки, способные синтезировать холестерин и имеющие ЛНП-рецепторы, широко распространены по всей ЦНС, однако их количество значительно варьирует в различных отделах нервной системы, что, по-видимому, отражает различные потребности этих регионов мозга в холестерине.
Как правило, в тех регионах ЦНС, которые содержат большое количество мРНК ГМГ-КоА редуктазы, наблюдается и высокое содержание ыРНК ЛНП-рецепторов, лигандом для которых служит апоЕ. Эти регионы должны иметь особенно высокий уровень метаболизма холестерина, который обеспечивается как эндогенным синтезом, так и специфическим захватом апоЕ-содержащих липопротеинов. Количество мРНК ЛНП-рецепторов не снижается после окончания процесса миелинизации, обеспечивая клетки взрослого мозга экзогенным холестерином.
Выбор оптимальных условий культивирования астроцитов человека
Поскольку сыворотка крови животных, которая входит в качестве необходимого компонента в состав стандартных питательных сред, является источником экзогенного холестерина и липопротеинов, необходимо было исключить сыворотку из среды культивирования. Однако, сложность проблемы заключалась в том, что клетки нервной системы человека обладают повышенными потребностями в различных ростовых факторах и ЕЫСОКОЙ чувствительностью к составу питательной среды. Особенно чувствительными к условиям культивирования в отсутствие сыворотки оказались пролиферирующие клетки - первичные и имморта-лизованные астроциты.
Хотя составы бессывороточных сред для культивирования глиальных клеток были разработаны достаточно давно [603, они не получили столь широкого распространения в исследовательской практике, как бессывороточные среды для нейрональных клеток, и в литературе практически отсутствуют данные об условиях бессывороточного культивирования глиальных клеток, в частности, астроцитов. При попытках культивирования астроцитов человека ( как первичных, так и им-мортализованных) в средах G4 и G5 С 603 мы наблюдали массовую гибель клеток. Возникла необходимость подобрать оптимальные условия для бессывороточного культивирования астроглиальных клеток человека.
С этой целью был проведен сравнительный анализ влияния ряда бессывороточных сред различного состава и различных подложек на жизнеспособность астроглиальных клеток. Иммортализованные астроциты человека ASCh-7 высаживали на чашки Петри (диаметр 30 мм) в количестве 104 клеток на чашку. Чашки были покрыты 4 типами подложек: 1) 0,1 мг/мл поли-Ь-орнитина (ПЛО); 2) 0,1 мг/мл поли-L-лизина (ШШ); 3) 20 мкг/мл фибронектина (ФН); 4) сочетание ПЛЛ и ФН (ПЛЛ-ФН). Клетки культивировались в средах следующих составов: 1) среда G4 [603; 2) среда 65 = среда G4 + 10 нг/мл эпидермального ростового фактора; 3) среда 66 = среда G5 + 0,4% глюкозы + 2 мМ L-глутамина; 4) среда 67 = среда 66 + 0,4 ед./мл инсулина. Контролем служила среда ДМЕМ с 5% ЭТС. - 66 Как видно из Табл. 1, различия в составе бессывороточных сред культивирования не оказывают столь существенного влияния на выживаемость и рост клеток, как природа субстрата, на который высаживаются клетки. Эффект субстрата проявляется уже на начальном этапе культивирования в течение 1 суток. Количество прикрепившихся к подложке клеток свидетельствует об ее адгезивных свойствах, а доля жизнеспособных клеток отражает способность субстрата поддерживать нормальный клеточный рост. В среде с сывороткой, служащей контролем, различие между субстратами нивелируется, очевидно, за счет многочисленных факторов, присутствующих в сыворотке и обеспечивающих адгезию, выживаемость и рост клеток. Через 1 сутки культивирования различия в количестве прикрепившихся клеток были еще не столь выражены, однако доля живых клеток, способных к пролиферации, на подложках из ШШ и ПЛО заметно снижалась. Эти различия увеличивались при дальнейшем культивировании, как видно из Табл. 2. Выживаемость имморталиеованных аотроцитов ASCh-7 при различных условиях культивирования через 5 сут. Указано количество прикрепившихся клеток х 104 (среднее - стандартное отклонение). В скобках указана доля живых клеток. Через 5 суток культивирования количество прикрепившихся клеток и доля жизнеспособных клеток на ПЛЛ и ПЛО были существенно меньше, чем на ФН и ПЛЛ-ФН. Количество и жизнеспособность клеток, растущих на ПЛЛ-ФН практически не отличались от контрольных культур. Кроме того, значительная часть клеток на ПЛО и ПЛЛ в бессыво-роточных средах имела округлую форму, тогда как все клетки на ФН и ПЛЛ-ФН были распластаны, что свидетельствовало об их нормальном функционировании. Клетки на ФН были распластаны в большей степени, чем клетки на ШІЛ-ФН, и процент жизнеспособных клеток на этих двух подложках был одинаково ЕЫСОКИМ, однако, общее количество клеток на ФН было ниже, чем на ПЛЛ-ФН.
Влияние ловастатина и пробукола на пролиферацию иммортализованных астроцитов ASCh-7
Для ультраструктурного анализа использовали эксплантаты головного мозга эмбрионов человека, культивируемые в бессывороточной среде в присутствии 100 нг/мл ловастатина или 20 мкг/мл пробукола в течение 12 дней.
Во всех культурах, экспонированных с ловастатином, отмечали замедление дифференцировки неиробластов в нейроны: основная масса неирональных элементов была представлена клетками с относительно узким ободком цитоплазмы, содержащей единичные цистерны эндоплаз-матического ретикулума и пластинчатого комплекса, небольшое количество рибосом. Хорошо заметны деструктивные изменения в дифференцирующихся неирональных клетках: четкообразное расширение пространства между наружной и внутренней ядерными мембранами (Рио.18Б). Ядерный хроматин представлен множественными глыбками высокой электронной плотности, преимущественно агрегированными в районе внутренней ядерной мембраны. В цитоплазме дифференцирующихся нейронов отмечалось выраженное расширение цистерн гранулярного ЭПР и заполнение их материалом средней электронной плотности, а также появление множественных зон локального отека. Дальнейшее развития деструктивных изменений приводило к гибели неирональных клеток (Рис.18В). В погибающих нейронах отмечалось дальнейшая агрегация ядерного материала, разрушение ядерных мембран, цитоплазматических органелл и общий отек цитоплазмы.
В контрольных культурах не наблюдалось каких-либо структурных повреждений в дифференцирующихся нейробластах (Рис.18А).
Мы также наблюдали эффект ловастатина на астроглиальные клетки в составе эксплантатов. Изменения, происходящие в этих клетках под влиянием препарата можно разделить на специфические и неспецифические. К первым мы относим значительное увеличение количества лизосом и остаточных телец в цитоплазме астроцитов (Рис.19Б); в некоторых клетках они занимали большую часть цитоплазмы .
К специфическим структурным изменениям мы относим формирование в цитоплазме многих ловастатин-обработанных астроцитов плотно упакованных пучков глиофиламентов (Рис 19В), чего не наблюдается в контроле. Перемещение этих пучков к наружной клеточной мембране сопровождалось повреждением последней (РИС.19Г)
Следует также отметить наличие участков повреждений отростков астроцитов, выселяющихся из центральной зоны эксплантата в зону роста. Локальные повреждения цитоплазмы в астроцитарных отростках (Рис. 20Е) нередко сопровождается повреждением и разрушением клеточной мембраны (Рис. 20В), либо атипичным формированием множественных микровиллей и их деструкцией ("взрывообразное" разрушение) (Рис. 20Г). В контрольных культурах подобных повреждений не наблюдалось (Рис.20А).
Ультраструктурный анализ эксплантатов, культивируемых в присутствии 20 мкг/мл пробукола, выявил отличия этих культур от контрольных (Рис.21). Пробукол вызывал увеличение количества и размера органелл цитоплазмы, включая гиперплазию эндоплазмати-ческого ретикулума и аппарата Гольджи, а также просветление мат-рикса митохондрий. Количество лизосом также увеличено. Ядра клеток округлые, хроматин равномерно распределен в нуклеоплазме. Клетки в агрегатах плотно прилегают друг к другу. Следует отметить следующую особенность культур, инкубированных с пробуколом: если в контроле наблюдается некоторая гетерогенность нейрональных клеток по размерам и степени зрелости, то после обработки пробуколом эта гетерогенность значительно уменьшается, происходит как бы "синхронизация" клеток , их уравнивание по степени дифференцировки.
Поскольку полученные результаты показали, что ловастатин и пробукол обладают противоположными эффектами на выживаемость и рост клеток нервной ткани, возник вопрос о том, каково будет комбинированное воздействие двух этих препаратов. С этой целью были проведены предварительные эксперименты, в которых 100 нг/мл ловастатина и 20 мкг/мл пробукола добавляли в культуры через 1 сутки после прикрепления нейрональных агрегатов к подложке.
Оказалось, что пробукол в значительной степени ослабляет негативное влияние ловастатина на "чистые" культуры нейронов человека. При культивировании в среде, содержащей и ловастатин, и пробукол, не наблюдалось ранней остановки нейритного роста и дегенеративных процессов, которые имели место при действии одного ловастатина (раздел 3.2.4.). В культуре нейрональных агрегатов формировались нейриты, хотя скорость и плотность нейритного роста в присутствии пробукола и ловастатина были несколько ниже, чем в контроле. Кроме того, в этих культурах не образовывалась нейритная сеть, связывающая между собой отдельные агрегаты, как это наблюдалось в контрольных культурах.
