Содержание к диссертации
Введение
I. Введение 5
П. CLASS Обзор литератур CLASS ы 10
III. Материалы и методы 39
1. Материалы 39
2. Методы 41
2.1. Получение экстрактов белков мозга 41
2.2. Выделение ГДГ из мозга человека 41
2.3. Гидрофобная хроматография 42
2.4. Ионообменная хроматография 42
2.5. Аффинная хроматография 43
2.6. Адсорбционная хроматография 43
2.7. Хранение очищенных ферментов 44
2.8. Выделение тромбоцитов 44
2.9. Получение экстрактов белков тромбоцитов 44
2.10. Определение концентрации белка 45
2.11. Определение ферментативной активности ГДГ 45
2.12. Определение кинетических параметров изоформ ГДГ 45
2.13. Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДС-Ыа-ПААГ) 46
2.14. Двумерный электрофорез 46
2.15. Вестерн-иммуноблоттинг с хемилюминесцентным усилением сигнала 47
2.16. Статистическая оценка данных 48
2.17. Получение антисывороток и их тестирование 48
IV. Результаты 49
1. Выделение ГДГ из мозга человека 49
2. Изучение физико-химических свойств изоферментов ГДГ 58
2.1 Определение молекулярной массы и изоэлектрической точки ГДГІ, ГДГИ и ГДГШ 58
2.2. Изучение гидрофобности ГДГ 61
2.3. Изучение кинетических параметров изоформ ГДГ 61
2.4. Изучение температурной зависимости изоформ ГДГ 68
3. Изучение иммунохимических свойств изоформ ГДГ 69
3.1. Получение специфичных антител 69
3.2. Определение органо- и видоспецифичности изоформ ГДГ 71
4. Сравнительное изучение ферментативной активности и содержания (по иммунореактивности) ГДГ в мозге лиц контрольной группы и при шизофрении 74
4.1. Изучение ферментативной активности ГДГ 74
4.2. Изучение содержания (по иммунореактивности) изоформ ГДГ 74
5. Сравнительное изучение содержания (по иммунореактивности) ГДГ в
тромбоцитах лиц контрольной группы и при шизофрении 80
5.1. Выявление изоформ ГДГ в тромбоцитах крови человека 80
5.2. Сравнительное изучение содержания ГДГ в тромбоцитах в контрольной группе и при шизофрении 81
V. Обсуждение 82
Vi. Выводы 94
Vii. Список литературы 96
- Гидрофобная хроматография
- Вестерн-иммуноблоттинг с хемилюминесцентным усилением сигнала
- Изучение кинетических параметров изоформ ГДГ
- Выявление изоформ ГДГ в тромбоцитах крови человека
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Одной из нейрохимических гипотез патогенеза шизофрении является «глутаматергическая гипотеза» о нарушении глутаматного нейромедиаторного пути (глутамат служит возбуждающим нейромедиатором в нервной системе).
Установлено, что нарушения нейромедиаторной системы глутамата (Глу) в мозге при шизофрении, обусловлены нарушением процессов его захвата переносчиками и его связывания со специфическими рецепторами (54, 87, 9). В течение последних двух лет в мозге больных шизофренией обнаружены изменения уровней ферментов, участвующих в метаболизме Глу, таких как, глутаминсинтетаза (4, 7, 24, 27), фосфатактивируемая глутаминаза и глутаматдекарбоксилаза (46, 74, 40).
Глутаматдегидрогеназа (ГДГ, КФ 1.4.1.3) является одним из ключевых ферментов метаболизма глутамата.
В настоящее время еще не сложилось единого мнения как относительно функции (преимущественного направления реакции в сторону биосинтеза или деградации глутамата), так и о клеточной локализации ГДГ в нервной ткани человека и животных.
Биохимические данные свидетельствуют о том, что активность ГДГ выявлена в нейронах и в глии (12, 118). Иммуногистохимические исследования показали, что ГДГ преимущественно локализована в астроцитах (101) и в олигодендроцитах (132), напротив, молекулярно-биологические данные свидетельствуют о значительной экспрессии гена ГДГ в нейронах (судя по содержанию мРНК) (104). Противоречие результатов, полученных при исследовании ГДГ может быть обусловлено гетерогенностью этого фермента в нервной ткани.
ГДГ мозга человека как в норме, так и при патологии нервной системы, практически не изучена. В литературе имеются отдельные данные об изменении содержания ГДГ при нейродегенеративных расстройствах (94, 59).
В связи с этими данными, а также данными о нарушении глутаматного медиаторного пути при шизофрении, изучение свойств, содержания, локализации, распределения ГДГ в мозге, (одного из ключевых ферментов глутаматного метаболизма) в норме и при шизофрении, представляется актуальным.
Безусловно, исследования, проведенные на аутопсийном материале, помогают понять механизмы развития заболевания. Однако, поиск соответствующих изменений в работе глутаматергической системы на периферии является важным, поскольку из литературы известно, что тромбоциты, выделенные из крови человека, могут служить удовлетворительной моделью, отражающей процессы, которые происходят в нервной ткани. В тромбоцитах обнаружены компоненты серотонинергической нейромедиаторной системы (111, 1) и глутаматергической системы: рецепторы и переносчики глутамата (21, 45), ферменты метаболизма глутамата (ФАГ и ГДГ) ( 47).
Таким образом в связи с глутаматергической гипотезой патогенеза шизофрении изучение ГДГ, как в мозге, так и в тромбоцитах человека, при этом заболевании представляется актуальным. Цель и задачи исследования.
Целью данной работы является оценка возможного участия ГДГ в нарушении метаболизма глутамата при шизофрении. В задачи исследования входило:
1. Выделение ГДГ из ткани мозга лиц, не страдавших психическими или нервными заболеваниями.
2. Характеристика физико-химических свойств ГДГ.
3. Сравнительная оценка уровня активности ГДГ в экстрактах белков различных областей мозга человека в контрольной группе (лица, не страдающие неврологическими и психическими расстройствами) и при шизофрении.
4. Получение моноспецифичных антител к ГДГ мозга человека.
5. Сравнительное изучение содержания ГДГ в мозге в контрольной группе и при шизофрении.
6. Сравнительное изучение содержания ГДГ в тромбоцитах в контрольной группе и при шизофрении.
Научная новизна работы.
Впервые обнаружены три изоформы ГДГ: две растворимые изоформы, с молекулярными массами субъединиц 58 к Да (ГДП) и 56 кДа (ГДГИ), и мембрано-ассоциированная изоформа, с молекулярной массой субъединиц 56 кДа (ГДГШ). Ферментативная активность ГДГ в экстрактах белков мозга является суммарной активностью растворимых изоформ.
Получены специфичные поликлональные антитела к ГДП, ГДГП и к ГДГШ мозга человека. Методом вестерн - иммуноблоттинга установлено, что антисыворотка к ГДП и ГДГП распознает оба изофермента, в то время как очищенная ассоциированная с мембранами ГДГШ обнаруживается только специфичными к ней антителами, причем перекрестная реакция между легко растворимыми и ассоциированной с мембранами формами практически отсутствует. Адаптирован метод иммуноблоттинга с хемилюминесцентным усилением сигнала и подобраны системы, позволяющие определять уровни всех трех изоферментов ГДГ. Сравнительная оценка содержания иммунореактивных ГДГІ , ГДГП и ГДГШ при шизофрении и в контрольных случаях в лобной, передней и задней лимбической коре и коре мозжечка проведена с использованием этого метода. Содержание ГДГ при шизофрении в лобной (рО.01), задней лимбической (р 0.01) коре и коре мозжечка (р 0.05, рО.01) повышено. Впервые выявлено достоверное повышение (рО.01) содержания ГДГ в тромбоцитах при шизофрении по сравнению с контрольной группой.
Теоретическая и практическая значимость работы. В работе обнаружены и охарактеризованы три изоформы ГДГ мозга человека. Получены специфичные поликлональные антитела, распознающие растворимые и мембранно-ассоциированную ГДГ. Впервые выявлено изменение содержания ГДГ в отдельных областях мозга при шизофрении по сравнению с контролем. А также впервые обнаружено изменение содержания ГДГ при шизофрении в элементах крови - тромбоцитах.
Результаты исследования одного из ключевых ферментов глутаматного пути могут быть важными для понимания метаболизма глутамата при патологии нервной системы. Наряду с содержанием кальция, активностью NMDA рецепторов, содержание ГДГ в тромбоцитах может являться полезным прижизненным маркером, отражающим статус глутаматергической системы у больных шизофренией. Основные положения, выносимые на защиту.
1. Ферментативная активность ГДГ в экстрактах мозга человека представлена суммарной активностью трех изоформ ГДГ, различающихся по физико-химическим свойствам.
2. Содержание растворимых и мембранно-ассоциированной ГДГ при шизофрении в лобной, задней лимбической коре, коре мозжечка достоверно повышено (р 0.01, рО.01, р 0.05 и р 0.01, соответственно) по сравнению с контрольной группой.
3. Содержание растворимых изоформ ГДГ в тромбоцитах достоверно повышено (р 0.01) при шизофрении по сравнению с контрольной группой.
4. Предложен способ определения содержания изоформ ГДГ в экстрактах мозга человека и в тромбоцитах крови человека. В основу метода положены электрофорез в ПААГ с ДС-Na, вестерн-иммуноблоттинг с хемилюминесцентным усилением сигнала, сканирование на лазерном денситометре.
Гидрофобная хроматография
Гидрофобную колоночную хроматографию низкого давления проводили на фенил-сефарозе 4В на колонке размером 2,4x23 см. Белки мозга, растворяли в буфере, содержащем 50мМ трис- НС1, рН 6,0, 15% насыщения сульфат аммония и наносили на колонку, уравновешанную тем же буфером. Скорость нанесения образца на колонку 20 мл/час. Колонку промывали двумя объемами исходного буфера до полного выхода пика белка. Элюцию белков проводили двойным градиентом, содержащим 0-90% этиленгликоль и 15-0% насыщения сульфат аммония. Скорость элюции 40 мл/час, скорость самописца 0,1 мм/мин. Объем собираемых фракций 6 мл.
Ионообменную колоночную хроматографию низкого давления проводили на колонке с ДЕАЕ-сефацелем размером 1,5x16 см. Нанесение белков в буфере, содержащем 25мМ трис- НС1, рН 7,3, 0,1М КС1, на колонку, уравновешанную тем же буфером, проводили со скоростью 20 мл/час. Колонку промывали исходным буфером. Элюцию проводили линейным градиентом 0,1-0,6 М КС1, содержащемся в исходном буфере со скоростью 20 мл/час. Скорость самописца 0,1 мм/мин. Объем собираемых фракций 3 мл.
Ионообменную хроматографию с сефарозой Q проводили на колонке размером 2,6x55 см. Белки наносили в буфере, содержащем 2мМ К-фосфат, рН 7,2, ІмМ ФМСФ, 1мМ ДТТ (буфер 2) на колонку, предварительно уравновешанную буфером 2, со скоростью 80 мл/час. Элюцию проводили ступенчатым градиентом NaCl в буфере 2 (20мМ, 200мМ, 400мМ NaCl соответственно). Элюцию при 20мМ проводили со скоростью 250 мл/час, 200- и 400мМ - со скоростью 60 мл/час. Объем собираемых фракций 10 мл. Скорость самописца 0,1 мм/мин.
Аффинную колоночную хроматографию низкого давления проводили на ГТФ-агарозе на колонке размером 0,9x10 см. Нанесение белков в буфере, содержащем ЮОмМ трис- НС1, рН 7,2, 1мМ ЭДТА, 0,05М КС1, на колонку, уравновешанную тем же буфером, проводили со скоростью 10 мл/час. Колонку промывали исходным буфером. Элюцию проводили линейным градиентом 0,05-0,6 М КС1, содержащемся в исходном буфере со скоростью элюции 10 мл/час. Скорость самописца 0,1 мм/мин. Объем собираемых фракций 2 мл.
Адсорбционную хроматографию низкого давления с оксиапатитом проводили на колонке 2,5x13 см. Нанесение белков в буфере 2 на колонку, уравновешанную буфером 2, проводили со скоростью 40 мл/час. Колонку промывали ЮмМ К-фосфатным буфером до полного выхода пика белка. Элюцию проводили линейным градиентом 30-200мМ К-фосфат, рН7,2 со скоростью 40 мл/час. Скорость самописца 0,1 мм/мин.
Выделенные ферменты хранили замороженными при -20С в 50 мМ Трис-НС1 буфере, содержащем 1,4 мМ 2-меркаптоэтанол и 40% глицерина, рН 7,4.
Выделение тромбоцитов проводили по методу Брусова (1996) (2) Для выделения тромбоцитов взятие крови проводили в пробирку с 1/5 от объема крови буфером: 0,1 М цитрат Na, 0,07 М лимонная кислота, 0,1 М глюкоза, рН 5,7 (для предотвращения свертывания). Кровь центрифугировали при 200g в течение 15 мин, при 20С. Тромбоциты осаждали из супернатанта центрифугированием при 9000 g в течение 20 мин при 5 С, промывали вышеупомянутой средой, суспендировали в буфере, содержащем 0,0625 М трис-НС1 , рН 6,8 и замораживали жидким азотом, хранили при -80С.
Размороженные при +4С образцы тромбоцитов гомогенизировали в гомогенизаторе Potter (Германия) стекло-тефлон 11000 об/мин. Гомогенат центрифугировали 30 мин при 11 000g. Полученные экстракты белков тромбоцитов использовали для сравнительной оценки уровней иммунореактивности растворимых изоформ ГДГ. Все операции по получению экстрактов белков тромбоцитов проводили при +4С. 2.10. Определение концентрации белка.
Концентрацию белка определяли по методу Lowry (72) при длине волны 750 нм на спектрофотометре «Beckman» (чувствительность составляет 10-100 мкг в пробе).
Активность ГДГ измеряли спектрофотометрически в прямой реакции восстановительного аминирования а-кетоглутарата и в обратной реакции окислительного дезаминирования L-глутамата (43). Активность ГДГ в реакции прямого направления была оценена последующим уменьшением поглощения при 340 нм в реакционной смеси, содержащей 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 100 мМ хлорида аммония, 0,1 мМ NADH, 2,6 мМ EDTA и 1мМ ADP, раствор фермента. Реакция начиналась добавлением а-кетоглутарата до конечной концентрации 10 мМ при 25С (43). Удельная активность ГДГ выражали в мкМ окисленного NADH на 1 мг белка в мин при 20С. Активность ГДГ в обратной реакции рассчитывали по увеличению поглощения при 340 нм (25С) в реакционной смеси, содержащей 50 мМ трис-HCl, рН 9,0, 0,5мМ NAD/NADP, 2,6 мМ EDTA и 1мМ ADP, раствор фермента. Реакция начиналась добавлением L-глутамата до конечной концентрации 15 мМ .
Вестерн-иммуноблоттинг с хемилюминесцентным усилением сигнала
Двумерный электрофорез проводили по методу O Farrel (86). Изоэлектрофокусирование проводили в аппарате GE 2/4 LS (Pharmacia) в стеклянных трубках с внутренним диаметром 2,5 мм длиной 15 см. Для достижения градиента рН 4,5-8,5 смешивали фармалиты рН 3-10, 4,2-4,9, 4,5-5,4, 5-6, 6-8 в объемном соотношении 6:4:3:3:4. Образец (3-30 мкг белка) диализовали против деионизованной воды, лиофилизировали и растворяли в буфере, содержащем 2% фармалиты, 2% NP-40, 9,5 М мочевину, 5% 2-меркаптоэтанол, рН 7. Образец наносили со стороны катода на 4% ПААГ, содержащий 2% фармалиты, 2% NP-40, 9,5 М мочевину, наслаивали тот же буфер, разбавленный 2:1 деионизованной водой. В качестве анолита использовали 10 мМ ортофосфорную кислоту, католита - 20 мМ гидроксид натрия, стандартов ИЭТ карбомилированные глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу и карбоангидразу. Фокусирование проводили 18 часов при напряжении 450V; после чего гелевые цилиндрики извлекали из стеклянных трубок, вымачивали 30 минут в 62,5мМ Трис-HCl буфере, содержащем 2% ДС-Na, 10% глицерин, 5% 2-меркаптоэтанол, рН 6,8. Цилиндрики геля после разделения белков в первом направлении приклеивали к пластине ПААГ расплавленной агарозой. Электрофорез во втором направлении проводили как описано выше в ДС-Na-ITAAr.
Вестерн-иммуноблоттинг выполняли по методу Towbin (128). Перенос белков из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозу производили в аппарате ТЕ 70 SemiPhor Semi-Dry Transfer Unit (Hoefer Scientific Instruments) при силе тока 0,8 мА/см в течение 2 часов в буфере, содержащем 15мМ глицина, 2мМ Трис, 20% метанол, рН 8,3, при температуре +4С. После блоттинга нитроцеллюлозную мембрану промывали в ЮмМ трис-НС1 буфере, содержащем 150 мМ NaCl, 0.2% твин-20, рН 7,6, в течение 1 часа выдерживали в 10% фетальной сыворотке теленка в этом же буфере (для закрытия свободных зон связывания). Затем нитроцеллюлозную мембрану промывали 15 мин и 2 раза по 5 мин в 1 ОмМ трис-HCl буфере, содержащем 150 мМ NaCl, 0.2% твин-20, рН 7,6, после чего в течение 2 часов инкубировали с антисыворотками при комнатной температуре, отмывали подобным образом, инкубировали 1 час с антикроличьими антителами, коньюгированными с пероксидазой хрена. Затем нитроцеллюлозную мембрану отмывали как указано выше, подсушивали фильтровальной бумагой и наносили смесь люминесцирующих реагентов ECL - 100 мкл на 1 см2 мембраны. Выдерживали 1 мин, подсушивали фильтровальной бумагой, заворачивали в полиэтиленовую пленку. Экспонировали на рентгеновскую пленку 10-30 мин. Затем пленку проявляли и фиксировали. Проявленные пленки сканировали на лазерном денситометре (Zeineh Biomed, USA) и определяли оптическую плотность засвеченных пятен. На диаграммах приведены относительные единицы оптической плотности по показаниям денситометра.
При проведении сравнительной оценки иммунореактивностей, из контрольной группы был выбран образец, соответствующий медиане, который использовали в качестве стандарта в каждом опыте. Опыт считали достоверным при линейной зависимости (± 10%) калибровки белкового стандарта. Достоверность различий между группами измерений (контрольная группа / шизофрения) определяли по непараметрическому U-тесту Вилкоксона-Манна-Уитни. Различия между измерениями считали достоверными, если значение р было меньше 0,01.
Для получения антисывороток кроликов иммунизировали подкожно в 10-15 мест, используя 100 мкг препарата соответствующего антигена. Иммунизацию проводили по следующей схеме: первая иммунизация в смеси с полным адьювантом Фрейнда в соотношении 1:1 по объему, через месяц проводили реиммунизацию с неполным адьювантом Фрейнда и через 10 дней повторяли реиммунизацию так же с неполным адьювантом Фрейнда. Через 7-10 дней после последней инъекции брали кровь из ушной вены. Титр и специфичность антисывороток определяли методом вестерн-иммуноблотинга. IV. РЕЗУЛЬТАТЫ.
1. Выделение ГДГ из мозга человека.
Из литературных данных известно существование нескольких изоформ ГДГ в мозге животных. Так, в мозге крысы обнаружены растворимая и мембрано-ассоциированная изоформы ГДГ (33). Из мозга быка выделены две растворимые изоформы ГДГ с одинаковыми молекулярными массами субъединиц равными 57 кДа, (30). Из мозжечка мозга человека была выделена ГДГ с молекулярной массой субъединиц 60 кДа (59).
В настоящей работе при выделении ГДГ из аутопсийного мозга человека были выявлены три изоформы ГДГ, предложен способ их разделения и очистки. Схема выделения представлена на схеме 1.
Ткань мозга (300 г) измельчали скальпелем и гомогенизировали, в пяти объемах буфера, содержащего 10 мМ трис- НС1, рН 7,4, 0,1 мМ ФМСФ, 0,5 мМ ЭДТА, гомогенат центрифугировали при 480g в течение 10 мин. В супернатанті добавляли тритон Х-100 и NaCl до конечной концентрации 1% и 0,5 М, соответственно, после чего белки осаждали сульфатом аммония в интервале насыщения 30-60%. Затем проводили очистку ГДГ на колонке с фенил-сефарозой 4В. Три пика активности ГДГ было обнаружено при элюции белков двойным градиентом, содержащим 0-90% этиленгликоль и 15-0% насыщения сульфатом аммония (рис. 1). Таким образом, ГДГ в мозге человека представлена тремя изоформами, различающимися по гидрофобным свойствам.
Изучение кинетических параметров изоформ ГДГ
При хроматографии белкового экстракта мозга человека на колонке с фенил-сефарозой 4В (рис. 1) было показано, что изоформы ГДГ различаются по гидрофобным свойствам. Гидрофобные свойства растворимых ГДГ I и ГДГ II довольно близки, тогда как мембранно-ассоциированная ГДГ III значительно отличается по гидрофобности от растворимых изоформ.
2.3. Изучение кинетических параметров изоформ ГДГ.
Активность ГДГ как прямой так и обратной реакции стимулируется ADP (150% активности наблюдалось в присутствии 0,25 - 0,5 мМ ADP в реакционной смеси).
Кинетические параметры были измерены для ГДП, ГДГ II и ГДГ III (таблица 3) (рис. 7 - 11). Из таблицы 3 и рисунка 7 видно, что Км ГДП, ГДГ II и ГДГ III для NH4 сходны между собой, тогда как значения Vmax ГДП является наибольшим и в два раза превышает значение Vmax ГДГ III. Км ГДГ II для а-кетоглутарата примерно в два раза превышает значения Км ГДП и ГДГ III, тогда как значения Vmax ГДГІ в два раза превышает Vmax ГДГ II и ГДГ III (рис. 8). Км ГДГ II для NADH в два раза выше Км ГДП и в полтора раза выше Км ГДГ III, Vmax ГДП в два раза превышает Vmax ГДГ III и незначительно выше Vmax ГДГ II (рис. 9). Значение Км ГДП, ГДГ II и ГДГ III для NAD+ сходны между собой, в то время как Vmax ГДП во много раз превышает Vmax ГДГ III и примерно в два раза выше Vmax ГДГ II (рис. 10). Значение Км ГДГ II для L-глутамата сходно с Км ГДГ III и меньше, чем Км ГДП, a Vmax ГДП во много раз превышает Vmax ГДГ III и примерно в два раза выше Vmax ГДГ II (рис. 11).
Из этих результатов следует, что сродство ГДГ II к а-кетоглутарату меньше чем сродство ГДП и ГДГ III, а сродство ГДП к L-глутамату меньше, чем сродство ГДГ II и ГДГ III к этому субстрату. Обращает на себя внимание тот факт, что Км ГДГ для аммония
(»12-23мМ), определенные как в нашей работе, так и в литературе относительно высоки (33, 59, 107, 30). Это, по видимому, свидетельствует о роли ГДГ в деградации глутамата.
. Изучение температурной зависимости изоформ ГДГ.
При изучении устойчивости изоформ ГДГ к температурному фактору было обнаружено, что после 30 мин инкубации при 45С ГДГ I сохраняет 40% активности, ГДГП сохраняют 60% активности, тогда как ГДГ III - 90% (Рис. 12).
3. Изучение иммунохимических свойств изоформ ГДГ.
Кролики были иммунизированы препаратами растворимых (ГДП+ГДГП) и мембрано-ассоциированной (ГДГ III) ГДГ по схеме, описанной в главе «Материалы и методы». Полученные антисыворотки тестировали методом вестерн-иммуноблоттинга с целью оценить возможность их применения для определения уровня иммунореактивности изоформ ГДГ в экстрактах мозга человека и тромбоцитах крови человека. Результаты тестирования антисывороток приведены в таблице 4.
Выявление изоформ ГДГ в тромбоцитах крови человека
Проведено определение содержания растворимых ГДГ по иммунореактивности в тромбоцитах контрольной группы и при шизофрении.
Уровень иммунореактивности ГДГ в группе больных достоверно превышает уровень в контрольной группе (р 0.01) (рис.21). V.
Глутамат, один из возбуждающих нейромедиаторов в нервной системе, по-видимому, играет важную роль в патологии шизофрении. Накопленные за последние 20 лет данные позволили сформулировать современную нейрохимическую гипотезу, согласно которой нарушение глутаматного нейромедиаторного пути играет роль в патогенезе шизофрении (19,18, 66, 121, 48).
Глутаматергическая гипотеза шизофрении основана на том, что антагонисты рецепторов глутамата вызывают у животных утрату способности избирать правильные поведенческие программы; фенциклидин, антагонист рецепторов глутамата (Глу), провоцирует у добровольцев симптомы, характерные для шизофрении (64, 84). В мозге больных шизофренией изменена экспрессия генов компонентов глутаматергической системы - глиальных переносчиков и рецепторов Глу, изменяются параметры связывания агонистов и антагонистов рецепторами Глу; концентрация Глу в мозге и спиномозговой жидкости больных снижена, а концентрация глутамина в передней лимбической коре больных в период первого психотического приступа повышена (37, ПО, 90, 9, 54, 87, 125).
Мы предположили, что нарушения работы глутаматной нейромедиаторной системы в мозге при шизофрении могут возникать не только из-за изменений рецепторов и переносчиков Глу, но и в силу изменений ферментов цикла Глу/глутамин (26, 27).
Настоящая работа посвящена изучению глутаматдегидрогеназы -ключевому ферменту цикла Глу/глутамин.
В литературе описано существование нескольких изоформ ГДГ в нервной ткани млекопитающих. Так, в мозге крысы обнаружены растворимая и мембрано-ассоциированная изоформа ГДГ (33), которые различаются по устойчивости к тепловой инактивации и аллостерическим регуляторным характеристикам.
Из мозга быка выделены две растворимые изоформы ГДГ, различающиеся по физико-химическим свойствам (30). Обе изоформы состояли из 6 идентичных субъединиц с одинаковыми молекулярными массами равными 57кДа.
В литературе отсутствуют данные о наличии нескольких растворимых изоформ ГДГ в мозге человека. Выделенная из мозжечка человека ГДГ (59) показывала одну белковую зону с молекулярной массой бОкДа на электрофорезе в ПААГ с ДС-Na, однако при двумерном электрофорезе в ПААГ было обнаружено четыре белковые зоны, различающиеся по молекулярной массе и изоэлектрической точке (59). Хотя авторы предполагают, на основании своих результатов, что это четыре изоформы ГДГ, по-видимому, выявление нескольких зон на двумерном электрофорезе связано с молекулярной гетерогенностью фермента.
Shaschidharan et al. (1997) (107) обнаружили две изоформы ГДГ путем экспрессии GLUD1 кДНК и GLUD2 кДНК в клетках Sf9. Одна из которых, кодируемая геном GLUD1, выявляется почти во всех тканях, другая, кодируемая геном GLUD2, специфична для нервной ткани.
При выработке подходов к изучению функционирования ГДГ в мозге человека при шизофрении мы прежде всего оценили число ее изоформ в экстракте мозга лиц контрольной группы. Нами было обнаружено, что при хроматографии белкового экстракта мозга человека на колонке с фенил-сефарозой 4В выявляются 3 изоформы ГДГ, различающиеся по гидрофобности, обозначенные нами, как ГДП, ГДГП и ГДГШ.
Разделение растворимой и мембранной фракций белков мы проводили на первой стадии очистки ГДГ, т.е. на стадии экстракции белков из ткани мозга. Растворимая фракция была получена путем экстракции нейтральным буфером при низкой ионной силе. Для экстракции белков, связанных с мембранами (из осадка 100 000g), мы использовали 1% Тритон Х-100 и 0,5М NaCl (по методу Shashidharan et al., 1994(108)).
При гидрофобной хроматографии растворимой фракции белков на колонке с фенил-сефарозой 4В было обнаружено, что в растворимой фракции содержатся две изоформы ГДГ (ГДГІ и ГДГП). Тогда как при элюции мембранной фракции белков с фенил-сефарозы 4В наблюдается один пик активности ГДГ, соответствующий мембрано-ассоциированной изоформе ГДПИ. Последующие стадии очистки как растворимых изоформ ГДГ, так и мембрано-ассоциированной изоформы ГДГ проводили одинаково, используя ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-сефацеле и аффинную хроматографию на ГТФ-агарозе.
Таким образом, на последнем этапе очистки изоформ ГДГ мы получили электрофоретически гомогенную мембрано-ассоциированную ГДГШ, однако разделить две растворимые изоформы ГДГ не удалось из-за близости их гидрофобных свойств и аффинности.
Разделение растворимых изоформ ГДГ проводили по модифицированному методу Cho et al. (1995) (30). Модификация состоит в том, что в отличие от Cho мы использовали ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-сефарозе и аффинную хроматографию на ГТФ-агарозе, но не использовали хроматографию на гепарин-сефарозе и гельфильтрацию на Протеин Пак 300W. Белки растворимой фракции (супернатант 100 000g) фракционировали на колонке с сефарозой Q. Затем, в отличие от метода Cho et al., на следующем этапе была использована хроматография на фенил-сефарозе 4В. На этой стадии мы добились отделения большой доли белков, не обладающих глутаматдегидрогеназной активностью. На следующей стадии очистки на колонке с оксиапатитом при элюции ступенчатым градиентом К-фосфата (30, 50, 100 и 200мМ) наблюдалось два пика глутаматдегидрогеназной активности. Первый пик активности ГДГ элюировался ЮОмМ К-фосфатом, второй пик активности ГДГ - 200мМ К-фосфатом. В работе Cho et al. (1995) (30) при разделении растворимых ГДГ из мозга быка на колонке с оксиапатитом первый пик активности ГДГ элюировался ЗОмМ К-фосфатом, а второй - 50мМ К-фосфатом. Таким образом, растворимые изоформы ГДГ мозга человека и растворимые изоформы ГДГ мозга быка различаются по ионообменным свойствам. Надо отметить, что во фракциях белков мозга быка, элюирующихся при ЗОмМ и 50мМ К-фосфатом, содержалось большое количество примесных белков. Вследствие этого авторы очищали ГДГ, применяя несколько этапов хроматографической очистки, включая хроматографию на гепарин-сефарозе, фенил-сефарозе и гельфилырацию на Протеин Пак 300SW. В то же время в наших экспериментах во фракциях, элюирующихся при ЮОмМ и 200мМ, доля белков, не обладающих актитвностью ГДГ, была незначительна. Поэтому, нам было достаточно для получения электрофоретически гомогенных белков ГДП и ГДГП, проведение только одной хроматографии на ГТФ-агарозе.
