Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1. Некоторые аспекты клинической, социальной и диагностической картины бронхиальной астмы 7
1.1.. Иммунный и не иммунный механизмы возникновения АБА 9
1.2. Аутоаллергия и астма 11
1.3. Иммунокомпетентные клетки 13
2. Программируемая клеточная гибель при АБА 17
2.1. Варианты программируемой гибели клеток 17
2.2. Апоптоз лимфоцитов при атопической бронхиальной астме 21
2.3. Особенности биохимических процессов при апоптозе 26
2.3.1. Структурная организация ДНК 26
2.3.2. Апоптоз и фрагментация ДНК 27
3. Нуклеазы 32
3.1 .Общая характеристика нуклеодеполимераз 32
3.2. Некоторые физико-химические свойства "апоптотических" ДНКаз 39
3.3. Изменение активности ДНКаз в зависимости от состояния организма 45
3.3.1. ДНКазы в раннем эмбриогенезе и в процессе развития 45
3.3.2. Активность ДНКаз в процессе старения организма 47
3.3.3. Активность ДНКаз при вирусных инфекциях 50
3.3.4. ДНКазы при воздействии на клетки ядов, антиметаболитов, канцерогенов и мутагенов 51
3.3.5. ДНКазы при заболеваниях с признаками энзимопатий 53
3.3.6. Активность ДНКаз при опухолевом процессе 54
3.3.7. ДНКазы при лучевой болезни 56
3.4. ДНКазы при апоптозе 59
3.4.1. Активация апоптотических нуклеаз 59
3.4.2. "Апоптотические" нуклеазы 60
3.5. Нуклеазы клеток при аутоиммуных заболеваниях 68
3.6. Методы анализа апоптотических нуклеаз 72
Заключение по литературному обзору 73
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 75
ГЛАВА 3. Результаты исследования
3.1. Особенности морфологических и количественных показателей лимфоцитов периферической крови при развитии атопической астмы 88
3.1.1.Характеристика структуры лейкоцитарной формулы периферической крови у пациентов с АБА в зависимости от тяжести 89
3.1.2. Электронно-микроскопический анализ структуры лимфоцитов крови пациентов с АБА 96
3.2. Характеристика нуклеазного состава лимфоцитов 102
3.2.1. Нуклеаза лимфоцитов относительно здоровых доноров 103
3.2.2. Нуклеазы лимфоцитов периферической крови пациентов с АБА 111
3.2.2.1 . Локализации нуклеазной активности в клетках 111
3.2.2.2.Катионная зависимость и влияние ингибиторов на уровень энзиматической активности 113
3.2.2.3.Изменение уровня активности ДНКаз в зависимости от тяжести астмы 117
3.2.3.Нуклеазы секреторных гранул лимфоцитов периферической крови пациентов с АБА 120
3.2.3.1. Выделение секреторных гранул из лимфоцитов 121
3.2.3.2. Обнаружение ДНКазной активности 122
3.2.3.3. Определение молекулярной массы 124
3.2.3.4. Катионная зависимость и влияние ингибиторов на уровень активности ДНКаз 126
3.2.3.5. Влияние кислотности среды на уровень ДНКазной
активности гранул 129
Обсуждение результатов 134
Выводы 150
Список литературы 151
- Некоторые аспекты клинической, социальной и диагностической картины бронхиальной астмы
- Особенности биохимических процессов при апоптозе
- Особенности морфологических и количественных показателей лимфоцитов периферической крови при развитии атопической астмы
- Локализации нуклеазной активности в клетках
Введение к работе
Бронхиальную астму, относят к заболеваниям, опосредованным торможением программируемой клеточной гибели (ПКГ). Считается, что ПКГ при воспалениях проявляется на завершающих этапах, где ей принадлежит важная роль, поскольку в этот период происходит устранение активированных клеток иммунной системы, выполнивших свои функции. То же относится к аллергическому воспалению, при котором упомянутая элиминация эффекторных клеток к тому же затруднена в связи с их способностью к самоподдержанию. Исследования процессов ПКГ лимфоцитов при развитии заболевания свидетельствуют об устойчивости данных клеток к апоптозу, что проявляется в замедлении фрагментации ДНК этих клеток при инкубации в среде in vitro и in vivo (Melis et al., 2000, 1998; Green, Scott, 1998), что приводит к нарушению элиминации лимфоцитов из легких, а также возникновению гиперреактивности бронхов. Фрагментация хромосом - один из важных биохимических признаков ПКГ, тем не менее, ее роль при ПКГ и механизм действия остаются не ясными. В настоящее время биохимические и генетические исследования показали, что фрагментация хромосом является комплексным биохимическим процессом, в котором участвует группа нуклеаз с различными активностями и субстратной специфичностью. Уникальность дезоксирибонуклеаз заключается в том, что они эффективно катализируют гидролиз фосфодиэфирной связи - самой стабильной из всех химических связей, найденных в биологических молекулах. ДНКазы имеют значение в процессах нуклеинового обмена и для поддержания физиологической концентрации ДНК в организме человека. Например, повышение концентрации ДНК в крови может привести к накоплению ДНК-белковых комплексов, индукции наработки анти-ДНК антител и развитию различного рода аутоиммунных заболеваний (Барановский, и др. 2004). «Апоптотические» нуклеазы действуют кооперативно между собой и с другими не нуклеазными кофакторами для реализации поступенчатой фрагментации хромосом и деградации ДНК. Важен тот факт, что помимо непосредственного участия в разборке погибающей клетки,
апоптотическая деградация ДНК может облегчить смерть клетки и другие апоптотические события, например, элиминация апоптотических клеток. Более того, некоторые апоптотические нуклеазы, видимо, могут касаться и иных аспектов развития у животных и человека, включая иммунные ответы и их нарушение. Идентификация новых апоптотических нуклеаз и анализ их функций в апоптозе и в процессе развития должна проложить путь для дальнейших исследований по раскрытию новых функций "апоптотических" нуклеаз, чтобы определять скрытые связи между апоптотической деградацией ДНК и заболеваниями человека (Parrish, Deng, 2006).
Таким образом, объяснимо наше внимание к изучению свойств нуклеаз лимфоцитов, вьщеленных из периферической крови пациентов с АБА, и возможной роли этих нуклеаз в индукции аутоиммунных элементов при развитии заболевания.
Цель работы - сравнительная характеристика ядерных и гранулярных нуклеаз лимфоцитов от больных с атопической бронхиальной астмой в зависимости от степени тяжести заболевания.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Выделить фракцию Т лимфоцитов из периферической крови больных с АБА и относительно здоровых доноров. Получить из них секреторные гранулы.
Изучить динамику структуры лейкоцитарной формулы у больных АБА с различной степенью тяжести и провести сравнительный ультраструктурный анализ лимфоцитов.
Определить наличие нуклеазной активности в экстракте лимфоцитов методом зимографии (электрофорез в ПААГ-ДСН-ДНК) и выделить фракции цитоплазматических белков, хроматина ядер и секреторных гранул исследуемых лимфоцитов.
Изучить субстратную специфичность, влияние ионов двухвалентных металлов и рН на энзиматическую активность ядерных и гранулярных белков.
5. Изучить динамику ДНКазной активности белков при различной
степени тяжести АБА.
Некоторые аспекты клинической, социальной и диагностической картины бронхиальной астмы
Бронхиальная астма относится к группе хронических обструктивных болезней легких (ХОБЛ), которые объединяют расстройство функций внешнего дыхания легких по обструктивному типу. Эти заболевания входят в число лидирующих причин по числу не трудоспособности, инвалидности и занимают четвертое-пятое место среди других причин смерти. В России данные медицинской статистики свидетельствуют - болезни органов дыхания занимают по распространенности 1 место: 15073, на 100000 населения, далее следуют сердечно-сосудистые заболевания-14385,4 и т.д. (Чучалин А.Г., www. spiro. ru/info/federal.html). Эпидемиологические исследования показывают определенную связь развития ХОБЛ с социально-экономическим состоянием человека, уровнем его образования, интеллектом, что, в конечном счете, позволяет осознать известные факторы риска окружающей среды и иметь материальную и моральную готовность избегать их патогенного влияния (Ревякина В.А., 2006). Вследствие суммирования факторов риска окружающей среды и генетической предрасположенности развивается воспалительный процесс, в который вовлекаются все морфологические структуры легких. Первичные механизмы патогенеза ХОБЛ находятся на молекулярно-клеточном уровне (Белушкина, Северин, 2001). Именно этот уровень определяет индивидуализацию клинических проявлений ХОБЛ у больных.
Воспаление относится к защитным реакциям организма, которые представляют собой ранний, неспецифический ответ, индуцированный инфекцией и другими повреждающими факторами, а также генетической предрасположенностью. С другой стороны само воспаление может оказывать повреждающее действие на клетки и ткани организма. Воспалительный процесс, как правило, запускается каким-либо патогенным агентом, а затем поддерживается иммунологическими механизмами с участием иммунокомпетентных клеток и их продуктов (Nerd, Page, 1994). В ранней фазе развития воспалительного процесса важно привлечение в очаг инфекции неспецифических факторов защиты, в частности, клеток воспаления -макрофагов и гранулоцитов. В более поздние стадии воспаления в очаге накапливаются молекулы, которые привлекают в очаг эффекторные клетки специфического иммунного ответа - Т-лимфоциты (Kogg, Doerschux, 1995).
Хронические воспалительные процессы, как правило, поддерживаются Т-лимфоцитами, которые своими продуктами активируют макрофаги. Активированные макрофаги вызывают местное повреждение тканей за счет синтеза цитокинов. Вслед за ранним воспалительным ответом усиливается пролиферация фибробластов и синтез компонентов вне клеточного матрикса. В конечном счете, поддержание иммунного гомеостаза легких зависит от баланса защитных механизмов, обеспечивающих элиминацию повреждающих факторов и, не менее важных, механизмов ингибиции воспаления для ограничения последующего повреждения ткани легкого.
Современная концепция патогенеза бронхиальной астмы (БА) представляет его как характерный воспалительный процесс, ведущий к развитию бронхиальной обструкции и повышенной гиперреактивности бронхов в ответ на различные стимулы, в том числе, иммунологические и химические. Характерной чертой также является повышенное содержание активированных клеток (эозинофилов, тучных клеток, нейтрофилов, лимфоцитов и др.) в слизистой бронхиального дерева и его просвете. Длительное течение воспалительного процесса приводит к необратимым морфо-функциональным изменениям, характеризующимся резким утолщением базальной мембраны эпителия с нарушением микроциркуляции, что в свою очередь приводит к склерозу стенки бронхов. Принципиально важное положение современного представления о БА - это признание ведущим звеном патогенеза заболевания хронического персистирующего воспалительного поражения дыхательных путей, диктует необходимость раннего выявления этих изменений (Чучалин, 2002). Своеобразие воспаления при АБА заключается в сочетании иммунологических и не иммунологических механизмов его возникновения (Чернушенко, 2000,2003).
Особенности биохимических процессов при апоптозе
Молекула ДНК длиной несколько сантиметров укладывается в хромосоме, размер которой составляет несколько микрон, степень упаковки ДНК на этом уровне достигает десятков тысяч раз (рис.1,а). Как показано на рис.1 компактная упаковка ДНК свидетельствует о ее многоуровневой структурно-конформационной организации: спирал изации, су перепирал изации, образования петлевых участков, крестообразных структур благодаря прочной связи ДНК с белками и работе ферментов, главным образом, топоизомераз.
Компактная структура хроматина поддерживается непосредственно связанными с ДНК белками-гистонами, прежде всего гистоном НІ. Нуклеосома, состоящая из спирали ДНК, навитой на гектамер гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4 (Olins, Olins, 1974), подвергается различным посттрансляционным модификациям (Thoma, 1992). Эти процессы отражаются в количестве белков, входящих в состав нуклеосомы (Stein, Stein, 1983).
При апоптозе в процессе деградации генома участвуют и протеазы и ДНКазы, активируемые или вновь синтезируемые при индукции апоптоза, которые деградируют молекулу до различных фрагментов (рис. 1,6). Вуллие (Wyllie, 1998) был первым, кто связал апоптоз тимоцитов, обработанных глюкокортикоидом, с расщеплением ДНК под действием эндогенных нуклеаз до фрагментов, состоящих из 180 пар оснований.
Многие исследователи, в том числе (Zhivotovsky et al.,1995; 1985; Szopa, Adamiec, 1993 др.) сходятся во мнении, что апоптоз наступает в результате энзиматического распада хроматина в ядре клетки. Нуклеазной атаке подвергаются не только эухроматиновые (генетически активные), но и спирализованные уплотненные гетерохроматиновые участки ядра. Для того чтобы запустить этот процесс клетка должна произвести ферменты - нуклеазы, а для этого, в свою очередь, в клетке происходит усиление процессов транскрипции и трансляции. Имеются данные, что ингибиторы белкового синтеза - циклогексамид и пуромицин - предотвращают энзиматический распад хроматина и могут предотвратить или отсрочить процесс апоптоза. Следует отметить, что ZnCb также приводит к предотвращению фрагментации ДНК и отсрочивает апоптоз.
В американском журнале "Экспериментальная медицина" в 1995 году была опубликована статья группы американских и французских ученых (Хейфлик, 1982), которые приводят факты относительно того, что имеется несколько биохимических путей для апоптоза: путь энзиматического переваривания межнуклеосомных пространств и нарезание фрагментов размером в 200 нуклеотидов; гетерохроматизация хроматина без разрезания Днк.
Необходимо отметить, что термин "гетерохроматин" был предложен Хейтцем еще в 1922 году. Вначале этот термин имел чисто цитологическое значение и применялся для обозначения участков хромосом, которые по их отношению к окрашиванию отличаются от других сегментов, называемых эухроматином. Оказалось, что факультативный гетерохроматин располагается в определенных участках генома клетки (Ильинских и др., 1992). Хромосомы в интерфазном ядре расположены упорядоченным образом. В основе надхромосомной организации ядер у эукариот лежит общее периферическое распределение интерфазных хромосом вблизи от ядерной мембраны с прикреплением к ней определенных участков хромосом, несущих гетерохроматиновые блоки. Места прикрепления, как правило, связаны с особой функциональной активностью тех или иных участков генома. Например, хромосомы, прикрепляются к ядерной оболочке, и эти места соответствуют точкам инициации синтеза ДНК (Sun et al., 1994). Ассоциированная с мембраной ДНК имеет более высокий уровень повторяющихся последовательностей, чем основная часть ядерной ДНК. Как оказалось, в результате апоптоза в первую очередь страдает именно эта часть молекулы ДНК, примыкающая к ядерной мембране. Установлено, что формирование эритроцита связано с энзиматическим разрушением ядра, но странным представлялось то, что нуклеазы способные разрушить основное ядро клетки, не трогают при этом микроядра, которые образуются как результат неверного расхождения хромосом в процессе деления эритробластов - ядерных предшественников эритроцитов. Возможно, это связано с тем, что микроядра эритроцитов зачастую не имеют сформированной оболочки.
Таким образом, не исключено, что именно с ядерной оболочкой связан процесс энзиматического переваривания хроматина в процессе апоптоза. Мембрана ядра близка по составу к мембранам микросом. Причем снаружи она покрыта рибосомами, и здесь непосредственно происходят активные процессы трансляции, в том числе и биосинтез нуклеаз. Морфологически внутренняя мембрана обладает грибовидными выростами, напоминающими элементарные частицы внутренней мембраны митохондрий. ДНК хроматина прикрепляется к этим образованием при помощи особых пристеночных гранул. В ядерной оболочке сосредоточено много различных гидролитических и окислительных ферментов, среди которых 5 -нуклеотидаза, АТФазы и нуклеазы, которые играют определенную роль в апоптотической деструкции ДНК (Sun et al., 1994),
Итак, одно из основных проявлений апоптоза на биохимическом уровне реализуется в ядре клетки и состоит во фрагментации ДНК (Parrish, Deng, 2006). Сначала происходит образование крупных фрагментов ДНК, содержащих 700, 200-250, 50-70 тысяч пар оснований (т.п.о.), позже 30-50 т.п.о. Уже на этой стадии регистрируется конденсация хроматина и выпячивание ядерной мембраны, характерные для апоптоза.
Особенности морфологических и количественных показателей лимфоцитов периферической крови при развитии атопической астмы
Определение активности ферментов по приросту кислоторастворимых продуктов денатурированной и нативной ДНК представляет собой модификацию методов (Kunitz, 1950) и (Schmidt, 1955).
Реакционная проба для определения степени гидролиза денатурированной ДНК объемом 200 мкл содержала: 100 мкл денатурированной ДНК (1 мг/мл) / 60 мкл 20мМ трис-HCl буфер (рН 7,2) / 20 мкл МпС12 (25 мМ) / 20 мкл исследуемого белкового раствора.
Реакционная проба для определения действия фермента на нативную ДНК, объемом 200 мкл содержала: 100 мкл нативной ДНК (1 мг/мл) / 60 мкл 20мМ трис-буфера (рН 7,5) / 20 мкл смеси MgCl2 (50 мМ) и СаС12 (1 мМ) / 20 мкл фермента. 1,1 мл реакционной пробы инкубировали при 37С в течение 1 ч. Пробы по 200 мкл отбирали через 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 и 60 мин; реакцию останавливали добавлением 3,8 мл 3 %-ного раствора НСЮ4 при 0С. Через 10-15 мин осадок кислотонерастворимых продуктов удаляли центрифугированием, в надосадочной жидкости определяли прирост кислоторастворимых продуктов по поглощению при длине волны 260 нм (АЕ2бо) на спектрофотометре СФ-46. Контролем служили пробы, в которых фермент добавляли непосредственно перед осаждением кислотонерастворимых продуктов хлорной кислотой и нулевая точка отсчета времени (момент добавления фермента к субстрату).
За единицу активности принимали количество фермента, образующего прирост кислоторастворимых продуктов гидролиза ДНК на 1 опт. ед. при 260 нм за 1 ч инкубации при 37С на 1 мг белка (удельная активность). Во всех экспериментах определяли начальную скорость реакции.
Электрофорез белков в 10% ПААГ с ДДС-Na вели по методике Лаеммли (Laemmli, 1970). Молекулярную массу определяли в ПААГ в присутствии 0,1%-ного ДДС-Na. В качестве стандарта использовали фосфорилазу Б (92,5 кДа), бычий сывороточный альбумин (68 кДа), яичный альбумин (45 кДа) и карбоангидразу (29 кДа). Запасной раствор ПААГ содержит Т-30 (вес/объем), С-2,7. В состав разделяющего геля входит 10% ПААГ в 0,375 М трис-буфере (рН 8,6), содержащем 0,1% ДДС-Na / 0,025% персульфата аммония (ПСА) / 0,098% ТЕМЕД. Концентрирующий гель содержит 5% ПААГ в 0,125 М трис-буфере (рН6,8), содержащем 0,1% ДДС-Na / 0,025%) персульфата аммония (ПСА) / 0,098% ТЕМЕД. Белковый препарат вносили в 0,0625 М трис-буфере (рН 6,8), содержащем 10% глицерина / 0,001% бромфенолого синего / 2,5% ДДС-Na / 5% 2-меркаптоэтанола.
Электрофорез проводили при комнатной температуре при силе тока 1 ОмА до внедрения проб в концентрирующий гель, концентрирование белков проводили при 20мА. Основной режим - 40мА, продолжительность электрофореза 2 часа.
Для приготовления геля ПААГ-ДНК 20мл 10% ПААГ смешивали с 1мл раствора ДНК до конечной концентрации ДНК в геле 20 мкг/мл. Гель после электрофореза промывали трижды по 12 минут в дНгО, один раз в промывающем буфере (1мМ №2ЭДТА / 40мМ трис-HCl рН 7.6 /2мМ MgCl2) минут и два раза по 12 мин в дН20 на качалке, для отмывания геля от содержащегося в нем SDS. Для активации нуклеаз, находящихся в геле, последний помещали в инкубирующий буфер: 10 мМ трис-HCl рН 7.6/ 1мМ СаС12/ 50мМ NaCl2/ 10 мМ MgCl2. Выдерживали 18-24ч при 37С. Затем в инкубационную пробу добавляли этидиум бромид до конечной концентрации 1 мкг/мл и ставили в термостат на 30 мин.
Результаты реакции регистрировали при помощи видеосистемы для регистрации гелей "DNA Analyzer" (НПФ "Литех", Россия). Реакция проявлялась в виде темных полос на фоне флюоресцирующей ДНК.
Выявление белкового спектра после фракционирования препаратов в ПААГ проводили непосредственно после электрофореза.
Для этого белки фиксировали в водном растворе, содержащем 20% этиловый спирт и 7% уксусную кислоту. Гель, промывали 4 раза по 15 минут в дистиллированной воде и проводили окраску 0.3% раствором Кумасси G-250 на 3,5% растворе хлорной кислоты в течение 20 минут. Затем гель погружали в 5% водный раствор уксусной кислоты для избавления от избытков красителя.
Локализации нуклеазной активности в клетках
Далее мы исследовали катионную зависимость обнаруженных ДНКаз в среде с различной комбинацией ионов Са2+, Mg2+, Мп2+ и Zn2+.
Для этой цели в качестве субстрата взяли ДНК морсого ежа. Об уровне активности судили по индексу фрагментации (F.I.,%).
Результаты зимографии (рис. 17) в денатурирующих условиях, показывают, что обнаруженные в цитоплазматических и ядерных белках нуклеазные активности являются мономерными пептидными цепями.
При исследовании катионной зависимости инкубация цитоплазматических и ядерных белков в среде с различными ионами: Mg , Мп2+ и Са2+ показала, что в обеих фракциях проявляется Mg -зависимая активность. Эта активность усиливается, примерно, в 2-3 раза в среде с ионами Мп2+.
Энзиматическая активность цитоплазматических белков (при равной концентрации по белку) была выше активности ядерных белков лимфоцитов.
Добавление ионов Са2+ в инкубационную среду с Mg2+ или Мп2+ приводило к повышению активности цитоплазматических белков, особенно в экстрактах белков лимфоцитов периферической крови пациентов с легкой персистирующеи АБА (рис. 18 ).
Однако добавление ионов Са одновременно с ионами Mg в инубационную среду белков из лимфоцитов периферической крови при тяжелой персистирующеи астме не приводило к повышению активности или несколько понижало ее, о чем говорит индекс фрагментации.
Следовательно, можно сказать, что при тяжелой персистирующеи астме в лимфоцитах локализована Mg2+(Mn2+)-3aBHCHMafl активность, не требующая для своей работы ионов Са . Важным свойством «апоптотических» нуклеаз является отношение к ионам цинка. Как показывают фореграммы и гистограммы (рис. 19) цитоплазматическая и ядерная ДНК-зависимая нуклеазные активности ингибируются при добавлении в инкубационную среду ионов Zn . Но степень ингибиции была различной.
Если в среде с ионами Мп2+ нуклеазная активность, как цитоплазматических, так и ядерных белков лимфоцитов крови больных с легкой персистирующей астмой ингибировалась в 2,5-3,0 раза, то нуклеазная активность лимфоцитов крови больных с тяжелой персистирующей астмой - в 8 раз (энзиматическая активность цитоплазматических белков) и в 15 раз снижалась энзиматическая активность ядерных белков (рис.19, В).
Таким образом, повышение Мп -зависимой ДНКазной активности при добавлении Са2+, и высокая чувствительность нуклеазной активности к ингибиторному действию ионов Zn дает возможность предположить, что данная активность лимфоцитов крови от больных с тяжелой персистирующей астмой является апоптотической.
Итак, в данной работе были выявлены две нуклеазные активности: Са ,Mg - зависимая (цитоплазматическая, молекулярная масса 29 кДа) и Mg2+(Mn2+)-3aBHCHMafl (ядерная, молекулярная масса 40 кДа).
Результаты обнаруженных биохимических процессов: повышение Mg (Mn )-активности и снижение Са ,Mg - зависимой активности в лимфоцитах периферической крови пациентов с тяжелой персистирующей астмой, отражается в виде специфических морфологических изменений структурных компонентов лимфоцитов по сравнению с клетками здоровых доноров и пациентов с интермиттирующей АБА, что показано методом электронной микроскопии.
Ингибирующее действие ионов цинка на ДНКазные белки лимфоцитов с признаками апоптоза может быть связано с результатами, что ионы цинка способны блокировать межнуклеосомную деградацию ДНК. По данным литературных источников на апоптотических клетках показано, что нуклеаза, которая способствует межнуклеосомной деградации ДНК - это Са ,Mg -зависимая активность, а продукты деградации более ранних этапов апоптоза (фрагменты ДНК в 30-300 т.п.о.) - результат работы Mg -зависимой активности (Oberhammer et al., 1993).
На рисунке 20 показана степень фрагментации хромосомной ДНК цитоплазматическими и ядерными белками. Как следует из рисунка, продукты 2+ деградации ДНК в присутствии ионов Мп (дорожки 1, 3, 5, 7), в основном, представляют собой фрагменты ДНК до 23 т.п.о. Кальций-магниевая активность приводит к образованию более коротких фрагментов. Например, цитоплазматические белки лимфоцитов крови при легкой персистирующей АБА способны деградировать ДНК на фрагменты до 2 т.п.о.
