Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Передача гормонального сигнала в растениях 10
1.2. Передача цитокининового сигнала в растении 15
1.2.1. Физиологические функции цитокининов 15
1.2.2. Биосинтез цитокининов 17
1.2.3. Механизм трансдукции цитокининового сигнала 19
1.2.3.1. Мембранные рецепторы цитокининов - гибридные гистидиновые протеинкиназы 19
1.2.3.2. Трансдукция сигнала внутри клетки: фосфотрансмиттеры 22
1.2.3.3. Гены первичного ответа на цитокинин и их продукты -регуляторы ответа 23
1.2.3.4. Передача цитокининового сигнала через мембранный рецептор, общая схема 27
1.2.3.5. Цитотазматические рецепторы цитокинина 29
2. Экспериментальная часть 39
2.1 Материалы и методы исследования 39
2.1.1. Объекты исследования 39
2.1.2. Выделение растворимых растительных белков для
подбора условий иммуноцитохимического анализа ЦСБ-70 40
2.1.3. Выделение ЦСБ-70 для анализа специфичности моноклональных антител разных групп 40
2.1.4. Измерение концентрации белка 41
2.1.5. Проведение аналитического электрофореза и иммуноблоттинга ЦСБ-70 42
2.1.6. Иммуноферментный анализ влияния фиксации и дегидратации на сохранение иммунореактивности ЦСБ-70 42
2.1.7. Иммуноферментный анализ влияния химических реагентов на сохранение иммунореактивности ЦСБ-70 44
2.1.8. Фиксация и заливка в смолу растительной ткани 45
2.1.9. Выявление ЦСБ-70 на полутонких срезах для световой микроскопии с помощью иммуномечения 47
2.1.10. Выявление ЦСБ-70 на ультратонких срезах для электронной микроскопии с помощью иммуномечения 48
2.1.11. Количественная оценка выявления ЦСБ-70 с помощью электронной микроскопии в компартментах клеток проростка кукурузы 49
2.2. Результаты и обсуждение 51
2.2.1. Разработка методов иммуноцитохимического исследования локализации ЦСБ-70 в тканях и клетках проростка кукурузы 51
2.2.1.1. Исследование воздействия на ЦСБ-70 реагентов, используемых для обработки растительного материала 51
2.2.1.2. Подбор условий для иммобилизации растительного материала в полимерную среду 56
2.2.1.3. Подбор условий для иммуноцитохимического выявления ЦСБ-70 на срезах растительной ткани 58
2.2.2. Подбор антител для дифференцированного выявления ЦСБ-70 в органеллах растительных клеток 61
2.2.3. Иммуноцитохимическое исследование локализации ЦСБ-70 в цитоплазме и ядрах клеток проростка кукурузы 63
2.2.4. Иммуноцитохимическое исследование локализации ЦСБ-70 в пластидах клеток проростка кукурузы 74
Заключение 86
Выводы 90
Список цитированной литературы 91
- Передача гормонального сигнала в растениях
- Гены первичного ответа на цитокинин и их продукты -регуляторы ответа
- Иммуноферментный анализ влияния фиксации и дегидратации на сохранение иммунореактивности ЦСБ-70
- Исследование воздействия на ЦСБ-70 реагентов, используемых для обработки растительного материала
Введение к работе
Одна из самых существенных особенностей жизненных процессов заключается в способности организма самостоятельно регулировать и координировать свои метаболические реакции. У растений весьма эффективными биорегуляторами, оказывающими влияние на все этапы жизнедеятельности, включая рост и развитие, являются фитогормоны. В отличие от сигнальных веществ других многоклеточных организмов, растительные гормоны полифункциональны и способны воздействовать при определенных обстоятельствах на любые ткани организма, вызывая различные изменения физиологических процессов в зависимости от баланса фитогормонов и состояния клеток-мишеней. Большинство исследователей считает, что объяснение необычных свойств фитогормонов, нужно искать на уровне рецепции гормональных сигналов. Исследования в этой области важны не только для фундаментальной науки, на их основе возможно создание растений со свойствами, удовлетворяющими современным требованиям к урожайности и устойчивости к стрессовым условиям.
Фитогормонами являются природные органические соединения, которые в малых концентрациях могут проявлять регулирующее воздействие на процессы роста и развития, а также на многие другие физиологические программы растений. К растительным гормонам относят небольшие молекулы, с молекулярным весом до 1 кД, способные беспрепятственно проникать в клетку и транспортироваться (активно или пассивно) по растению, влияя на ткань-мишень. Шестью основными гормонами растений являются ауксины, цитокинины, гиббереллины, брассиностероиды, этилен, и абсцизовая кислота. Цитокинины представляют собой гормоны растений, участвующие в регуляции таких важнейших процессов, как деление клеток, дифференцировка побегов, рост клеток листа, биогенез хлоропластов, задержка старения листьев, устьичные движения, ответ растений на стресс и многие другие [Кулаева О.Н., 1973]. Однако каким образом выполняются
8 столь различные функции до сих пор неясно. В связи с этим очевидна теоретическая и
практическая значимость исследований механизма действия этого класса гормонов.
В настоящее время открыты гены первичного ответа на цитокинин. В 2001 г. [InoueT. et al., 2001; Ueguchi С. et al., 2001] был открыт мембранный рецептор цитокининов. Он относится к так называемой двухкомпонентной регуляторной системе, включающей в себя трансмембранный рецептор, который является сенсорной гистидин-киназой, она взаимодействует с цитоплазматическим белком - переносчиком фосфатной группировки в ядро на цитокинин-зависимый трансфактор, включающий гены первичного ответа на цитокинин. Таким образом, мембранный рецептор передает цитокининовый сигнал через сеть внутриклеточных мессенджеров. Показано, что подобная система трансдукции работает и в случае других гормонов растений, например, этилена [Stock A.M. et al., 2000]. Однако, в литературе есть данные о содержании цитокининов в цитоплазме, ядре и хлоропластах [Sossountzov L. et al., 1988; Ivanova M. et al., 1994; Benkova E. et al., 1999; Kasahara H. et al., 2004]. В связи с этим, можно предполагать существование альтернативных, внутриклеточных форм рецепторов для этих гормонов. Один из таких белков - цитокинин-связывающий белок (ЦСБ) 67 кД, был выделен из клеток листьев ячменя [Kulaeva O.N. et al., 1995]. Он способен регулировать транскрипцию в системе in vitro, содержащей цитокинин. В нашей лаборатории из этиолированных проростков кукурузы также был выделен цитокинин-связывающий белок со свойствами рецептора - ЦСБ-70 [Бровко Ф.А. и др., 1996]. К нему была получена панель моноклональных антител, с помощью которых бьшо показано, что ЦСБ-70 имеет общие иммунодетерминанты с ЦСБ-67, и способен заменять его в опытах по активации транскрипции в системе из листьев ячменя [Kulaeva O.N. et al., 1998]. Внутриклеточный цитокинин-связывающий белок, связываясь с цитокинином, активируется и проникает в ядро или другие ДНК-содержащие органеллы, где принимает участие в регуляции транскрипции.
g Применение методов иммунохимии с использованием высокоспецифичных
моноклональных антител дает возможность установления внутриклеточной локализации
ЦСБ-70. Исследование же корреляции между содержанием рецепторного белка в тканях и
активностью в них гормон-регулируемых процессов, несомненно, помогло бы прояснить
многие аспекты его функционирования.
Исходя из сказанного выше, цель данной работы - изучить тканевую и клеточную локализацию цитокинин-связывающего белка ЦСБ-70. Для ее достижения мы выделили следующие задачи:
Подобрать условия выявления с помощью моноклональных антител на срезах этиолированных проростков кукурузы.
Подобрать антитела для дифференцированного выявления ЦСБ-70 в органеллах растительных клеток.
Исследовать локализацию ЦСБ-70 в ядрах различных типов тканей этиолированных проростков кукурузы с помощью сочетания методов иммуноцитохимии, световой и электронной микроскопии.
С помощью сочетания методов иммуноцитохимии, световой и электронной микроскопии исследовать особенности локализации ЦСБ-70 в пластидах разных типов клеток этиолированных проростков кукурузы.
Передача гормонального сигнала в растениях
По сравнению со сложной многокомпонентной гормональной системой животных, в растениях выделяют всего шесть групп фитогормонов: ауксины, гиббереллины (ГК), цитокинины, брассиностероиды, абсцизовая кислота (АБК) и этилен. С недавних пор к гормонам относят также оксилипины и салициловую кислоту. В целом пути передачи сигнала в растении до конца не выяснены, однако некоторые элементы гормональной рецепции уже изучены в деталях.
Первоначально механизм гормонального ответа растений исследовали в основном с помощью биохимических и молекулярных методов, но в последнее время значительный прогресс в этой области достигнут благодаря исследованию мутантов с измененным ответом на фитогормоны.
Ауксины, представители первого из упомянутых нами классов, являются производными индолилуксусной кислоты. Они участвуют в регуляции деления и растяжения клеток, роста и развития корневой системы. Первым среди рецепторов этих гормонов был выделен мембранный ауксин-связывающий белок 22 кД (ABP1) из проростков кукурузы [Lobler М, Klambt D., 1985]. С помощью моно- и поликлональных антител, полученных к нему, было показано, что ABP1 является консервативным для однодольных и двудольных растений [Napier R.M., Venis M.A., 1992]. Данный белок обеспечивает ауксин-зависимое растяжение клеточных стенок [Leblanc N. et al., 1999; Chen J.G. et al., 2001]. Этот рецептор расположен главным образом на мембране эндоплазматического ретикулума и в диктиосомах, частично на цитоплазматической мембране клетки, некоторое количество ABP1 было обнаружено в ядрах эпидермиса [BattS., Venis M.A., 1976; Jones A.M., Herman E.M., 1993; Bronsema F.B.F. et al., 1998]. Показано, что АВР1 на цитоплазматической мембране участвует в ответе клетки на экзогенный ауксин, в частности, в гиперполяризации клеточной мембраны, приводящей к растяжению клеточной стенки [Leblanc N. et al., 1999], однако, удовлетворительных объяснений преимущественной локализации этого белка в эндоплазматическом ретикулуме пока не предложено. В недавнее время найден растворимый ауксин-связывающий белок 57 кД [Kim Y.S. et al., 1998]. Показано, что этот белок также участвует в изменении заряда клеточной мембраны, взаимодействуя с Н+-АТФазой внутри клетки [Kim Y.S. et al., 2001]. В последний год в литературе появились сведения об обнаружении ядерного рецептора ауксина [Bodescu et al., 2006].
Гиббереллины, представляющие собой карбоновые кислоты дитерпеноидной природы, стимулируют рост стебля и плодов, участвуют в регуляции цветения растений, и прорастания семян, индуцируют партенокарпию. В настоящее время проводится обширное исследование путей передачи гиббереллинового сигнала в клетке. В 2005 г. появилась публикация об обнаружении гена dwarf 1, кодирующего растворимый белок-рецептор гиббереллина [Ueguchianaka М. et al., 2005]. В 1997 г. впервые описаны белки семейства RGA/GAI, осуществляющие негативную регуляцию гиббереллин-зависимых генов [Peng J. et al., 1997; Silverstone A.L. et al., 1997]. Они локализуются в ядре, репрессируя гиббереллин-зависимые гены [Itoh Н. et al., 1999; Ogawa М. et al., 2000]. Гормон способен вызывать разрушение RGA/GAI-белков, деблокируя транскрипционный процесс. Хотя механизм разрушения регуляторных белков под воздействием гиббереллина до конца не установлен, показано, что для включения деградации этого белка важна 17-аминокислотная последовательность (DELLA домен), находящаяся на N-конце молекулы репрессора: мутации, затрагивающие этот участок, делают регуляторный белок устойчивым к воздействию гормона [Dill A. et al., 2001]. Негативную регуляцию гиббереллиновой сигнализации осуществляет и продукт гена spindly (spy) [Jacobsen S.E., Olszewski N.E., 1993]. SPY-белок, расположенный в цитоплазме и ядре [Swain S.M. et al., 2002], является o-N-ацетилглюкозамин-трансферазой [Thornton T.M. et al., 1999]. Найдены и позитивные регуляторы гиббереллинового ответа, например, продукт гена phorl (photoperiod responsive), активирующий гормон-зависимые гены. Интересно, что локализация этого белка меняется под воздействием гормона: после обработки культуры клеток табака гиббереллином PHOR1 перемещается в ядро, а под воздействием ингибиторов биосинтеза гормона - в цитоплазму [Amador V. et al., 2001; Monte E. et al., 2003]. Еще один белок, обеспечивающий передачу гиббереллинового сигнала в клетке, SLY1. Он принадлежит к группе F-бокс белков, участвующих в убиквитинилировании протеиновых молекул для их последующего разрушения [McGinnis К.М. et al., 2003]. SLY1 предположительно участвует в гиббереллин-зависимой деградации RGA/GAI-белков [Dill A. et al., 2004]. Абсцизовая кислота (АБК) и ее аналоги - представители сесквитерпеноидов. Физиологически, они действуют, как антагонисты ауксина, цитокининов и гиббереллинов, подавляя вызваннные ими ростовые реакции. АБК участвует в индукции покоя семян, почек, клубней. Кроме того, АБК влияет на закрытие устьиц, обеспечивая устойчивость растений к засухе. О молекулярных механизмах действия этого гормона пока известно немногое. Обладающий свойствами рецептора 42 кД АБК-связывающий белок был впервые выделен из эпидермиса листьев кормовых бобов в 2002 г. [Zhang D.-P. et al., 2002]. Этот белок расположен на цитоплазматической мембране замыкающих клеток устьиц и участвует в гормон-зависимой активации фосфолипазы D, которая продуцирует фосфатидную кислоту. Дальнейшая индукция гормонального сигнала включает изменения цитоплазматического рН, концентрации цитоплазматического кальция, мембранного потенциала и фосфорилирования белков, возможно через митоген-активируемые протеинкиназы, активацию АБК-зависимых генов [Ritchie S., Gilroy S., 1998; Wang X., 1999]. Еще один АБК-связывающий белок с молекулярной массой 52 кД (АВАР1), выделен из клеток алейронового слоя ячменя. Показано, что гомологичные abapl гены имеются как у однодольных, так и двудольных растений. При исследовании микросомальных фракций обнаружено, что АВАР1 связан с мембраной, однако неясно, каким образом, поскольку является гидрофильным белком. Не выяснена и его роль в передаче гормонального сигнала, хотя предполагается, что содержащийся в С-концевой области WW-домен может взаимодействовать с другими белками ответа на АБК, образуя сигнальный комплекс. С другой стороны, WW-домен может отвечать за прикрепление АВАР1 к мембране [Razem F.A. et al., 2003]. В передаче сигнала АБК также принимает участие ассоциированная с мембраной ГТФаза ROP10, обнаруженная в Arabidopsis thaliana, которая предположительно является отрицательным регулятором сигнального пути АБК [Zheng Z. et al., 2002]. В последний год опубликованы сведения о недавно открытом белке FCA, способном связываться с РНК, который по данным автора является рецептором АБК [Razem et al., 2006].
Гены первичного ответа на цитокинин и их продукты -регуляторы ответа
В ряде работ [D Agostino LB. et al., 2000; Hwang I., Sheen J., 2001; Taniguchi M. et al., 1998; Imamura A. et al., 1998] было показано, что у A. thaliana существует большое семейство генов ARR (22 представителя), которые по структуре делятся на две группы (рис. 2), 10 генов группы А и 12- группы В, выполняющие разные функции в передаче гормонального сигнала.
ARR группы А содержат воспринимающий домен с короткими N- и С-концами, тогда как ARR группы В имеют длинную С-концевую часть с ДНК-связывающим участком, что указывает на их ядерную локализацию. Кроме того, характерно, что уровень содержания мРНК ARR типа А увеличивается в ответ на воздействие экзогенных цитокининов, а содержание мРНК ARR типа В не зависит от экзогенных цитокининов. Таким образом, ARR типа А - гены первичного ответа на цитокинин [D Agostino I.B. et al., 2000; Imamura A. et al., 1999]. Некоторые недавние исследования показали, что регуляторы ответа А-типа действуют как негативные регуляторы цитокининовой сигнализации. Множественные мутации an приводят к цитокининовой гиперчувствительности и увеличивают как силу, так и период цитокининовой индукции первичных генов ответа на цитокинин, тогда как оверэкспрессия ARR типа А вызывает снижение ответа на цитокинин на физиологическом и генетическом уровне [Hwang I., Sheen J., 2001; Grefen Ch., Harter K., 2004]. Интересно, что в случае оверэкспрессии отмечается супрессия цитокининовой индукции самих регуляторов ответа типа А, т. е. регуляция собственной экспрессии по принципу отрицательной обратной связи. Это объясняет быстрое снижение индукции цитокинином ARR А-типа при оверэкспрессии одного из генов этого типа [D Agostino I.B. et al., 2000]. При этом, репрессорное действие ARR А-типа не снималось мутацией в воспринимающем домене по консервативному аспартату, способному принять фосфатную группировку, таким образом, осуществление негативного контроля этими белками не требует обязательного участия фосфатного каскада [Hwang I., Sheen J., 2001]. Анализ активности промоторов генов ARR типа А в трансформированных растениях A. thaliana обнаружил определенную тканеспецифичность транскрипции для различных белков этого подкласса [D Agostino I.B. et al., 2000; Kiba Т. et al., 2002; Deji A. et al., 2002], причем для гена ARR5 было показано, что активность его промотора в тканях стебля изменяется на разных стадиях их роста и дифференцировки: в процессе регенерации стеблей у корневых эксплантов A. thaliana промоторная активность ARR5 наблюдалась в участках каллусной ткани из которых в дальнейшем должны были возникнуть стебли, но отсутствовала в дифференцирующихся тканях стеблей. Это дает возможность считать, что ARR5 играет регуляторную роль в дифференцировке клеток при формировании стебля. При обработке проростка цитокинином промоторная активность ARR5 обнаруживалась во всех органах и тканях, из чего можно заключить, что большинство клеток отвечает на цитокининовый сигнал экспрессией ARR5 [Che P. et al., 2002]. Внутриклеточное расположение ARR также различается. Большинство этих белков находится в ядре, но некоторые из них, например ARR4 и ARR16, также присутствуют и в цитоплазме [Hwang I., Sheen J., 2001; Kiba Т. et al., 2002]. Отличия в локализации ARR А-типа и их экспрессии в тканях могут отражать их различные функции в клетке. ARR типа В также принимают участие в передаче цитокининового сигнала. Их продукты являются цитокинин-зависимыми транскрипционными факторами и постоянно находятся в ядре [Lohrmann J. et al., 1999; Hwang I., Sheen J., 2001]. Есть данные, что ARR В-типа могут фосфорилироваться АНР-белками, участвующими в перед сигнала от сенсорной гистидин-киназы, причем какой-либо специфичности взаимодействия разных фосфотрансмиттеров с белками ARR типа В не обнаружено [Suzuki Т., Sakurai К. et al., 2001; Imamura A. et al., 2003]. Как показано для ARR2, фосфорилирование не влияет на его локализацию и ДНК-связывающую активность, но положительно влияет на способность к активации транскрипции [Grefen Ch., Harter К., 2004]. Тем не менее, экспрессия некоторых регуляторов ответа В-типа дает активацию промотора ARR6 даже в отсутствие экзогенного цитокинина, а мутационная замена принимающего фосфат аспартата на аспарагин не влияет на способность белка регулировать транскрипцию цитокинин-зависимых генов, как в присутствии, так и в отсутствие гормона [Hwang I., Sheen J., 2001]. Эти данные указывают на то, что ARR типа В способны участвовать не только в передаче гормонального сигнала, но и в общей регуляции транскрипции в клетке. С-концевая область ARR белков В-типа содержит высококонсервативный участок -GARP-домен, ответственный за специфичное связывание ARR В-типа с определенными последовательностями ДНК в промоторе генов ARR А-типа, что вызывает активацию соответствующих генов. Анализ структуры ДНК генов ARR А-типа, в области непосредственного контакта с GARP-доменом ARR белка В-типа выявил обязательное присутствие в ДНК последовательности (C/A)GAT(T/C). Эта последовательность содержится в промоторах всех ARR А-типа, что указывает на возможность активации транскрипции генов ARR А-типа ARR белками В-типа [Reichmann J.L. et al., 2001; Rashotte A.M. et al., 2003]. В свою очередь, регуляторы ответа А-типа, как предполагают, способны влиять на активацию экспрессии с помощью ARR группы В. Согласно одной гипотезе, ARR типа А суппрессируют активацию фосфотрансмиттерами ARR В-типа, по другой версии, они могут усиливать активность неких негативных регуляторов белков ARR В-типа [То J.P.C. et al., 2004]. Таким образом, в передачу цитокинииового сигнала вовлечены ARR белки обеих групп.
Иммуноферментный анализ влияния фиксации и дегидратации на сохранение иммунореактивности ЦСБ-70
Электрофорез препарата ЦСБ-70 проводили в системе Laemlii в ПААГ (10% w/v) с добавлением 0.1% додецилсульфата натрия [Laemlii U.K., 1970]. После проведения электрофореза белки из геля переносили на нитроцеллюлознуто мембрану Hybond C-extra (Amersham, Англия) в аппарате для полусухого блоттинга Biometra (Германия) в буфере для переноса (Трис-HCl, рН 8.3 - 25 мМ, глицин - 150 мМ, метанол - 10%). Для визуализации маркеров мембрану окрашивали 0.1% раствором Ponceau S в 1%-ной уксусной кислоте. Затем мембрану отмывали в буфере (Трис-HCl, рН 7.6 - 50 мМ, NaCl - 150 мМ, Твин-20 -0.2%) и инкубировали в растворе В (ТБСТ с добавлением обезжиренного сухого молока -3.5% и БСА - 1%) в течение 1 ч. После этой и последующих инкубации мембрану отмывали в буфере ТБСТ 3 раза по 5 мин. Мембрану инкубировали с различными мышиными моноклональными антителами против ЦСБ-70 в концентрации 0.1 мкг/мл в ТБСТ в течение ночи, с биотинилированными антимышиными антителами (1 : 1000) в ТБСТ (Amersham, Англия) 1 ч и со стрентавидин-фосфатазой (1 : 3000) в ТБСТ (Amersham, Англия) 1 ч. Далее проводили отмывку в буфере АР (Трис-HCl, рН9.5 - 50 мМ, NaCl - 150 мМ, MgCb -10 мМ). Для проявления продукта реакции использовали раствор 3.8 мМ 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфата и 4 мМ нитросинего тетразолия в буфере АР. сохранение иммунореактивности ЦСБ-70
Предварительная работа показала, что ЦСБ-70 является нестабильным белком, иммунореактивность которого по отношению к моноклональным антителам значительно снижается при воздействии различных химических агентов. Для предварительной оценки влияния на иммунореактивность ЦСБ-70 способов фиксации растительных тканей мы использовали иммуноферментный анализ белкового экстракта проростков кукурузы, сорбированного на твердую подложку и обработанного различными фиксаторами. На иммунопланшеты с высокой сорбцией (Costar, Голландия) наносили содержащий ЦСБ-70 раствор растительных белков с концентрацией 5 мкг/мл в 100 мМ карбонат-бикарбонатном буфере рН 9.6; белки сорбировали на поверхность иммунопланшета при 4С в течение ночи. Для количественной оценки результатов фиксации использовали для сорбции экстракт растительных белков в разных разведениях от 6 до 0.05 мкг/мл белка (120— 1% выявляемого ЦСБ-70); лунки с образцами, содержащими различную концентрацию белка, не обрабатывались фиксаторами и спиртами и служили контролем. В дальнейшем по иммуноцитохимической реакции контрольных образцов с разной концентрацией белка строили калибровочную кривую. Лунки с сорбированными растительными белками отмывали буфером ФБС (Na2HP04- 16.7 мМ, КН2Р04 - 3.3 мМ, NaCl - 150 мМ, рН 7.4) Зраза по 15 мин. Сорбированные на лунках планшета белки оставляли необработанными (в контроле), либо обрабатывали при 4С в течение 2 ч фиксатором № 1 (ФБС с добавлением параформальдегида - 2%, глутаральдегида - 1%, пикриновой кислоты - 0.01%), № 2 (ФБС с добавлением параформальдегида - 3%, глутаральдегида - 0.5%, пикриновой кислоты -0.01%) или № 3 (ФБС с добавлением параформальдегида - 4%, глутаральдегида - 0.1%, пикриновой кислоты - 0.01%). Белки отмывали от фиксатора буфером ФБС трижды по 15 мин, затем проводили дегидратацию по 30 мин в 25, 50, 70 и 96 спирте, в лунках, служащих для контроля, эта стадия была исключена. Все последующие реакции производили в буфере ФБС-Т (Na2HP04 - 16.7 мМ, КН2Р04 - 3.3 мМ, NaCl - 200 мМ, Тритон Х-100 - 0.1%, рН 7.4), после каждой лунки отмывали трижды по 15 мин буфером ФБС-Т. Для снижения неспецифического связывания антител с растительными белками лунки инкубировали 1 ч с 1% раствором БСА при комнатной температуре. Затем наносили моноклональные антитела в разведении 1 : 500, инкубировали при 4 С в течение ночи. После отмывки инкубировали 1 ч при комнатной температуре с биотинилированными антимышиными антителами (Amersham, Англия) в разведении 1 : 1000, снова отмывали. Наносили стрептавидин фосфатазный конъюгат (Amersham, Англия) в разведении 1 :3000, инкубировали 1 ч при комнатной температуре. Проводили отмывку ФБС-Т 2 раза по 15 мин и буфером АР. Для проявления использовали раствор 2.5 мМ /мштрофенолфосфата в буфере АР. Поглощение измеряли при 405 нм на спектрофотометре Ultrospec II (LKB, Швеция). Для предварительной оценки влияния на иммунореактивность ЦСБ-70 агрессивных реагентов, используемых в процессе иммуноцитохимического мечения растительных тканей, мы проводили иммуноферментный анализ экстракта белков проростков кукурузы, сорбированного на твердую подложку и обработанного выбранным фиксатором и различными реагентами, применяемыми в иммуноцитохимии. Для оценки возможности применения пероксидазы в иммуноферментном выявлении ЦСБ-70 проверяли воздействие на иммунореактивность исследуемого белка ингибиторов эндогенной пероксидазы - НС1 и Н2О2. Для оценки возможности усиления иммунной реакции после фиксации проверяли воздействие на иммунореактивность ЦСБ-70 NaIC 4 с последующей обработкой NaBH4. Оценивали также разные способы блокирования неспецифического связывания антител с растительными белками. Сорбированные на лунках планшета так, как указано в методике 2.1.6 белки 2 ч инкубировали с фиксатором № 3 при 4С, подвергали дегидратации и после отмывки ФБС-Т (трижды по 15 мин) обрабатывали одним из следующих способов:
Исследование воздействия на ЦСБ-70 реагентов, используемых для обработки растительного материала
Дальнейшая разработка процедуры иммуноцитохимического исследования проводилась на срезах различных частей 4-дневного этиолированного проростка кукурузы. В предварительных экспериментах нами делались попытки использования для заливки образцов смолы Сперра, которая часто используется для растительного материала [Roland J.C. and Vian В., 1991]. Она легко проникает в клетки и хорошо сохраняет структуру тканей, однако эта среда является гидрофобной и препятствует проведению иммуноцитохимической реакции. Процедура протравливания смолы в парах брома, которую рекомендуется проводить в случае необходимости иммуномечения срезов Sossountsov, 1988], приводила к нарушению антигенных детерминант белка. Во многих работах рекомендуется использовать для иммобилизации материала водорастворимые среды на основе ПЭГ [van Lammeren А.А.М., 1985; Bronsema F.B.F. et al., 1998], однако образцы, залитые в такие среды невозможно использовать для получения ультратонких срезов. Подбирая методику выявления исследуемого белка, мы учитывали возможность ее использования как для световой, так и для электронной микроскопии, поэтому для заливки образцов была использована гидрофильная метакрилатная смола LR White. В некоторых источниках есть указания, что при использовании этой заливочной среды допустима дегидратация образцов до 70% спирта, при этом достигается лучшее сохранение антигенных свойств белков [Timms B.G., 1986; Миронов А.А. и др., 1994]. Однако, опыт показал, что такого обезвоживания для исследуемых образцов недостаточно, поскольку это плохо сказывается на пропитке и дальнейшей заливке материала, и нам пришлось использовать обезвоживание до 96% спирта. В работе исследовались образцы разного размера и морфологии, требующие разной длительности пропитки. Если для кончика корня, толщина которого составляла менее 1 мм, требовалось не более недели выдерживания в смоле, то узел растения, диаметр и высота которого составляли не менее 3 мм, нуждался в более длительной обработке. Поэтому мы были вынуждены определять время пропитки для каждой партии эмпирически. Растительный материал выдерживали в смоле несколько недель, и каждые несколько дней проводили контрольную заливку одного из образцов. Залитый материал резали на микротоме, определяя качество полученного блока, если результат был удовлетворительным, заливали в блоки все образцы этой партии. Рекомендуемая процедура заливки блоков при высокой температуре (60С) была нами исключена, поскольку ЦСБ-70 оказался неустойчив к термическим воздействиям. Поэтому мы проводили фотополимеризацию смолы с помощью ультрафиолета при комнатной температуре. Подводя итог вышесказанному, для дальнейшей работы нами была выбрана следующая процедура подготовки образцов: обезвоживание до 96% спирта, пропитывание в повышающихся концентрациях смолы LR White, затем выдерживание образцов в чистой смоле до полной пропитки, в зависимости от природы образца. 2.2.1.3. Подбор условий для иммуноцитохимического выявления ЦСБ-70 на срезах растительной ткани Условия проведения реакции подбирались таким образом, чтобы обеспечить минимальный уровень фонового окрашивания в контроле. Для оценки эффективности блокирования неспецифической реакции подбор условий осуществляли, используя три варианта контроля. В варианте I исключали первые антитела против ЦСБ-70. Этот контроль позволял оценить уровень фонового окрашивания, вызванного неспецифическим связыванием вторых антител и стрептавидин-ферментного конъюгата. Ориентируясь на I вариант контроля, подбирали концентрацию вторых биотинилированных антител и стрептавидин-фосфатазного конъюгата, продолжительность и условия отмывок, компоненты буфера для отмывки. Во II варианте контроля в качестве первых антител использовали моноклональные мышиные антитела 9Е10 против Мус-белка. Этот белок является онкомаркером животных клеток и заведомо отсутствует в растительных тканях, кроме того, его структура настолько уникальна, что антитела к нему практически не дают перекрестных реакций с другими белками. Таким образом, II вариант контроля позволял оценить снижение фонового окрашивания, вызванного неспецифической сорбцией моноклональных мышиных антител на срезах за счет гидрофобных или электростатических взаимодействий, исключая возможные специфические перекрестные реакции. В III варианте контроля вместо моноклональных антител к ЦСБ-70 использовали сыворотку неиммунных мышей. Поскольку в ней содержатся поликлональные антитела, обладающие значительным разнообразием, в том числе и способные перекрестно реагировать с какими-либо антигенами на растительном срезе, данный контроль служил для оценки снижения взаимодействия антител с молекулами на срезе растительной ткани, обладающими способностью связывать мышиные антитела. Оценивая качество контролей II и III, подбирали продолжительность первой обработки срезов блокирующим раствором, время инкубации с первыми антителами, их концентрацию. Условия, при которых все три варианта контроля выглядели идентично (с минимальным окрашиванием), использовались далее в эксперименте.
