Содержание к диссертации
Введение
Литературный обзор , 7
Введение: Организация генов метаболических путей биодеградации ароматических ксенобиотиков 7
Верхние пути
1. Гены пути jwe/ш-расщепления ароматического кольца 9
1.1 Экстрадиольные диоксигеназы IО
2. Гены пути о/?то-расщепления ароматического кольца 11
2.1Гены модифицированных орто-путей 12
2.2 Интрадиольные диоксигеназы 13
Нижние пути
3. Гены периферических (нижних) ферментов метаболических путей 15
3.1 Диоксигеназы многокомпонентных ароматических колец 15
3.2 Монооксигеназы 16
З.З Дегалогеназы 17
4. Регуляторные гены. Транскрипционная регуляция метаболических путей биодеградации ароматических ксенобиотиков 18
5. Механизмы генетической адаптации микроорганизмов к утилизации ароматических ксенобиотиков
5.1 Перенос генов „ „ 20
5.2 Точечные мутации 22
5.3 Геномные перестройки 24
5.4 Дупликация генов , , 25
5.5 Транспозиции 2
5.6 Инсерционная активация 27
6. Основные подходы и методы молекулярной систематики, филогении для идентификации микроорганизмов и микробных сообществ 27
Материалы и методы , 30
1. Культивирование, отбор и адаптация бактериальных культур 30
2. Выделение геномной ДНК изучаемых культур 31
3. Методика ПЦР-клонирования 168-рДНК последовательностей из тотальной ДНК культур 31
4. Разделение гетерогенных ПЦР-продуктов путем молекулярного клонирования в векторную систему pGEM-Easy 32
5. Клонирование ПЦР-продуктов генов ключевых ферментов путей утилизации ЛОС из тотальной ДНК культур 32
6. Штаммы-реципиенты, использованные при клонировании 34
7. ПДРФ-анализ плазмидных клонов-и продуктов ПЦР 34
8. Измерение удельной активности типированных диоксигеназ
Результаты и их обсуждение 37
1. Выделение и адаптация культур микроорганизмов-деструкторов к утилизации различных ксенобиотиков 37
2. Формирование выборки клонов и ПДРФ-анализ полученных конструкций с последовательностями 1 бБ-рДНК 38
3. Анализ последовательностей отобранных клонов и восстановление видового состава консорциумов. Доминантными минорные компоненты консор циумов. Изучение таксономического положения вновь охарактеризованных по последовательности рДНК доминантных культур консорциумов 50
4. ПЦР-клонирование генов ключевых ферментов, ответственных за утилизацию ЛОС по орто- и мета-пути. Сравнительная характеристика нуклеотид-ных последовательностей обнаруженных генов и их соотнесение с соответствующими консорциумами 77
5. Изучение специфической активности диоксигеназ исследуемых культурах 97
IV. Выводы 102
V, Список использованных источников , 103
VL Приложение , 1
Введение к работе
В условиях постоянно возрастающих объемов промышленного и сельскохозяйственного производства, все большую актуальность приобретают вопросы защиты окружающей среды и, в частности, атмосферы от разнообразных техногенных загрязнителей. Основной вклад в промышленное загрязнение воздуха вносят предприятия химической, целлюлозно-бумажной, лакокрасочной и пищевой промышленности, сельскохозяйственные и перерабатывающие предприятия, комплексы интенсивного животноводства, предприятия, осуществляющие очистку сточных вод и обезвреживание отходов. Промышленные предприятия являются источниками выбросов в атмосферу токсичных и пахучих веществ, которые даже в небольших концентрациях вызывают у людей чувство дискомфорта, создают угрозу жизни и здоровью.
В последнее время для очистки индустриальных вентиляционных выбросов, содержащих летучие органические соединения, все шире применяются микробиологические методы, появившиеся в связи с интенсивным развитием промышленной биотехнологии.
Действие микробиологических воздушных фильтров основано на деструкции органических субстратов микроорганизмами, приводящей, в конечном итоге, к образованию продуктов терминальной минерализации - СОг и воды. В отличие от методов химического окисления (каталитического, плазменного и обычного сжигания) при работе микробиологических фильтров не образуется окислов серы и азота, хлора и других экологически опасных веществ. В отличие от адсорбции и фильтрования через селективные мембраны, эксплуатация микробиологических фильтров не ведет к образованию и накоплению отработанных мембран и сорбентов, загрязненных удалявшимися из воздуха продуктами. Биофильтры эффективны, не загрязняют окружающую среду, просты в эксплуатации, поэтому могут широко использоваться в технологических процессах утилизации основного объема промышленных и бытовых органических загрязнителей.
Широкое применение микробиологической очистки воздушных выбросов в промышленных условиях нуждается в современных методах мониторинга состояния работающих систем, а также выявления и характеристики процессов и механизмов организации микробных сообществ внутри работающих биофильтров. Методы микробиологической идентификации и типирования культур, не утрачивая своей актуальности, в настоящее время уже не могут обеспечить достаточную точность и быстроту анализа.
Развитие молекулярных методов идентификации микроорганизмов и их применение в таксономии и экологии позволяет наиболее адекватно применять методы геносистематики и молекулярной биологии на практике при анализе природных и промышленных микробных сообществ.
Основное достоинство молекулярно-генетических методов типирования бактериальных культур заключается в возможности предварительной видовой идентификации микроорганизмов непосредственно в составе различных консорциумов с получением статистически достоверных данных о количественном и качественном составе таких консорциумов.
Пели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выделение, отбор и адаптация новых культур-деструкторов различных ароматических ксенобиотиков, определение их видовой принадлежности и отличительных характеристик с использованием методов геносистематики и молекулярной биологии, а также оценка их метаболического потенциала в отношении ряда ароматических ксенобиотиков.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Отобрать новые устойчивые бактериальные культуры, адаптированные к утилизации следующих ЛОС: толуол, стирол, этилбензол, о- и м-ксилол, нафталин
2. Молекулярно-биологическими и микробиологическими методами качественно и количественно охарактеризовать состав микробных культур и консорциумов, способных успешно утилизировать указанные ЛОС в лабораторных условиях.
3. Обнаружить и охарактеризовать последовательности генов ключевых ферментов метаболизма ЛОС в геноме изучаемых культур.
4. Изучить специфическую активность обнаруженных ключевых ферментов у охарактеризованных культур
