Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор 9
2.1. Протеомика: задачи и метольт 9
2.2. Сиквенированне белков и масс-спектромеария 10
2.2.1. Деградация Эдмана 11
2.2.2. Бомбардировка быстрыми атомами. 32
2.2.3. Ионизация в электроспрее 14
2.2.4. Ионизащія MALDI 18
2.2.5. Таидемные масс-спектрометры 20
2.2.6. Основы интерпретации тандемньь: масс-спектров пептидов 26
2.2.7. Современные задачи 29
2.3. Изотопные метки специфичные к тиольным группам 30
2.3.1. Селектишїая модификация цистеина., 30
2.3.2. Метки ІСАТ 31
2.3.3. Другие метки 34
2.4. Изотопные метки специфичные к аминогруппам ЗВ
2.4Л. С ел ектийная модификация аминогрупп лизина 38
2.4,2- Восстановительное диметилирование 39
2.4.3. Метки iTraq 42
2.4.4. Метод 1V1CAT 4
2.4.5. Другие метки , 51
3. Экспериментальная часть 54
3.2.. Синтез изотопных реагентов 54
3.2- Модификация белков и пептидов изотопными метками 64
3-4. Хроматомасс-спектрометрический анализ 68
3.5. Биоинформатика. 70
3.6, Биологические эксперименты 72
3.7, Проте омический анализ биологических объектов 74
3.8. Биохимические эксперименты 75
4. Обсуждение результатов 77
4.1. Метод изотопных аналогов с использованием меток епешіфичньгх к тиольлым группам 77
4.2. Метод изотопных аналогов с использованием меток специфичных к концевым аминогруппам пептидов &7
4.3. Биоинформатика 99
4.4. Протеомичсскшї анализ биологических объектов 103
5. Выводы 1^3
6. Список литературу 124
- Протеомика: задачи и метольт
- Таидемные масс-спектрометры
- Модификация белков и пептидов изотопными метками
- Метод изотопных аналогов с использованием меток епешіфичньгх к тиольлым группам
Введение к работе
Актуальность проблемы. Протекание биологических процессов (как то фаза роста, метаболический цикл, патологические изменения или воздействие лекарства) связано с изменением белкового состава клеток или биологических жидкостей. В этой связи глобальное исследование различных протеомов (наборов всех белков клетки, ткани и т.п.) - является первостепенной задачей, как для фундаментального понимания биологических процессов, так и для разработки новых методов лечения или диагностики различных болезней.
К решению данной задачи можно подходить путем сравнения различных протеомов для выявления белков, содержание которых значительно меняется в ответ на определенное воздействие, например, какое-либо заболевание и которые представляют наибольший интерес для дальнейшего изучения. Данными исследованиями занимается сравнительная протеомика, все более важным требованием к которой становится способность количественной оценки изменений белкового состава клетки, ткани или физиологической жидкости. В то же время масс-спектрометрия, которая продолжает играть ключевую роль в протеомических исследованиях, сама по себе не является количественным методом и нуждается в дополнительных аналитических методах. Наиболее признанной методологией в настоящее время является дериватизация белков (пептидов) с использованием стабильных изотопов (2Н, 13С, 15N, 180) для создания "изотопных аналогов" (Рис. 1).
Можно выделить 3 основные группы методов введения стабильных изотопов: метаболические, энзиматические (протеолитические) и химические. Метаболические методы заключаются в использовании изотопсодежащих исходных веществ для процессов обмена, например, при росте клеток. Энзиматические методы основаны на проведении протеолиза белков в обычной и тяжелой (180) воде. Основным преимуществом энзиматических и метаболических методов является отсутствие дополнительных стадий в процессе приготовления образцов, в то же время существует и ряд фундаментальных ограничений. Так, например, в случае метаболических методов использование тяжелых изотопов часто приводит к нарушению биологических процессов, кроме того данные методы применимы в основном только для клеточных моделей. Для протеолитических методов одной из основных проблем является различная степень введения изотопов, а также обратный изотопный обмен, что может приводить к значительным ошибкам измерений и снижению чувствительности вследствие уменьшения интенсивности сигнала. По причине использования только двух (легкого и тяжелого) изотопов анализ также ограничен одновременным
сравнением не более чем двух образцов, а небольшая разница в массе приводит к перекрыванию изотопных кластеров, что затрудняет интерпретацию получаемых данных.
Рис. 1. Пример схемы количественного анализа белковых смесей с
использованием метода изотопного аналога. Светло-серым цветом обозначен легкий изотоп, темно-серым - тяжелый.
Химические методы, основанные на селективной ковалентной модификации белков или полученных при протеолизе пептидов реагентами, содержащими стабильные изотопы, включают в себя те, в которых селективно модифицируется определенный аминокислотный остаток (например, цистеин), и методы, основанные на модификации функциональных групп присутствующих практически в любом пептиде, полученном при протеолизе белка, например, концевых аминогрупп. Химические методы таким образом являются наиболее универсальными и представляют наибольший интерес.
В настоящей работе нами предложены новые химические методы для изотопного мечения пептидов и белков, как определенных аминокислотных остатков, так и всех концевых аминогрупп пептидов. На основе данных подходов разработаны и охарактеризованы новые методы количественного протеомического анализа.
Цели и задачи исследования. Цель исследования состояла в создании реагентов (изотопных меток) и методов для количественного анализа сложных смесей белков с использованием хроматомасс-спектрометрии.
Для ее достижения в диссертационной работе были поставлены следующие задачи:
Дизайн и синтез изотопных меток для селективной модификации тиольных групп цистеина с возможностью последующего ковалентного выделения модифицированных пептидов на твердофазной матрице.
Разработка методов модификации белков изотопными цистеиновыми метками и последующего выделения меченых пептидов с использованием модельных смесей.
Разработка реагентов и методов для селективной изотопной модификации концевых аминогрупп пептидов, полученных при протеолизе трипсином.
Оптимизация условий модификации концевых аминогрупп пептидов изотопными метками с использованием модельных систем.
Создание комплекса биоинформатических программ для анализа масс-спектрометрических данных.
Оценка эффективности разработанных подходов путем их использования для количественного протеомического анализа биологических объектов.
Научная новизна работы. В диссертационной работе разработан и охарактеризован новый метод количественного протеомического анализа на основе изотопного мечения N-концевых аминогрупп, для этого впервые осуществлен способ селективной изотопной модификации концевых аминогрупп пептидов. Синтезирован ряд новых изотопных реагентов для осуществления селективной модификации N-концевых аминогрупп или тиольных групп цистеина. Предложена цепочка новых селективных ковалентных химических реакций для выделения меченых пептидов с использованием твердофазной матрицы. С использованием разработанных методов впервые исследовано изменение белкового состава мембран при дифференциации клеток карциномы кишечника и показано, что дифференциация приводит к селективной экспрессии на клеточной мембране более 150 белков, включая новые ранее неизвестные клеточные каналы.
Практическая значимость работы. В работе показано, что разработанные нами изотопные реагенты и методы протеомического анализа позволяют эффективно решать задачи количественной протеомики, что было продемонстрировано при анализе биологических объектов. Разработан общий подход к оптимизации условий
модификации изотопными реагентами с последующим масс-спектрометрическим анализом. Разработан комплекс биоинформатических программ, позволяющий эффективную обработку масс-спектрометрических данных.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Международных конференциях "HUPO 2nd Annual World Congress" (Монреаль, Канада, 2003), "4th International Conference of the Canadian Proteomics Initiative" (Монреаль, Канада, 2004), "52nd Annual ASMS Conference" (Нешвиль, Теннесси, США, 2004), "HUPO 3rd Annual World Congress" (Пекин, Китай, 2004), "Keystone Symposium on Proteomics and Bioinformatics" (Кейстоун, Колорадо, США, 2005), "54th Annual ASMS Conference" (Сиэтл, Вашингтон, США, 2006). Результаты исследования отражены в отечественной и зарубежной печати, используются в лекционных курсах читаемых на кафедре биохимии Монреальского университета.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 13 печатных работ.
Объем и структура работы: Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (4 главы), выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 140 страницах печатного текста, содержит 8 таблиц и 40 рисунков. Список цитированной литературы включает 122 наименования.
Протеомика: задачи и метольт
В настоящее время тіротеомика является наиболее актуальной и быстро развивающейся областью молекулярной биологии. Эта наука занимается изучением клеточных протеомов (англ. proteome), то есть наборов белков данной клетки (организма) в определенный момент времени.
Данная наука возникла как продолжение геномики - науки, занимающейся изучением геномов. Так, термин «протеом» своим происхождением обязан словам protein (белок) и genome (геном), и был впервые употреблен на конференции по двухмерному электрофорезу в 1994 году в Сиенне. Италия.
Возникновение протсомики вслед за геномикой обусловлено тем, что в клетках организмов никогда не происходит экспрессии всех имеющихся в наличии генов, а лишь части из них, поэтому информация о геноме в целом не является достаточной. Результатом генной экспрессии является образование белка. Поскольку белки являются основой всех процессов, происходящих в клетках, именно они являются наиболее интересным объектом для изучения.
До недавнего времени большая часть работ в протеомике выполнялась с использованием двумерного гель-электрофореза, однако этот метод показал себя недостаточно эффективным. Объем работ, которые необходимо выполнить в рамках протсомики, требует использования методов и приборов, отличающихся большими производительностями, информативностью и чувствительностью.
Такок ыми на данный момент являются методы, комбинирующие высокоэффективную жидкостную хроматографию и масс-опектрометрию. Достижения, сделанные в области масс-спекгрометрш в последние десятилетия, несомненно, являются ключевым моментом в быстром развитии нротеомики.
Сиквенирование белков и масс-спектроыетрия.
Общей задачей масс-спектральных экспериментов является определение струїсгурьт различных молекул путем точного измерения их масс и масс их фрагментов.
Первая попытка использования м асе-спектрометрии для определения аминокислотной последовательности пептидов была выполнена в 1959 году [3]. В своем воплощении она явилась лишь демонстрацией принципиальной возможности определения структуры пептидов с помошъю мае е-спектрометрия наряду с другими оиомолекулами, например, алкалоидами, для анализа которых масс-спектр омегрия в то время уже успела себя зарекомендовать. Реализованный метод имел ряд ограничений и, кроме того, был довольно трудоемким - включал в себя предварительную модификацию пептид иых связей во вторичные амины и карбоксильных групп в еилиловые эфйрьт соответствующих спиртов для увеличения гидрофобностй, что позволяло использовать газовую хроматографию и ионизацию электронного удара, которые в то время 1Q Таким образом, предложенный метод не смог составить конкуренцию химическим подходам к определению аминокислотной F последовательности, использовавшимся в то время.
Таидемные масс-спектрометры
Основополагающими в области тандемной масс-спектрометрии являются работы МакЛафсрти и Дженингса, опубликованные в 196S году [9, 10], и послужившие толчком к совершенствованию приборов и методов для получения информации о спектрах фрагментации изолированных но массе ионов.
Принципиальная схема тан д ємного мас с-спектрометр а изображена на Рис. 5. MS2 D IS ее MSI г / масс-анализатор / мае с-анализатор / источник камеоа соудаоений детектор
Схема тандемного масс-спектрометра; в MS1 происходит выбор иона по отношению массы к заряду для фрагментации; в СС происходит фрагментация выбранных ионов, в MS2 происходит разделение дочерних ионов.
Первым типом тандемных масс-спектрометров выл традиционный масс-спектрометр высокого разрешения с обратной геометрией (Рис- 6) [30]. В масс-спектрометрах такого типа используется отклонение с помощью магнитного сектора для изоляции иона подлежащего фрагментации и определение отношения масс дочерних ионов к их заряду в электрическом секторе (MIKES-анали ). магнитный сектоп электрический сектоо детектор источник ионов I
Принципиальная схема секторного масс-спектрометра с обратной (BE) геометрией.
Разрешение такого прибора невысоко как по родительским, так и по дочерним ионам. Значительно улучшить разрешение возможно с использование двойной фокусировки, схема прибора такого типа — тандемного масс-спектрометра ЕВ-ЕВ геометрии [31] изображена на Рис. 7.
В начале 80-х были созданы тройной квадруполъньш масс-спектрометр (Рис, В) [32] к гибридный сектор-квадрупольный масс-спектрометр [33].
Квадрупольный мае с-анализатор (Рис, 9) представляет собой систему четырех электродов. к которым прикладывается осциллирующее напряжение. Электрическое поле, создаваемое подобным образом, позволяет пропускать ионы только с заданным отношением nv z.
В отличие от секторных и квадрупольных анализаторов, которые позволяют прошдигь гандемные масс-спектральные эксперименты «в пространстве» (совмещая последовательно несколько анализаторов}- ионная ловушка позволяет производить МС-МС «во времени» (до 12 последовательных МС-МС) благодаря способности удерживать или выпускать ионы с заданными m/z. Кроме того данная особенность позволяет добиться увеличения чувствительности. Разрешавшая способность дашюго масс-анализатора составляет -3f000 [35].
Также следует упомянуть о времяпронетных маеQ-анализаторах [36] и гапдемных инструментах на их основе, Времяпролетный масо-анализатор использует нршпшп того, что скорость ионов, разогнанных электрическим полем, обратно пропорциональна оїТіошстіикг нх i ftx- уриду, iUKHUV vflipCiUM; ДНИ" iIOHOU tT рїСШБШІГ массами требуется различное время для преодоления расстояния ло детектора. В ремяпро летные масс-анализаторы отличаются высокими скоростями получения спектров, и на коммерчески доступных приборах обладают разрешением 10г000.
Модификация белков и пептидов изотопными метками
Образцы растворяют в буфере, с дсржащем 62.5 мМ Тш-НСЦ (рН = 6.8), 20% глицерин, 2% ДОдоцилсульфат натрия, 0.5% бромфенол синий. Дисульфидые связи е образцах восстанавливают с использованием 4 мМ дитиотреитола в гечение 1 часа при комнатной температуре и затем алкилируют 10 м лодоадетамадом Б течёшь 1 часа при комнатной температуре в темноте. 200 мкг белка из каждого образна разделяют с помощь полиакрил амид но го геля с градиентом 8-12 % акриламида. Гель красят с помощью красителя Кумасси бриллиантового синего. Каждую дорожку разрезают на 51 полоску, и производят протеолиз трипсиКом согласно протоколу [27] Полученные пептиды из каждой плоски экстрагируют 60 % ацетонитрилом, содержащим 0.1 % муравьиную кислоту, упаривают досуха и затем растворяют в 25 м л з% ацетонитрила, 0Л % муравьиной кислоте для поі:лЄдуЮШЄго хроматомасс-спектрометрического анализа.
Хроматомасс-спектрометрический анализ выполняли с использованием систем, состоящих щ хроматографа Agilent 1100 Series и масс-спектрометров Agilent LOjvISDrap-SL (тип источника ионов - ионизация в злектроспрее, тип масс-анализатора - ионная ловушка) или Applied Biosystems 40QO Q TRAP (ran источника ионов- ионизация я электроспрее, шц масе-ааалшагора - тройной кнадрупольный). Пептиды сначала обогащают на колонке с обращенной фазой Zorbax 300SH-C18 (5 мкм, 5 х 0.3 мм) и затем разделяют на аналитической колонке с фазой Zorbax 300SB-O18 (3.5 мкм, 150 х 0.075 мм) или колонке PicoFrit (New Objective) с обрал енной фазой Blobasic СІК (10 х 0,075 mm) в градиенте 5-90 % ацетонитрила в воде содержащей 0.1% муравьиной кислоты при скорости потока 200 ила 300 HJJ/МИН, В случае если хроматоірафитеское разделение не требовалосв анализируемый образец в 60 % ацетопитриле и 0Л % муравьиной кислоте впрыскивали с помощью шприца со ско оСТЬ1о —300 нл/мин.
Для масс-спектрометра LC/ltfSDrap-SL использовали следующие параметры: (а) положитслЫ[Ый режим ионизации, (б) диапазон сканирования масс от 400 до 2200 m/z, (в) скорость сканирования - 13000 nv zxc"1, (г) "trap drive" = 90, (д) максимальное число МС/МС за один цикл = 3, (є) преґГЩ0,ІитаЄмьій заряд ионов для МС/МС = 12, (ж) после получения 2-х спектров фрагментации исключение иоиа для выбора в МС/МС; на 1 минуту. Спектры были записаны с сохранением информапш 0 профиле пиков (нецентроровавы). Для масс Спектрометра 4000 Q TRAP использовали: (а) положительный режим ионизации, (б) диапазон сканирования масс от 350 до 1600 m/z, іщЯ МС/МС от 70 до 1700 m z, (в) скорость сканирования = 4000 m/z c" ; для сканирования повышенного разрешения = 250 m/zx cc-i? (rj максимальное число МС/МС за один цикл = 3, (л) заряд ион в для выбора Б МС/МС = -% +3, +4, (є) после получения спектра фрагментации исключение иона для выбора в МС/МС на 1,5 минуты.
Интерпретацию тандемных спектров проводили с использованием компьютерной программы Spectrum Mill (Agilent Technologies).
Используя модуль программы "Data Extractor1 над МС/МС спектрами выполняют следующие операции: (а) центрирование пиков - центрированное значение m/z вычисляется исходя из площади пика, находящейся выше половины интенсивности, (6) объединение схожих спектров - спектры, предположительно относящиеся к одному и тому же исходному иону, суммируются на основании того, что 25 из 50 наиболее интенсивных, пикон в спектрах совпадают и совпавшие пики составляют более 70 % от общей интенсивности, а также объединяемые МС/МС получены в пределах ±40 секунд и значения m/z исходных ионов находятся в пределах ± 1.2 Да, и (в) сортировка спектров - оставляются только спектры, для которых отношение сигнал/шум исходного иона было 25. "sequence tag f
С помощью модуля "MS/MS search" для 25 наиболее интенсивных пиков каждого спектра выполняют поиск соответствий в базах данных аминокислотных последовательностей UniProl (ftp://fip.expasy,Grg).
Метод изотопных аналогов с использованием меток епешіфичньгх к тиольлым группам
В разработанном методе белки денатурируются, дисулъфидные связи восстанавливаются и алкштируются №фенилмалеинимидомт содержащим легкие (Н) или тяжелые (D изотопы водорода. После объединения образцов и обработки модифицированных і-рупп гидразином, белки очищаются и обрабатываются трипсином. Далее меченые пептиды ковалентно связываются с твердофазной матрицей, промываются и элюируются избытком гидразина, гидразидные группы защищаются л - ни гр обе дз альдегид ом и выполняется масс-спектр ометрический анализ (Рис. 25).
В настоящей работе ятя алкилирования тиольных групп в еоеіаве белков мы применили малешшмидьт, которые обладают более высокой стабильностью и селективностью по сравнению с традиционно используемыми галоацетатами. Кроме того, легкие и тяжелые изотопные аналоги N-фенилмалеинимида легко могут быть получены из коммерчески доступных С или Н анилина- В этом случае, ттри введении дейтерия в огноентельно полярное по сравнению с алквльным арюъное положение нивелируется H/D изотопный эффект при хроматографическом разделении модифицированных пептидов на обращенной фазе.
Для осуществления специфического и количественного выделения меченых пептидов с использованием твердофазной матрицы в процессе выполнения данной работы был разработан эффективный и оригинальный метод, С помощью масс-спектрометрии мы показали, что цистеин- с о держащие пептиды, модифицированные фени л м алейними дом, в водно-органических смесях способны селективно и с высокой скоростью реагировать с гидразином с раскрытием сукцинимидного цикла и образованием амидгидразидов (Рис. 26), Мы также зафиксировали протекание двух побочных реакций: раскрытие сухцинимида водой и образование соответствующего пиридазина, однако скорости этих побочных реакций были на 1 - 2 порядка ниже, чем скорость основного процесса. При концентрации модифицированного пептида 1 мМ и концентрации гидразина 0.1 М реакция образования амидгидразина протекает с выходом 99% за 10 минут при комнатной температуре, В то же время, замещенные гидразины значительно менее активны в данной реакции по сравнению с незамещенным гидразином (Таблица 1), что приводит к тому, что скорость основной реакции становится соизмеримой со скоростью гидролиза. Таким образом, применение замещенных гидразинов для связывания пептидов, модифицированных фенилмалеинимидом, не представляется перепекти вным.
Мы показали, что полученные амидгидразиды (Рис, 26} способны количественно при соединяться к б енз альдегидам с образованием соответствующих гидразонов. Последние, в свою очередь, быстро и количественно разрушаются под действием избытка гидразина с образо капнем исходных амидгидразинов (Рис, 27).
Описанные реакции были использованы нами для выделения модифицированных пептидов на матрице путем взаимодействия гидразида с иммобилизованными бензальдегидами (Рис. 25). Для выбора наиболее эффективной матрицы было проведено сравнение реакционной способности шести коммерчески доступных твердых фаз с подшитыми бензальдегидами (Рис, 28). Сравнение проводили с использованием синтетических пептидов ECG и RGDC, модифицированных фенил мал еинимид ом и гидразином. Подшивку проводили в среде ДМФА-вода (1:1) при комнатной температуре в течение 2 часов. Для учета неспецифического (нековалентного) связывания после подшивки матрицу промывали 1 М LiCI в 50%
