Введение к работе
Актуальность темы
Обратимое фосфорилирование белков является одним из основных механизмов регуляции процессов в живой клетке, включая перенос сигнала, дифференциацию, пролиферацию, контроль клеточного цикла и метаболизм, что делает анализ фосфобелков важной задачей при изучении ключевых клеточных функций. Считается, что около 30 % всех белков могут быть фосфорилированы в тот или иной момент времени, а количество сайтов белкового фосфорилирования в человеческом протеоме может достигать 100,000 [Kalume D.E. et al., 2003]. Результаты расшифровки человеческого генома также подтверждают физиологическую важность фосфорилирования: гены, кодирующие ферменты, отвечающие за фосфорилирование и дефосфорилирование белков, соответствуют как минимум 2% генома [Johnson S.A. et al, 2005].
Существуют различные подходы, позволяющие получать информацию о фосфорилировании белков. Наиболее общим из них является фосфопротеомика -наука, изучающая всю совокупность фосфорилированных белков в клетке или организме - фосфопротеом. В связи с высокой сложностью белкового состава биологических систем, анализ как протеома, так и фосфопротеома представляют собой сложную задачу, для решения которой в настоящее время широкое применение находит масс-спектрометрия в сочетании с различными техниками разделения белков и пептидов (гель-электрофорез, ВЭЖХ, капиллярный электрофорез и т.д.) [Ham В.М. et al., 2008].
В настоящее время основными направлениями в развитии фосфопротеомики являются разработка и внедрение методов, увеличивающих эффективность масс-спектрометрического анализа фосфорилированных белков, включая разработку новых методов для выделения фосфобелков и фосфопептидов, что позволяет уменьшить долю нефосфорилированных компонентов сложной смеси и тем самым упростить ее анализ. В настоящей работе нами предложены новые химические методы для высокоселективного концентрирования фосфопептидов и фосфобелков, а также определения стехиометрии фосфорилирования белков. На основе данных подходов разработаны и охарактеризованы новые методы количественного анализа фосфопротеома.
Цель работы
Цель работы заключалась в разработке новых методов для масс-спектрометрического анализа фосфопротеома и определения их пригодности для анализа биологических образцов.
В работе были поставлены следующие задачи:
исследовать ряд новых хроматографических фаз, которые могут быть использованы для эффективного выделения фосфопептидов и фосфобелков из сложных белковых образцов;
разработать высокочувствительный метод анализа фосфопротеома, основанный на совместном выделении фосфорилированных белков и пептидов;
разработать метод для экспериментального определения и сравнения стехиометрии фосфорилирования белков.
Научная новизна результатов
Результатом работы явилась разработка группы методов для масс-спектрометрического исследования фосфопротеома. Была синтезирована новая аффинная фаза для концентрирования фосфорилированных пептидов из сложных образцов, характеризующаяся высокой селективностью. Был разработан новый метод определения стехиометрии фосфорилирования белков при помощи комбинации изотопной модификации и энзиматического дефосфорилирования; с помощью названного метода был впервые проведен анализ стехиометрии фосфорилирования белков в сложных биологических образцах.
Практическая значимость данной работы заключается в том, что разработанные методы могут применяться в фосфопротеомике для определения фосфорилированных белков, сайтов фосфорилирования, а также их стехиометрии. Полученные результаты могут быть использованы в исследовании механизмов биологических процессов, скрининге биомаркеров и разработке новых фармацевтических препаратов. В настоящий момент разработанная технология и аффинные хроматографические фазы нашли коммерческое применения для анализа образцов в Инновационном центре университета МакГила (Монреаль).
Апробация работы и публикации
Материалы диссертации были представлены на 7-ом ежегодном
международном конгрессе организации человеческого протеома (HUPO 2008, Амстердам, Нидерланды, 16-20 августа 2008), втором ежегодном собрании монреальского диабетического центра (MDRC, Монреаль, Квебек, Канада, 11 января
2008), конференции канадского протеомического общества (Квебек, Квебек, Канада, 9 мая 2008), десятом ежегодном конгрессе студентов и молодых ученых исследовательских центров госпиталей Монреаля (Монреаль, Квебек, Канада, 18 декабря 2007), XXIII конгрессе студентов университета Монреаля (Монреаль, Квебек, Канада, 12 июня 2008), 54-ой ежегодной конференции американского масс-спектрометрического общества (Сиэтл, Вашингтон, США, 28 - 31 мая 2006) и симпозиуме по протеомике и биоинформатике в Кейстоуне (Кейстоун, Колорадо, США, 8-13 апреля 2005).
Результаты работы опубликованы в восьми печатных работах, в том числе в одной статье в рецензируемом научном журнале.
Структура и объем работы
