Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
А. ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ КОМПОНЕНТОВ ТРАНСЛЯЦИОННОГО АППАРАТА
И РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА БЕЛКА В ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ 7
1. ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ФАКТОРА ИНИЦИАЦИИ elF-2 7
1.1. Ингибитор трансляции, появляющийся в лизатах ретикулоцитов при недостатке гемина 7
1.2. Ингибитор трансляции, появляющийся в лизатах ретикулоцитов при добавлении двуспиральной РНК........II
1.3. HCI и DAI - две разные протеинкиназы с одинаковой . . специфичностью по отношению eIF-2 14
1.4* Каким образом фосфорилирование eIF-2 приводит . к остановке трансляции в лизатах. ретикулоцитов? 15
1.5. Дефосфорилирование eiF-2oo 17
1.6. Фосфорилирование eIF-2/З 18
1.7. Фосфорилирование других факторов инициации 19
2. ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ РЙБОС0МН0Г0 БЕЛКА S6 20
2.1. Что приводит к изменению степени фосфорилирования 20
2.2. Как фосфорилирование S6 может.быть связано с активацией трансляции?. 23
3. ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ЖИНОАЦИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗ 26
Б. ВЗАИМНЫЙ ОБМЕН СВОБОДНЫХ РНК-СВЯЗЫВАВДИХ И ИНФОМОСОМНЫХ БЕЛКОВ - ВЕРОЯТНЫЙ МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ. ЭКСПРЕССИИ мРНК 27
I. НЕКОТОРЫЕ БЕЛКИ ИНФОВЮСОМ ПРИСУТСТВУЮТ В ЦИТОПЛАЗМЕ В СВОБОДНОМ СОСТОЯНИИ 29
2. СВОБОДНЫЕ ЩТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ И П0ЛИС0М0СШЗАННЫЕ ШФОШОСОМЫ СОДЕРЖАТ РАЗНЫЙ НАБОР БЕЛКОВ ... 38
3. СВОБОДНЫЕ ЩТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ ИНФОНЮСОМЫ СОДЕРЖАТ РЕПРЕССОР ТРАНСЛЯ1Щ,.ОТСУТСТВУЩИЙ В ПОЛИСОМОСВЯЗАННЫХ ИНФОИЮСОМАХ 42
4. ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ ИНФОВЮСОМ 47
5. цАМФ-НЕЗАВИСИМЫЕ ПРОТЕИНКИНАЗЫ -.ФЕРМЕНТЫ, ФОСФОРИЛИРУЮЩИЕ БЕЛКИ ИНФОВЮСОМ 51
5.1. Цитоплазматические казеиновые киназы 52
5.2. Ядерные казеиновые киназы 56
5.3. Возможные субстраты казеиновых киназ 58
5.4. Гистоновые киназы. ,65
5.5. Протеинкиназы,. ассоциированные. с микросомами 66
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 68
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 70
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 70
1. Буферные растворы 70
2. Получение ооцитов рыб и амфибий 70
3. Гомогенизация ооцитов и получение безрибосомного экстракта .71
4. Иммобилизация поли(У) на сефарозе 72
5. Выделение РНК-связыващих.белков из.безрибосомных. экстрактов ооцитов 73
6. Выделение РНК-связывающей протеинкиназы........ 73
7. Дефосфорилирование казеина. .74
8. Определение протеинкиназной активности........ «.74
9. Получение препаративных количеств!! 2Р]казеина... ..75
10. Получение [14С] рРНК 75
11. Определение РНК-связывающей активности 77
- Ингибитор трансляции, появляющийся в лизатах ретикулоцитов при недостатке гемина
- НЕКОТОРЫЕ БЕЛКИ ИНФОВЮСОМ ПРИСУТСТВУЮТ В ЦИТОПЛАЗМЕ В СВОБОДНОМ СОСТОЯНИИ
- СВОБОДНЫЕ ЩТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ И П0ЛИС0М0СШЗАННЫЕ ШФОШОСОМЫ СОДЕРЖАТ РАЗНЫЙ НАБОР БЕЛКОВ
- СВОБОДНЫЕ ЩТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ ИНФОНЮСОМЫ СОДЕРЖАТ РЕПРЕССОР ТРАНСЛЯ1Щ,.ОТСУТСТВУЩИЙ В ПОЛИСОМОСВЯЗАННЫХ ИНФОИЮСОМАХ
- ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ ИНФОВЮСОМ
Ингибитор трансляции, появляющийся в лизатах ретикулоцитов при недостатке гемина
был впервые обнаружен Максвеллом и Рабиновичем (216). Они показали, что безрибосомныи экстракт лизатов, инкубированный в отсут - 8 ствие гемина, ингибирует белковый синтез в свежих лизатах, причем появление ИНГИбИТОра (HCI, hemin controlled inhibitor) можно предотвратить добавлением гемина. Так как репрессор формируется в отсутствие рибосом, то, скорее всего, его образование происходит не de novo, а из некоего предсуществущего прореп-рессора.
Самопроизвольное образование HCI из прорепрессора в лизатах ретикулоцитов - длительный температурочувствительный и рН-чувст-вительный процесс, при котором окончательная, "необратимая" форма HCI формируется только через 3 часа. При 25 процессы активации прорепрессора протекают крайне замедленно и практически останавливаются при 0-4. Температуры, превышающие 40 быстро инактивируют HCI.
Образование HCI из прорепрессора происходит намного эффективнее при щелочных значениях рН (8,5-9,5), чем при кислых. При рН 9,5 полная активация прорепрессора проходит даже при 0, в то время как при рН 6,5 активация едва заметна при 30 (162).
Независимо от присутствия в грубых лизатах гемина прорепрессор можно быстро активировать с помощью 5-Ю мМ N -этилмалеимида (139) и других SH -реагентов, таких как А.-иодозобензоат или окисленный глутатион (95). Однако высокие концентрации
N -этилмалеимида (более 10 мМ) инактивируют HCI, причем эндогенная АТФ, содержащаяся в лизатах, предотвращает инактивацию (162).
Эти данные свидетельствуют в пользу того, что SH -группы прорепрессора принимают участие в процессе активации; значит, вещества типа дитиотреитола должны предотвращать формирование HCI. Действительно, Гросс наблюдал такой эффект ДТТ (135) , но его результаты оспариваются Хантом, показавшим, что 5-10мМ ДГТ не только не мешает формированию НСІ в грубых лизатах, но даже способствует этому (162). Таким образом, роль SH -групп в активации прорепрессора до сих пор не установлена.
Было замечено, что образование НСІ в лизатах сопровождается фосфорилированием полипептидной цепи с молекулярной массой 80000-96000. Этот компонент соочищается с НСІ на всех стадиях (сульфатное осаждение, ионообменные хроматографии, гель-фильтрация, центрифугирование), причем интенсивность его фосфорилирования в грубых экстрактах и в очищенных препаратах коррелирует с активностью репрессора. Более того, показано, что максимально очищенные препараты НСІ содержат только эту цепь, причем нативная молекула репрессора представляет собой димер: 2x80000, обладающий самофосфорилирующей активностью (97, 98, 162). HGI при самофосфори-лировании включает несколько фосфатных остатков: 3 поданным Фагар-да и Лондона (98), 4 - Ханта (162) и 5 - Гросса (138). Этот фосфат обнаруживается в основном в фосфосериновых и, в меньшей степени, в фоефотреониновых остатках (97). Кинетические исследования самофосфорилирования указывают на внутримолекулярный характер реакции, поскольку она протекает очень быстро и практически не зависит от концентрации НСІ (138)
Некоторые белки инфовюсом присутствуют в цитоплазме в свободном состоянии
Опыты по инъекции радиоактивно меченых РНК-связывающих белков в ооциты амфибий однозначно доказывают, что часть этих белков включается в состав информосом in vivo (88). Однако до сих пор остается не выясненным вопрос о том, какие именно индивидуальные белки, входящие в состав гетерогенной фракции РНК-связывающих белков, обладают информосомообразующей функцией в ооци-тах амфибий,
В последние годы появились сообщения об идентификации некоторых белков, обнаруживающихся в составе мРНП и в свободном состоянии в цитоплазме. Они могут быть выделены из клеточных экстрактов в составе суммарной фракции РНК-связывающих белков с помощью аффинной хроматографии на ковалентно иммобилизованных полинуклеотидах.(7,9,239).
В лаборатории Шера обнаружен и выделен из цист Artemia salina МОНОМернЫЙ белок HD -40 ( helix-destabilizing protein ) с молекулярной массой около 40 Kd , характеризующийся высоким содержанием глицина и имеющий в своем составе необычную аминокислоту диметиларгинин. HD -40 связывается с одноцепочечными нуклеиновыми кислотами (преимущественно с РНК), защищая их от действия нуклеаз. Показано, что этот белок снижает степень спирали-зации искусственных односпиральных полинуклеотидов поли(А), поли(С), поли (У) и природных нуклеиновых кислот (РНК фага MS2 и ДНК фага f XI74). В условиях низкой ионной силы (25-50 мМ Naci ) HD -40 способен предотвращать образование дуплексов типа поли(А):поли(У) (213,235). Добавление HD -40 в бесклеточную систему ингибирует белковый синтез (213). Тома и соавт. установили, что этот белок является одним из основных структурных компонентов ядерных ЗОБРНП ИЗ Artemia salina (328).
Данные лаборатории Шера были подтверждены результатами двух независимых работ (73,112), в которых показано присутствие белка, аналогичного HD-40, в свободных цитоплазматических инфор-мосомах Artemia ваііпаи ядерных информосомах из мозга крысы. Благодаря необычному аминокислотному составу идентификация этого белка в составе частиц могла быть проведена достаточно надежно.
В ряде работ показано, что пул ядерных и цитоплазматических РНК-связывающих белков может перекрываться; во всяком случае, часть цитоплазматических белков способна принимать участие в формировании ядерных информосом. Не исключено, что HD-40 является одним из таких белков. Недавно де Хердт и соавт. установили, что выделенный из свободных цитоплазматических информосом HD-40 после инъекции в ооциты Xenopus laevis накапливается в ядрах ооцитов (72).
Свободные щтоплазматические и п0лис0м0сшзанные шфошосомы содержат разный набор белков
Проблема сравнительного анализа белкового состава информосом разной внутриклеточной локализации привлекает внимание исследователей с момента открытия этих частиц. Полученные к 1980 г. результаты (суммированные в обзорах 253,308,310) указывают на то, что в состав трех классов информосом входят разные белки. Однако если в отношении ядерных и цитоплазматических мРНП этот факт не вызывает сомнений, то смена белков цитоплазматических информосом при переходе их из свободного состояния в полисомы во многом оставалась гипотетичной.
За последние годы в нескольких лабораториях были получены данные, свидетельствующие в пользу "переодевания" мРНК и на этом этапе функционирования матрицы. Так, электрофоретический анализ белков свободных и полисомосвязанных информосом, выделенных с помощью нескольких центрифугирований в градиенте концентрации сахарозы из эритробластов утки, выявил значительную разницу в белковом наборе этих частиц (347,348). Джейн и соавт. исследовали полипептидный состав свободных и полисомосвязанных поли (А)-содержащих мРЕП, выделенных методом хроматографии на олиго-dT-целлюлозе из печени крысы, ретикулоцитов кролика и клеток асцитной карциномы Эрлиха. Во всех случаях полисомосвя-занные информосомы содержали всего 3 основных компонента: 52000, 58000 и 78000, в то время как свободные частицы имели намного более сложный белковый состав, зависящий от объекта выделения (174,175). Джонсон и Илан предприняли аналогичную попытку прямого электрофоретического сравнения белков свободных и полисомосвязанных поли(А)-содержащих информосом, выделенных из клеток печени петуха с помощью олиго- 1Т-целлюлозы (180). Белки одного типа частиц метили in vitro радиоактивным иодом и после ко-электрофореза по О Фарреллу сравнивали их с белками других частиц, окрашивая последние с помощью азотнокислого серебра. Авторы обнаружили, что из 27 полипептидных цепей 15 - общие для обоих типов частиц, 7 - специфичны для полисомосвязанных и 5 - для свободных информосом.
В работе (50) Чакраборти с соавт. сравнивали полипептидный состав свободных и полисомосвязанных мРНП из мышц зародышей цыпленка. Оказалось, что полисомосвязанные мРШ имеют в своем составе более бедный набор белков, чем свободные частицы. Было показано, что в составе свободных РНП содержатся полипептидные цепи, реагирующие с моноклональными антителами против GBP-I (см. БД.)» в то время как в полисомосвязанных мРНП их нет.
Данные Гринберга (128) свидетельствуют о том, что полисомосвязанные информосомы представляют собой динамическую структуру, непрерывно обогащающуюся новосинтезированнывд белками цитоплазмы (свободными РНК-связывающими белками?). В мышиных L -клетках с помощью актиномицина Д был заблокирован синтез РЖ; при этом продолжали синтезироваться белки, сшивающиеся с пред-сущеетвующими поли(А)-содержащими полисомосвязанными мРНП при ультрафиолетовом облучении. К 3 -концевой поли(А)-последовательности пришивался только один белок 78000, а к остальным участкам мРНК - еще несколько белков (98000, 78000 - но, судя по пептидным картам, другой, не тот, что взаимодействует с пож (А)-блоками мРНК, 68000, 62000 и 52000).
Свободные щтоплазматические инфонюсомы содержат репрессор трансля1щ,.отсутствущий в полисомосвязанных инфоиюсомах
Многие эукариотические клетки содержат некоторое количество репрессированной мРНК. Эта мРНК либо совсем не транслируется, либо транслируется с низким выходом белка, явно не соответствующим количеству матрицы, содержащейся в клетке, и не совпадающим с тем количеством продукта, которое может быть получено при трансляции соответствующей мРНК в бесклеточной системе. Если выделить трансляционно активную мРНК из полирибосом и нетранс-лируемую мРНК из безрибосомного экстракта, получить продукты обоих фракций мРНК в бесклеточной системе и количественно (или полуколичественно) сравнить выход этих продуктов с помощью двумерного электрофореза или иммунологическими методами, то можно заметить, что каждая мРНК имеет свое собственное распределение между полисомами и супернатантом. Этим способом было продемонстрировано существование значительного количества трансляционно неактивной мРНК в клетках печени (190,366), асцитноы опухоли мыши (185,211), ооцитах Xenopus laevia (28), зародышах морского ежа (26,166,195), ретикулоцитах лягушки (294,295), моллюске Spisula solidissima (270), Грибе Dictyostelium discoideum (18) и в развивающихся тканях млекопитающих (121,238,276). В настоящее время доступность методов генной инженерии, в частности, получения кДНК, сделало возможным тестирование мРНК непосредственно во фракциях сахарозного градиента. Такой подход был применен в лабораториях Шафритца (291,363,364), Бравермана (365) и Хейвуда (78).
Независимо от использующихся методов анализа мРНК было показано, что in vivo как в развивающихся, так и в специализированных клетках большое количество матриц находится под трансляционным контролем.
Например, Ре t вызывает всплеск синтеза ферритина на пред-существующих матрицах в ретикулоцитах головастиков лягушки-быка (294,295,366). Экспрессия альбуминовой мРНК в клетках печени крысы (291,363,364) и мРНК для 4 неидентифицированных пептидов в клетках мышиной саркомы (365) зависит от наличия свободных аминокислот, необходимых для биосинтеза белка.
В настоящее время считается доказанным, что репрессированная мРНК существует в комплексе с белками в виде информосом (25,253,254,274,308,309,310). Для ряда объектов:эритробластов утки (54,215), печени крысы (234), яиц морского ежа (178), клеток семенников форели (300) и мышиной саркомы (37) показано, что свободные информосомы неактивны в оесклеточной системе биосинтеза белка, в то время как экстрагированная из них мРНК равно как и полисомосвязанные информосомы из этих объектов способна нормально транслироваться. Главным образом на основании этих опытов часто делается вывод о том, что существует некий функциональный класс информосом, никогда не попадающих в полисомы (37,118,348). На самом деле стационарные условия in vitro в гомологичной (а чаще гетерологичной) бесклеточной системе не могут отражать различные функциональные состояния живой клетки, связанные, по-видимому, с необходимостью дифференциальной экспрессии разных информосом. Результаты Тэйла и соавт. указывают на то, что в ранних ретикулоцитах кролика мРНК для фермента ли-поксигеназы находится в репрессированном состоянии в виде свободных цитоплазматических информосом, не активных в гетерологич - 44 ной бесклеточной системе. Эта мРНК способна активно транслироваться на более поздних стадиях развития ретикулоцитов (326). Красивые опыты Хавараниса и Хейвуда показали, что мРНК для тяжелой цепи миозина репрессирована в миобластах и способна транслироваться в дифференцированных мышечных волокнах. Информосомы, содержащие эту радиоактивно меченую мРБК, выделяли из миобластов и заключали в липосомную оболочку. В таком виде они проникали в мышечные волокна, где их и обнаруживали в составе полисом (151). Таким образом, несмотря на то, что в некоторых тканях показано существование устойчивой и длительной репрессии мРНК (165,348), явно преждевременно делать вывод о том, что эта мРНК никогда не будет транслироваться.
Фосфорилирование белков инфовюсом
Первые сообщения о том, что белки информосом могут фосфори-лироватьсяіп vivo, появились около 10 лет назад. Было показано, что часть белков ядерных информосом из мозга (111,114,115) и печени крысы (288) а также полисомосвязанных информосом из эри-тробластов утки (116,228) и клеток HeLa (20) содержит в своем составе фосфатные остатки. Приведенные в этих работах молекулярные веса фосфорилированных полипептидов практически не совпадают между собой.
Гораздо больший интерес представляют данные о том, что в составе информосом разных тканей наряду с субстратами фосфорили-рования присутствуют также и протеинкиназы. Одними из первых появились работы, выполненные на клетках HeLa (41,244). Было показано, что протеинкиназная активность сопровождает информосомы, содержаще гяРНК;при седиментации (и реседиментации) в сахарозе и в метризамиде. Эта сАМР- и Са;-независимая протеинкиназа модифицирует как сериновые, так и треониновые остатки в молекулах субстратов, использует АТФ намного (в 15 раз) лучше ГТФ и фосфо-рилирует казеин в 4 раза эффективнее гистонов. С помощью гель-фильтрации на Сефадексе G-200 установлено, что молекулярная масса обнаруженного фермента лежит в районе 48000. Авторы считают, что эта протеинкиназа принадлежит к классу ядерных казеиновых киназ I типа (N І)(О классификации протеинкиназ см.ниже, в главе Б.5). Однако на основании полученных ими данных нельзя сделать такого определенного вывода. Описанные свойства фермента позволяют с равной степенью вероятности отнести его как к первому, так и ко второму (ы П) типу. Полученные противоречивые результаты могут указывать либо на присутствие в информосомах фер - 48 ментов обоих типов, либо на загрязнение информосом свободными ядерными белками, содержащими протеинкиназные примеси.
В работе Бага и Селлза содержатся указания на присутствие в свободных цитоплазматических информосомах из мышц зародышей цыпленка сАМР-независимой протеинкиназы и субстратов фосфорили-рования, но не делается попытки идентифицировать обнаруженный фермент (23).
Наиболее четко (по всем известным признакам) в составе свободных цитоплазматических информосом ретикулоцитов была идентифицирована казеиновая киназа П типа (263). Выделение информосом проводили с помощью последовательных центрифугирований в градиентах сахарозы и метризамида. Было продемонстрировано хорошее совпадение между информосомными белками, фосфорилируемыми эндогенным ферментом и казеиновой киназой П типа, выделенной из цитоплазмы ретикулоцитов. Напротив, казеиновая киназа I типа фосфо-рилирует другие полипептидные цепи из числа информосомных белков, а сАМР-зависимая протеинкиназа вообще не активна.
Протеинкиназа казеинового типа, способная использовать как Ш), так и ГТЗ , была обнаружена в свободных цитоплазматических и полисомосвязанных поли(А)-содержащих информосомах, выделенных на олиго-d Т-целлюлозе из клеток мышиной плазмоцитомы (87). Этот препарат информосом содержал также протеинкиназу гистонового типа. Как всегда, остается непонятным, является ли это следствием загрязнения информосом, или гистоновая протеинкиназа, как и казеиновая, действительно входит в состав мРНП.
