Разработка масс-спектрометрического метода оценки содержания белков без использования изотопных меток Копылов Артур Тигранович

Содержание к диссертации

Определение и постановка цели и задач проводимой работы. Актуальность работы в фундаментальном и прикладном аспектах

2 Литературный обзор по современным метолам и достижениям в 11
относительной и абсолютной количественной протеомике

1. Краткая история развития количественной протеомики, важность и 12 области применения количественного анализа (медицина, фармакология, криминалистика, наркология, диагностика заболеваний)

2. Химические методы изотопного мечения в количественной протеомики 17

3. ІСАТ (сайт-специфическое мечение по цистеинам) 17

4. ICROS (метионин- и цистеин специфичное мечение)Теория масс- 21 спектрометрического количественного анализа, его возможности, достоинства и недостатки

5. Гуанидирование (лизин-специфичное мечение) 25

6. Изотопное мечение по лизину и свободным 1\1Н2-группам 23

7. Твердофазное изотопное мечение (лейцин) SIT 26

3. Ферментативное С-концевое (¹⁶0/¹⁸6) мечение белков. 28

4. Изотопное мечение белков в культуре клеток SILAC 31

1. SILAC с изотопными аминокислотами в культуральной среде 31

2. SILAC с изотопными атомами ¹⁴N/¹⁵N в культуральной среде 34

3. SILAC с изотопными атомами ¹²С/¹³С в культуральной среде 35

5. Метод количественной оценки на уровне MS/MS. iTRAQ (изобарное 36 аминомечение)

6. Количественная масс-спектрометрическая оценка посттрансляционных 38 модификаций белков

2.6.1 Фосфопротеомика 41

1. ІМАС-металлоаффинная хроматография 41

2. Метод без использования изотопной метки. Мультипротеазныи подход 42

2.6.2 Гликопротеомика 43

3. Дериватизация и изотопное мечение з[в]-аргинином 44

4. Твердофазное изотопное мечение (SIT) 46

5. Метод без использования изотопной метки. Изучение О- 47 сульфатированных форм серина и треонина

6. Фронтальная аффинная хроматография (FAC) 48

2.7 Абсолютый количественный анализ белков и фосфопротеинов методом 49
тандемной масс-спектрометрии

2.8 Заключение 50
3 Материалы и методы 52
3.1 Выбор чистых препаратов белков для количественного анализа 55
3.1.1 Критерии отбора белков 55

Подготовка чистых препаратов индивидуальных белков для масс-

3.1.2 спектрометрического анализа 53

Выбор концентрационного диапазона для масс-спектрометрического

3.1.2.1 анализа 53

Проведение модифицированного гидролитического расщепления белков

3.1.2.2 трипсином в растворе 54

Условия стабильности масс-спектрометрического анализа для построения

3.1.2.3 калибровочной кривой 55

Подготовка смеси модельных белков для масс-спектрометрического

3.1.3 анализа. Выбор молярных соотношений белков и числа различных белков 56
в смеси

Подготовка препарата с включением С-концевого з!^⁵]^^¹ ]-аргинина

3.1.4 57

7. Химическое описание синтетических пептидов 57

8. Подготовка препарата пептидов и анализ контаминации примесными 58 пептидами

9. Очистка пептидов после протеолиза на колонке с обращенной фазой и 59 анализ чистоты препарата на MALDI-TOF

Подготовка препарата пептидов для масс-спектрометрического анализа

3.1.4.4 60
Выбор приборной базы (LC-ESI-MS/MS и ES1-Q-TOF)

3.1.4.4.1 60

3.1.4.4.2 Верификация пептидов и определение концентрационных диапазонов 61

верифицированных пептидов

3.1.5 Мечение белков тяжелыми атомами кислорода [О¹⁸] 62

3.2 Выбор микросом как объекта исследований и критерии отбора 63

Подготовка проб микросом

3.2.1 63

2. Химическая модификация белков в пробах микросом 64

3. Осаждение белков и подготовка к хроматографической очистке на 65 колонке с обращенной фазой

4. Предварительное фракционирование белков на колонке mRP-C18 с 65 обращенной фазой, как элемент трехмерной хроматографии

5. Модифицированные условия проведения гидролитического 68 расщепления белков трипсином

6. Подготовка проб для масс-спектрометрического анализа 68

7. Параметры проведения масс-спектрометрического анализа и выбор типа 69 масс-спектрометра

3.2.8 Статистические методы обработки данных 70
4 Результаты 73

1. Основные результаты работы 73

2. Построение калибровочных кривых зависимости интенсивности масс- 75 спектрометрического сигнала от концентрации индивидуального белка

3. Математическое определение функции зависимости сигнала от 75 концентрации

4. Теоретические основы зависимости ответного сигнала от 81 концентрации

5. Границы линейности корреляции 81

6. Приборно-технические ограничения масс-спектральной интенсивности 85

4.2.3 Условия выполнения гипотезы о линейности корреляции между 86

уровнем масс-спектрометрического сигнала и концентрацией белков

7. Минимальное число пептидов как условие выполнения линейной 87 зависимости интенсивности масс-спектрометрического сигнала от концентрации пептидов анализируемых белков

8. Угол наклона кривой зависимости 94

4.3 Определение зависимости масс-спектрометрического сигнала белков от 95
концентрации в модельных смесях

9. Постоянство линейной зависимости уровня интенсивности масс- 96 спектрометрического сигнала от концентрации пептидов белков в смеси

10. Отличия интенсивности белков в смеси и в чистом препарате 100

11. Сохранение условий линейности сигнала от концентрации пептидов и 102 характеристического значения тангенса угла наклона кривой зависимости

4. Влияние скорости потока наноэлектроспрея на линейность корреляции 102

5. Сравнение результатов разрабатываемой гипотезы о корреляции 107 интенсивности масс-спектрометрического сигнала и концентрацией пептидов с современными общепринятыми методами относительной количественной протеомики

4.5.1 Метод AQUA 107

4.5.1.1 Критерии селекции пептидов 107

2. Оценка качества идентификации масс-спектров пептидов с атомами [ С), 108 [¹⁵N]

3. Экстраполяция данных для пептидов с включенными изотопными 112 атомами [¹³С], [¹⁵N] и расчет концентрации пептидов 1300 и 1258 в смеси

Замещение тяжелыми атомами кислорода ¹⁸0 в ходе реакции 115

гидролитического расщепления трипсином

1. Качественная оценка замещения легких атомов кислорода ^1бО на ¹⁸0 с 115 помощью MALDI масс- спектрометрии.

2. Относительная количественная оценка с помощью пептидов ¹⁸0 118

Основные характеристики рабочей гипотезы зависимости сигнала масс- 120 спектрометрической интенсивности от концентрации пептидов

Обсуждение 123

Введение к работе

Необходимость безметковых методов количественной протеомики с 124

использованием масс-спектрометрии

Оптимизация приборно-измерительной базы и ограничения методов 125

количественной протеомики

Сложности в обработке данных количественной масс-спектрометрии 127

Линейность зависимости масс-спектрометрического сигнала от 128

концентрации пептидов и динамические диапазоны детекции

Верификация гипотезы о линейной зависимости между интенсивностью 134 масс-спектрометрического сигнала и концентрацией пептидов общепринятыми методами относительной количественной протеомики

6. Выводы 138

7. Заключение 139 Список цитируемой литературы 141 Приложение 156

1. ВВЕДЕНИЕ. Определение и постановка цели и задач проводимой работы. Актуальность работы в фундаментальном и прикладном аспектах.

Протекание любого биологического процесса неразрывно сопровождается

изменениями химического состава клетки и биологических жидкостей. Изучение таких

динамических изменений в белковом составе является основной задачей протеомных

исследований, оказывающих неоценимый вклад в фундаментальное понимание

биологических процессов и применении новых методов в диагностике и лечении. Самое

популярное решение этих вопросов протекает через сравнительный анализ белков в

протеоме, содержание которых может меняться в ответ на какие-либо воздействия

химического или физиологического характера. Именно такие изменения в клеточном

составе представляют собой наибольший интерес для дальнейших исследований. С

ростом потребности в этих результатов к протеомике все больше предъявляются

требования количественно оценки изменений. Однако из-за значительных технических и

методических ограничений масс-спектрометрия, которая является основным

инструментарием современной протеомики, не способна осуществлять количественную

оценку непосредственно. Для решения этой проблемы со временем были разработаны

методы относительной количественной протеомики с использованием стабильных

тяжелых изотопов кислорода, углерода, азота и дейтерия. Эти тяжелые атомы включались

в состав пептидов или белков, либо замещали их легкие аналоги в некоторых случаях, тем

самым смещая действительную молекулярную массу пептида в большую сторону.

Сравнивая площади под пиками пептидов одинакового химического состава, но с

различным содержанием тяжелых изотопов, ученые научились проводить

количественную оценку белков в организмах различного состояния. С течением времени

исследователи обнаруживали все больше недостатков в методах количественной оценки

с использованием различных изотопов. Прежде всего, ограниченная специфичность

меток: многие из них были направлены на связывание с тиольной группой

аминокислотного остатка цистеина. Это вызывало дополнительные трудности и расходы,

связанные с необходимостью максимально полного восстановления цистеинов в

процессе пробоподготовки, что также увеличивало время всего эксперимента. Белки с

малым содержанием цистеинов или их отсутствием в первичной цепи, или отсутствие

цистеинов в доступных для протеолиза пептидах, полностью исключались из

количественной оценки. Метод метаболического изотопного мечения был доступен

только для использования в культуре клеток in vitro или для простейших организмов. Изотопное мечение тяжелыми атомами кислорода ¹⁸0 в ходе реакции гидролитического расщепления трипсином требовало масс-спектрометров с высоким разрешением, чтобы не допустить перекрывания изотопного распределения с меткой. Все это не могло оставаться без внимания исследователей, так как дальнейшее развитие количественной оценки с использованием различных меток и внутренних стандартов все больше заводило в тупик.

Однако за последнюю декаду лет многие ученые стали обращать внимание на принципиально новый подход в количественной протеомике - без использования меток. Выявление и изучение закономерностей зависимости между сигналом масс-спектрометра и количеством измеряемого белка дали толчок бурному развитию двух основных направлений количественной протеомики без использования меток: более раннее из них, так называемый count-based, основан на корреляции суммарного индекса достоверности идентификации белка по всем зафиксированным в ходе эксперимента пептидам. Второе направление, более молодое, но более перспективное- intensity-based- основывается на существовании зависимости между уровнем усредненной суммы масс-спектрометрических сигналов пептидов, принадлежащих одному белку, и его содержанием в биологической пробе. В наши дни еще остается достаточно скептиков, утверждающих о невозможности корректной количественной оценки такими подходами. Но оба направления претерпевают бурное развитие и имеют все перспективы вытеснить в недалеком будущем количественные методы на основе использования тяжелых изотопных атомов.

Настоящей работой мы внесли вклад е развитие безметковой количественной протеомики с применением масс-спектрометрии. Нами была выявлена и доказано существование зависимости уровня ответного масс-спектрометрического сигнала от содержания белка в пробе, детально исследована математическая основа зависимости на индивидуальных белках и на белковых смесях; показаны особенности поведения кривой зависимости, связанные с числом индивидуальных пептидов одного белка и их сочетанием. Выявлены влияние скорости потока наноэлектроспрея на линейность кривой зависимости и на уровень интенсивности в отдельных точках и элементах кривой. На основе данных подходов разработан и охарактеризован новый метод количественного

протеомного анализа без использования меток с включением изотопов атомов с применением масс-спектрометрии.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в разработке метода количественной оценки содержания белков без использования меток.

1. Выявить наличие и характер зависимости между уровнем масс-спектрометрического сигнала и концентрацией растворов 8 индивидуальных белков и их смесей. Определить концентрационные интервалы, в рамках которых проявляется зависимость масс-спектральной интенсивности от концентрации.

2. Определить условия линейности зависимости масс-спектральной

интенсивности от концентрации триптических пептидов анализируемого белка в пробе.

3. Выявить влияние скорости потока наноэлектроспрея на зависимость интенсивности масс-спектрометрического сигнала от концентрации для указанных белков виде чистого препарата и в смеси.

4. Оценить эффективность разработанного метода путем его использования для количественной оценки белка MUP3 в пробе микросом ткани печени мыши.

Научная новизна работы. В диссертации разработан и охарактеризован метод

количественного протеомного анализа без использования меток с включением

тяжелых изотопов. Для этого приведена подробная доказательная база существования

линейной корреляции уровня ответного масс-спектрометрического сигнала от

концентрации анализируемого белка. Показано, что границы корреляции для

количественного анализа с использованием масс-спектрометра типа ионной ловушки

составляют от 1 fM до 1 рМ. Показано, что данная зависимость сохраняет

характеристики линейности в условиях чистого препарата и в смеси белков и не зависит

от физико-химических свойств белка, его функциональной принадлежности и

организма происхождения. Впервые показано, что для соблюдения линейности

необходимо наличие минимум трех различных достоверно идентифицированных

пептидов, принадлежащих одному белку, и присутствие которых прослеживается на

протяжении всего исследуемого концентрационного диапазона. Такие пептиды

формируют интегрированную базовую кривую зависимости, свойства которой не

зависят от сочетания базовых пептидов. Нами также были подобраны оптимальные

условия скорости потока наноэлектроспрея применимые для поведения

количественной оценки белков на ионных ловушках.

Практическая значимость работы. В работе показано, что разработанный нами метод позволяет эффективно решать поставленные проблемы в количественной протеомики для оценки содержания белковых компонентов в биологических пробах и в чистых препаратах без использования химических или метаболических меток, содержащих атомы тяжелых изотопов. Разработан общий подход к оптимизации условий метода количественной оценки белков с использованием масс-спектрометрии на примере ионной ловушки и нормализации и выравниванию данных для эффективного выявления линейности зависимости масс-спектрометрической интенсивности ответного сигнала от концентрации анализируемого белка в чистом препарате и в смеси белков.

Похожие диссертации на Разработка масс-спектрометрического метода оценки содержания белков без использования изотопных меток

Модификация биохимических методов оценки содержания фосфорорганических соединений в пробах сложного составаПрокофьева Дарья Станиславовна

Флуоресцентный лантанидный иммуноанализ гормона тироксина с использованием европиевых метокЖердева Виктория Вячеславовна

Новые методы количественного масс-спектрометрического анализа белковых систем с использованием селективных изотопных метокФедяев Михаил Владимирович

Определение нелетучих органических соединений методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии в токсикологических исследованияхКорягина Надежда Леонидовна

Масс-спектрометрический анализ фосфорилирования белков с использованием методов изотопного мечения и селективного концентрированияКаньшин Евгений Дмитриевич

Оценка эффективности использования модифицированного метода определения числа падения для изучения углеводно-амилазного комплекса зерна ржиВоробьева Ирина Сергеевна

Оценка биологического возраста человека на основе анализа динамики содержания биополимеров в коже и сыворотке кровиПетренко Елена Геннадьевна

Содержание серотонина и мелатонина при хроническом болевом синдроме у женщин с первичным деформирующим остеоатрозом и клинико-биохимическая оценка эффективности лечения акупунктурой и мелатониномФаршатова Екатерина Рафаэлевна

Содержание белков и нуклеиновых кислот в тканях некоторых пресноводных рыб и их зависимость от возраста и сезона Курант Владимир Зиновьевич

Перекисное окисление липидов и содержание катионных белков при лечении хронического уретрогенного простатита лазеромагнитоэлектростимуляцией [Электронный ресурс]Леонтьев Игорь Геннадьевич