Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 10
1.1. Современные теории старения организма 10
1.1.1. Генетическая теория старения 10
1.1.2. Свободнорадикальная теория старения 12
1.1.3. Элевационная теория старения 13
1.1.4. Иммунологическая теория старения 18
1.2. Биохимические изменения при старении в органах и тканях .. 19
1.2.1. Возрастная динамика биохимических показателей сыворотки крови 19
1.2.2. Возрастная динамика биохимических показателей кожи... 26
1.2.3. Возрастная динамика биохимических показателей печени... 32
1.3. Профилактика старения фармакологическими средствами... 39
1.3.1. Современные представления о геропротекторах 39
1.3.2. Современные представления о биохимических механизмах синтеза гликозаминогликанов и протеогликанов 45
1.3.3.Протеогликаны и ГАГ как потенциальные геропротекторы. 53
1.4. Заключение по обзору литературы 55
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 56
2.1. Объекты и предметы исследования 56
2.2. Методики исследования 57
2.3. Новая методика совместного электрофоретического определения белковых и липопротеиновых фракций сыворотки крови , 71
ГЛАВА III. Возрастные изменения фракционного состава белков, липопротеинов, гликозаминогликанов и биохимических показателей печени в сыворотке крови женщин 76
ГЛАВА IV. Возрастные изменения содержания гликозаминогликанов, белка и нуклеиновых кислот в коже женщин 100
ГЛАВА V. Уточнение внутриклеточной локализации биосинтеза гликозаминогликанов 113 Глава VI. влияние плацентарных гликозаминогликанов на процессы репаративной регенерации 128
ГЛАВА VII. Заключение 136
Глава VIII. Выводы 140
Глава IX. Практические рекомендации 141
Глава X. Список цитированной литературы 142
Приложение 167
- Современные теории старения организма
- Биохимические изменения при старении в органах и тканях
- Новая методика совместного электрофоретического определения белковых и липопротеиновых фракций сыворотки крови
- Возрастные изменения содержания гликозаминогликанов, белка и нуклеиновых кислот в коже женщин
Введение к работе
Актуальность работы. На сегодняшний день не существует однозначного мнения о биохимических механизмах старения и их регуляции [Анисимов В.Н., 2000, 2003; Киселев Л.Л.,2000; Bohr V.A., 2002]. Многочисленные литературные данные лишь констатируют наличие возрастных изменений концентраций низко- и высокомолекулярных эндогенных соединений в органах и тканях организма человека и животных, при этом наблюдения авторов фрагментарны и часто противоречат друг другу. В этом отношении недостаточно изучена возрастная динамика основных биополимеров межклеточного матрикса - белков и гетереполисахаридов (гликозаминогликанов) [Зимницкий А.Н., Башкатов С.А. 2004; Кольман Я., Рем К.Г. , 2000]. По данным физиологических и биохимических исследований [Рашидов Н.Р., 2002], скорость старения организма обратно пропорциональна эффективности функционирования его печени. В свою очередь с состоянием печени напрямую связан обмен других биополимеров - липопротеинов [Королевская Л.И., Серова Л.Д., Лукьянчиков B.C. и др., 2003; Кустаров В.Н., Черниченко И.И., 2003Конопля Е.Ф., Лукша Г.М., 1991;Коркуиасо О. В. и др., 1993;], регулирующих биосинтез стероидных гормонов, модулирующих в свою очередь интенсивность биосинтеза нуклеиновых кислот (НК). [Сергеев П.В., 1987].
На сегодняшний день традиционно считается, что гетерополисахаридные фрагменты протеогликанов межклеточного матрикса синтезируются нематрично в эндоплазматическом ретикулуме клетки, однако эта теория объясняет далеко не все известные из научной литературы феномены [Зимина Н.П., Рыкова В.И., Архипов И.А., 1992; Зимницкий А.Н., Башкатов С.А., 2005]. Общепризнанная «рациональность» природных процессов, их универсальность неизбежно наводит на мысль об универсальности и биосинтеза всех биополимеров с участием нуклеиновых кислот. Таким образом, получается своеобразное диалектическое единство матрично-зависимого обмена белков, липопротеинов, протеогликанов и ДНК, имеющее место в организме человека и дестабилизирующееся с возрастом. Не вызывает сомнений, что ключевую роль в этих событиях играет печень, являясь крупнейшим синтетическим органом, а потому главной ареной, на которой развертывается патофизиологическая трагедия старения человека.
В связи со сказанным основной гипотезой нашей работы являлось предположении о том, что существуют многочисленные функциональные связи между показателями обмена белков, липопротеинов, гликозаминогликанов, состояния печени, кожи и возрастом человека, что биосинтез всех биополимеров происходит с участием дезоксирибонуклеиновых кислот. В качестве одного из объектов исследования мы намеренно выбрали женскую популяцию, так как, на наш взгляд, характеристика «практически здоровые лица» в старческом возрасте больше соответствует женщинам.
Целью настоящей работы является экспериментальное обоснование сопряженности обмена биополимеров с процессами старения и разработка патогенетически обоснованных биохимических подходов к их коррекции.
Для достижения поставленной цели представлялось необходимым решить следующие задачи:
1. Изучить фракционный состав белков, липопротеинов и гликозаминогликанов в сыворотке крови женщин различного возраста.
2. Определить количество белка, ДНК и фракционный состав гликозаминогликанов в коже женщин различного возраста.
3. Оценить состояние печени женщин различного возраста по активности ферментов аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, уровню билирубина и показателю тимоловой пробы в сыворотке крови. 4. Изучить профили элюции и фракционный состав полисахаридов печени крыс и маркерных полисахаридов (амилозы и полиуронидов) на DEAE-целлюлозе в градиенте ионной силы NaCl.
5. Уточнить внутриклеточную локализацию биосинтеза ГАГ с использованием в качестве радиоактивного маркера ,4С-глюкозы, меченной по Сь
6. Рассчитать уравнения регрессии, описывающие зависимость между возрастом и изученными биохимическими показателями.
7. Оценить на экспериментальных моделях репаративную активность плацентарных гликозаминогликанов.
8. Разработать новую лабораторную методику совместного электрофоретического определения фракционного состава белков и липопротеинов сыворотки крови.
Научная новизна. Проведенные исследования позволили существенно расширить представления о биохимических механизмах, лежащих в основе старения, выявить в коже обследованных женщин закономерности возраст-зависимого снижения концентрации гликозаминогликанов (ГАГ) при стабильном содержании белка и ДНК. При этом установлено, что с возрастом отрицательно коррелировали как суммарные ГАГ, так и их сульфатированная и несульфатированная фракции. В сыворотке крови испытуемых были выявлены линейные корреляционные связи между показателями обмена белков, липопротеинов, гликозаминогликанов, печеночных проб и возрастом обследованных женщин. Наиболее сильные корреляции из выявленных были: между возрастом и уровнем альбуминов, Р-глобулинов, al-липопротеинов, гепарансульфатов, аланинаминтрансферазы в сыворотке крови. Представляется важным, что коррелирующие показатели, по своей сути, характеризуют фактор старения организма, включающий в себя нарушение обмена стероидов, очевидно модулирующий транскрипционную активность ДНК, следствием которой является нарушение обмена гликозаминогликанов. На основании полученных экспериментальных данных уточнена внутриклеточная локализация биосинтеза гликозаминогликанов, доказана его связь с ядерным аппаратом клетки.
Практическая значимость выполненного исследования заключается в том, что показана возможность принципиально нового подхода к оценке биологического возраста человека по показателям содержания в сыворотке крови альбумина, 0- глобулинов, al-липопротеинов, гепарансульфатов и активности аланинаминотрансферазы путем подстановки значений этих показателей в рассчитанные регрессионные уравнения. Выявление расхождений, в значениях хронологического и биологического возраста испытуемых позволит получить объективные результаты для повышенного внимания со стороны специалистов-геронтологов. Разработана новая лабораторная методика совместного электрофоретического определения фракционного состава белков и липопротеинов сыворотки крови, которая внедрена в производственный процесс ООО НПЦ «Астра». Обоснована возможность разработки новых подходов к созданию препаратов-геропротекторов на основе гетерополисахаридов из класса гликозаминогликанов.
На защиту выносятся следующие научные положения:
1. Существуют корреляционные взаимосвязи между показателями возраста человека и содержанием биополимеров в сыворотке крови и коже, а также физиологического состояния его печени.
2. Существует принципиальная возможность оценки биологического возраста человека по биохимическим показателям содержания биополимеров в сыворотке крови и физиологического состояния печени.
3. Существует связь между биосинтезом гликозаминогликанов и ядерным аппаратом клетки.
4. Гетерополисахариды из класса гликозаминогликанов стимулируют процессы репаративной регенерации.
5. Существует возможность совместного эффективного электрофоретического определения белковых и липопротеиновых фракций в сыворотке крови.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Уфа, 2006), на III Международном форуме по эстетической медицине (Москва, 2004), на IV Международной конференции по профилактике старения (Санкт- Петербург, 2003), на II Международном конгрессе по косметологии и эстетической медицине (Москва, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 181 странице, содержит 79 таблиц, 40 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов, предметов и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 260 источников, из которых 132 отечественных и 128 иностранных авторов, приложения.
Современные теории старения организма
Среди современных теорий старения, основанных на предположении, что ДНК является основной мишенью повреждающих агентов в клетке, доминирует теория соматических мутаций, согласно которой старение -результат взаимодействия различных эндогенных и экзогенных повреждающих агентов с генетическим материалом клетки и постепенного накопления случайных мутаций в геноме соматических клеток [Bohr V. А., 1995, 2002; Burnet F.M. ,1970; Biasco М. А., 1998; MorleyA.A., 1995]. Имеется достаточное количество литературных данных, подтверждающих участие механизмов, ответственных за поддержание стабильности генома, в старении клеток in vitro и in vivo, и показывающих связь генетической нестабильности стареющих клеток со старением и продолжительностью жизни целостного организма. Генетическая нестабильность приводит к дерегуляции генной экспрессии и, таким образом, к возрастному нарушению в клеточной физиологии, остановке клеточного роста и в конечном итоге к гибели клетки. Предполагаемых причин возраст-зависимой нестабильности генома может быть несколько: комплексы двухцепочечных разрывов в ДНК, укорочение теломер, активация мобильных генетических элементов и снижение эффективности функционирования процессов репарации [Hayflick L.,1961; Bohr V. А., 2002; Anisimov V. N., 1983; Limoli C.L., 1997,1998]. В 1971г. A.M. Оловников предложил теорию маргинотомии, суть которой заключается в том, что в соматических клетках при каждой репликации недореплицируются концы хромосом - теломеры. В конце концов, в результате постоянного укорочения хромосом при каждом митозе, недорепликация захватывает области генома, существенные для выживания клеток, что и приводит к старению организма и затем к его гибели [Оловников A.M., 1971,2000,2003]. Клетки фибробластов человека в норме делятся 75-80 раз. Однако в 1985 году была открыта теломераза, при введении которой фибробласты приобретали способность делиться 280 раз без каких-либо признаков старения и патологии. Этот предел, при всей его достоверности, является, однако, всего лишь лабораторным феноменом, так как фибробласты человека не успевают за человеческую жизнь исчерпать даже свои обычные репликативные возможности.
В настоящее время также не вызывает сомнений значимая роль, которую играет апоптоз в старении клеток и организма в целом. Апоптоз выступает в качестве одного из механизмов, защищающих организм от клеток, несущих генетические повреждения. Установлено, что инициация апоптоза происходит при участии продукта гена р53, который является чрезвычайно важным для контроля репликативного старения клеток. Он активирует гены, вовлеченные в подавление тканевого роста [Жижина Г.П., 2002; Королькова Т.Н., 2001]. Апоптоз к настоящему времени твердо доказан прямыми экспериментами. Здесь прежде всего следует упомянуть доказательство «лимита Хейфлика», т.е. ограниченности числа делений определенных соматических клеток организма [Hayflick L., 1961, 2000]. Апоптоз играет ключевую роль в иммунитете, позволяя избежать продукции антител к собственным белкам организма. Предполагается также, что и во многих других случаях апоптозом выбраковываются клетки, представляющие опасность для жизни или нормального функционирования многоклеточного организма [Скулачев В.П., 1994]. При старении сигналы апоптоза становятся неэффективными и потенциально опасные клетки остаются жизнеспособными. Этим можно объяснить высокую чувствительность кожи пожилых людей к канцерогенному действию УФ-облучения [Жижина Г.П., 2002; Королькова Т.Н., 2001].
Биохимические изменения при старении в органах и тканях
В 50-е - 70-е годы 20 века было проведено большое количество исследований, посвященных изучению возрастных сдвигов биохимических показателей в органах и тканях [Слуцкий Л.И., 1969], однако при этом малое внимание уделялось такой важной ткани организма как кровь: считалось, что это - достаточно стабильное образование. Интегральный процесс старения оказывает сильное воздействие на систему крови. Представляется важным, что выявление интегральных возрастных изменений биохимических показателей крови позволит углубить представления о патогенетическом механизме старения по аналогии с тем, как разработка теории стресса Г. Селье позволила уточнить патогенез многих заболеваний.
Доказано, что с возрастом в сыворотке крови повышается концентрация таких веществ как глюкоза, щелочная фосфатаза, мочевая кислота, холестерин, уменьшается содержание общего белка и альбуминов [Маршалл В.Дж., 2002]. Однако сведения относительно возрастной динамики других фракций сывороточных белков довольно противоречивы. К белкам плазмы крови относится группа белков, удовлетворяющих следующим требованиям: 1) находятся в плазме крови в концентрации большей, чем в других биологических жидкостях; 2) в кровь секретируются, а не попадают в результате повреждения тканей; 3) проявляют основную функцию в пределах сосудистой системы; 4) синтезируются в печени или ретикулоэндотелиальной системе (реже в специализированных тканях);
Содержание различных белков в плазме колеблется в широких пределах. Например, концентрация альбумина составляет 40 г/л. Около десяти белков составляют примерно 90% количества всех белков плазмы. На остальные 10% приходится свыше 100 различных белков, содержание некоторых может быть в пределах всего 50-200 мкг/л. Это - так называемые минорные белки. Большинство белков плазмы крови являются гликопротеинами. Исключение составляют лишь альбумин и небольшое число других белков и ферментов плазмы. При электрофорезе на ацетатцеллюлозе обычно происходит разделение пяти основных фракций белков сыворотки крови. Выделяют фракции альбумина, альфаі-, альфа 2-глобулинов, бета- и гамма- глобулинов [Галь Э., Медьеши Г., Верецкеи Л., 1982].
Альбумин - в количественном отношении наибольшая и самая однородная фракция белков плазмы. В организме альбумин выполняет следующие функции: транспортную, регулятора коллоидно-осмотического давления плазмы, белкового резерва организма. Одной из основных особенностей альбумина является способность связывать большое число различных соединений. Среди этих соединений - жирные кислоты, стероиды, билирубин, гемин, органические красители, лекарственные препараты (салицилаты, сульфаниламиды, барбитураты, антибиотики), ионы кальция, меди и другие. В плазме содержится 35-55 г/л альбумина. Этот белок синтезируется в печени со скоростью 10-12 г в сутки и примерно столько же разрушается, причем 20% в желудочно-кишечном тракте.
Большинство белков острой фазы входят в группу альфа-глобулинов. Их концентрации нарастают в остром периоде заболевания, когда имеет место воспаление, аллергия или деструкция [Меньшиков В.В., 1982]. В зоне альфа 1-глобулина располагаются следующие главные белки: альфа 1-антитрипсин, альфа-липопротеин, альфа-1-кислый гликопротеин, протромбин, тиреоид-связывающий глобулин [Кухта В.К., Олецкий Э.И., Стожаров А.Н., 1986], альфа 1-антихимотрипсин, Gc-глобулин, промежуточный альфа-ингибитор трипсина. Альфа-1-антитрипсин является ингибитором протеиназ, синтезируется гепатоцитами, физиологическая концентрация в сыворотке крови составляет 2-4 г/л. Альфа-1-кислый гликопротеин (орозомукоид) синтезируется в печени, в плазме его содержание составляет по данным Кухты В.К., Олецкого Э.И., Стожарова А.Н. [1986] 0,6-0,9г/л, а по сведениям Меньшикова В.В. [1982] - 0,55-1,4 г/л.
Альфа-1-антитрипсин и орозомукоид - белки острой фазы воспаления. Альфа- 1-липопротеин осуществляет транспорт холестерина и жирорастворимых витаминов, относится к липопротеинам высокой плотности (ЛПВП). Протромбин является фактором свертывания крови, его физиологическая концентрация составляет 0,05-0,1 г/л.
Тиреоидсвязывающий глобулин осуществляет транспорт тироксина, его концентрация в плазме достигает 0,015 г/л. Концентрация альфа-1-химотрипсина составляет 0,3-0,6 г/л, Gc-глобулина - 0,2-0,55 г/л; промежуточного альфа-ингибитора трипсина - 0,2-0,7 г/л [Меньшикова В.В., 1982]. Общее содержание альфа 1-глобулинов колеблется от 1 до 4 г/л при солевом фракционировании или 2,5-5% от общего содержания белка по данным электрофореза [Хмелевкий Ю.В., Усатенко O.K., 1987]
Новая методика совместного электрофоретического определения белковых и липопротеиновых фракций сыворотки крови
В работе изучены биохимические показатели сыворотки крови 175 женщин в возрасте от 16 до 83 лет. Образцы исследовали на содержание белковых фракций ( альбумин, а 1-, а 2-, Р - и у -глобулины), 78 образцов сыворотки крови исследовали в т.ч. на фракции липопротеинов (а- лп, а1-лп, пре Р- лп, Р- лп), 59 образцов исследовали в том числе на фракции липопротеинов, у которых определяли и ЛПВП1, 49 образцов были исследованы в том числе, на фракции ГАГ (ПС, ГС, ХС). У 30-31 образца были исследованы биохимические показатели, характеризующие физиологическое состояние печени (активность аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, тимоловую пробу и уровень билирубина).
Также были исследованы 49 образцов кожи женщин в возрасте от 15 до 90 лет на содержание общего белка по Лоури, суммарного содержания нуклеиновых кислот и фракционного содержания гликозаминогликанов (ГК, ГС, ХС ). Образцы весом 0,5-1,0 г консервировали в системе этиловый спирт : глицерин в соотношении 1:1, хранили при +4 С.
В экспериментах на 40 белых неинбредных крысах исследовали в печени фракционный состав гликозаминогликанов и динамику включения )4С-глюкозы, меченной по Сі. Также у крыс проводились цитологические исследования с целью определения интенсивности транскрипционных процессов по спектру флуоресценции нуклеиновых кислот в ядрах клеток, окрашенных красителем «акридиновый оранжевый».
Были получены клеточные культуры фибробластов, лимфоцитов и моноцитов для расчета транскрипционного коэффициента а.
Сбор экспериментального материала проводили на базе Городской клинической больницы №6 г. Уфы, паталого-анатомического отделения Городской больницы №13 г. Уфы и вивария лаборатории биологически активных веществ Института нефтехимии и катализа Российской академии наук (г. Уфа). [Lowry О.Н. et al., 1951]. Метод сочетает в себе биуретовую реакцию (т. е. реакцию на пептидные связи) и реакцию Фолина (на ароматические аминокислоты тирозин и триптофан). Реактивы:
1) Карбонат натрия - 2%-ный раствор, приготовленный на 0,1 М растворе гидроксида Na; 2) Сернокислая медь - 0,5%-ный раствор, приготовленный на 1%-ном растворе цитрата натрия; 3) 1 мл раствора 2 смешивают с 50 мл реактива 1 (готовится непосредственно перед употреблением); 4) реактив Фолина-Чокальтеу; 5) раствор альбумина, содержащий 0,25 мг белка в 1 мл.
Ход определения. Исследуемый раствор, содержащий 10-100 мкг белка, доводили дистиллированной водой до 0,4 мл, смешивали с 2 мл реактива 3 и оставляли при комнатной температуре на 10 минут. Затем добавляли 0,2 мл реактива Фолина-Чокальтеу, перемешивали и через 40 мин измеряли на, спектрофотометре величину оптической плотности при А,=750 нм.
Для построения калибровочной кривой в шесть химических пробирок помещали соответственно по 0,04; 0,08: 0,16; 0,24; 0,32 и 0,40 мл раствора альбумина, содержащего 0,25 мг белка в 1 мл, и дистиллированную воду до 0,4 мл. Дальнейшую обработку вели так же, как и исследуемых образцов. Полученные величины оптической плотности откладывали по оси ординат, а концентрацию белка - по оси абсцисс.
Электрофоретическое определение фракционного состава белков сыворотки крови проводили на отечественной установке УЭФ-01 «Астра» (АСТР.054954.001ПС, ТУ 944163-001-54312116-99). Электрофорез образцов, объемом 4р мкл, проводили по стандарной методике [Титов В.Н., Амелюшкина В.А., 1994] с использованием пленок 57x140 мм из ацетатцеллюлозы МФ АС-ОС-1 в 0,04 М растворе веронал-ацетатного буфера (рН 8,6). Электрофорез вели при напряжении 200 В, ограничении по току 35 мА, напряженности поля 4 В/см2 в течение 25 мин. Пленки после фореза окрашивали красителем «Пунцовый С» в течение 3-5 минут, промывали 3%-ным раствором уксусной кислоты и сразу денситометрировали с помощью входящего в установку сканера, обрабатывали полученную информацию используя прилагающуюся программу фирмы «Астра» (г. Уфа) на ПЭВМ «Pentium-4».
Возрастные изменения содержания гликозаминогликанов, белка и нуклеиновых кислот в коже женщин
Так как метаболизм ГАГ связан с генетическим аппаратом клетки, возникает целесообразность изучения возрастных изменений содержания этих полисахаридов в органах и тканях. В качестве объекта исследования нами была выбрана кожа человека, как орган наиболее подверженный возрастным изменениям, которые к тому же можно констатировать и визуально. Исследовали 49 образцов кожи женщин (кадаверные ткани) в возрасте от 15 до 90 лет. Средние значения и стандартные отклонения биохимических показателей, а также количество исследованных образцов представлены в таблице 4.1.
Результаты обследования всей выборки испытуемых выявили большие стандартные отклонения изученных показателей, что позволяет предполагать существенный разброс значений изученных параметров в различных возрастных группах. Так, выраженное в процентах отношение стандартное отклонение/ среднее значение составило для Белка - 30,7%; ГК -70,7%; СГАГ - 99,7%; ГАГ - 146,1%; ДНК - 251,1%. Поэтому, в соответствии с классификациями, принятыми в геронтологии и возрастной психологии (Маралов В.Г., 2002), мы достаточно условно распределили данные по возрастным градациям: до 50 (зрелость), 50-60 лет (кризис зрелости), 60-70 лет (пожилой возраст), 70-80 лет (ранняя старость) и св.80 лет (поздняя старость). Полученные результаты по этим возрастным группам приведены в таблице 4.2.
Для ДНК достоверных различий средних значений в возрастных группах по t-тесту Стьюдента (табл. 4.7.) не выявлено.
Мы решили сравнить изменения в значениях переменных в различных возрастных группах с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Полученные результаты приведены в таблицах 11.38- 11.47. Расчеты проведенные с использованием U-критерия Манна-Уитни показали что: Содержание СГЛГ в коже у женщин: 1 возрастной группы выше, чем в 4 (р=0,032970) 1 возрастной группе выше, чем в 5 (р=0,043309) 2 возрастной группе выше, чем в 3 (р=0,025012) 2 возрастной группе выше, чем в 4 (р=0,000108) 2 возрастной группе выше, чем в 5 (р=0,001281) 3 возрастной группе выше, чем в 4 (р=0,027487) 3 возрастной группе выше, чем в 5 (р=0,014138) Содержание белка в коже у женщин: 2 возрастной группе выше, чем в 4 (р=0,024236) Содержание ГК в коже у женщин: 2 возрастной группе выше, чем в 4 (р=0,020137) Содержание ГАГ в коже у женщин: 2 возрастной группе выше, чем в 4 (р=0,002462) 2 возрастной группе выше, чем в 5 (р=0,016639)
Значимых различий между показателями ДНК не выявлено (табл.11.38 -11.47) что подтверждает данные, полученные при расчетах t-критерия Стьюдента. В таблицах 11.39- 11.45 жирным шрифтом без курсива нами отмечены тенденции достоверных различий (р 0,1): концентрация ГАГ в 1 возрастной группе выше чем 5 возрастной группе (р=0,074204); во 2 группе выше чем в Згруппе (р=0,074204) и в 3 группе выше чем в 4 группе (р=0,066193). Содержание белка в 1 группе выше чем в 3 группе (р=0,098961).
Вычисление коэффициентов корреляции Пирсона выявило отрицательную корреляцию средней силы между возрастом и ГК (г=-0,58), возрастом и СГАГ (г=-0,53), возрастом и ГАГ (г=-0,66), умеренную положительную корреляцию между ГК и СГАГ (г=0,48), сильную положительную корреляцию между ГАГ и СГАГ (г=0,79), ГК и ГАГ (г=0,91).
Нами также было проведено исследование значений переменных на соответствие закону нормального распределения с применением критерия % . Полученные результаты, приведенные в таблице 4.9, показали, что нормальному распределению не соответствуют только переменные «возраст» и «ДНК».
Одним из общепризнанных непараметрических методов оценки силы корреляционной связи является вычисление коэффициентов ранговой корреляции Спирмена, позволяющего с высокой степенью надежности выявить корреляционные связи в выборках, для которых подчинение нормальному распределению не является определяющим.
Примененный нами подход дал свои результаты (табл.4.10) и подтвердил наличие отрицательной умеренной корреляции между возрастом и ГК (г=-0,33), отрицательной корреляции средней силы между возрастом и СГАГ (г=-0,57), отрицательной умеренной корреляции между возрастом и ГАГ (г=-0,43), положительной сильной корреляции между ГК и СГАГ (п=0,73), ГК и ГАГ (г=0,93), СГАГ и ГАГ (г=0,89). К корреляциям, полученным по Пирсону, добавились еще две статистические значимые корреляции: положительные умеренные корреляции между белком и ГК (г=0,34), белком и ГАГ(г=0,32).
На рисунке 4.6 приведены результаты однофакторного дисперсионного анализа влияния возраста на уровень ГАГ в коже женщин. Вычисленное значение вероятности нулевой гипотезы об отсутствии влияния возраста составило 0,49555, что больше критического значения 0,05. Поэтому мы утверждаем, что возраст не оказывает влияния на уровень ГАГ в коже женщин.
Рядом авторов в стареющей коже био- и гистохимически определялось уменьшение концентрации гиалуроновой кислоты [Ghersetich I., Lotti Т., Campanile G., Grappone С, Dini G., 1994; Juhlin L., 1997] и увеличение уровня сульфатированных ГАГ. Согласно же Meyer L.J., Stern R. [1994], с возрастом не изменяется ни количество, ни размер этого полимера, однако усиливается связь гиалуроновой кислоты с белками. По данным Willen M.D., Sorrel J.M.,
Lekan C.C., Davis B.R., Caplan A.I. [1991], содержание определенных гликозаминогликанов в ходе старения независимо варьирует в каждом из слоев кожи, binder J., Schonrock P., Nassgen A., Schmiegelow P. [1986] показали значительное возрастзависимое снижение концентрации ДНК, а также активности р-глюкуронидазы, p-N-ацетилглюкозаминидазы в коже крыс. Такое снижение активности ферментов, деградирующих ГАГ является, вероятно, отражением замедления общего метаболизма этих биополимеров. Нами же констатированы следующие результаты: В результате статистической обработки средних значений исследованных показателей по t-тесту Стьюдента выявлено, что достоверные различия в содержании общего белка имеются только между группами 50-60 лет и 70-80 лет (р=0,011). Уровень ПС уменьшается в возрастной группе 70-80 лет по сравнению с возрастными группами 50-60 лет (р=0,001) и до 50 лет (р=0,013); концентрация ГК снижается в возрастной группе 60-70 лет по сравнению с возрастной группой 50-60 лет (р=0,015) и концентрация ГК уменьшается в возрастной группе св.80 лет по сравнению с возрастной группой 60-70 лет(р=0,023). Для СГАГ достоверные различия средних значений по t-тесту Стьюдента выявлены между возрастными группами до 50 лет и 70-80 лет (р=0,004) уровень СГАГ понижается; между возрастными группами 50-60 лет и 70-80 лет (р=0,031) концентрация СГАГ также уменьшается. Достоверные различия средних значений по t-тесту Стьюдента для ГАГ обнаружены между возрастными группами до 50 лет и 70-80 лет (р=0,002) концентрация ГАГ уменьшается; между возрастными группами 50-60 лет и 70-80 лет (р=0,002) концентрация ГАГ понижается; между возрастными группами 60-70 лет и 70-80 лет (р=0,036) концентрация ГАГ уменьшается ; между возрастными группами 70-80 лет и св.80 лет (р=0,011) концентрация ГАГ увеличивается. Для ДНК достоверных различий средних значений в возрастных группах по t-тесту Стьюдента не выявлено.
