Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 13
1.1. Патогенетические основы ишемической болезни сердца 13
1.2. Острый коронарный синдром, общие принципы диагностики 18
1.3. Кардиологические маркеры 21
1.4. Механизм образования ишемически-модифицированный альбумина 26
1.5. Методы определения ишемически-модифицированного альбумина 27
1.6. Кобальт-связывающая способность сыворотки крови как показатель содержания ишемически-модифицированного альбумина 28
1.7. Вклад белков в суммарную кобальт-связывающую способность сыворотки и плазмы крови 30
1.8. Методика определения уровня кобальт-связывающей способности сыворотки крови 32
1.9. Заключение 33
ГЛАВА 2 Материалы и методы 35
2.1. Список использованных материалов 35
2.2. Список использованного оборудования 35
2.3. Объекты исследования 36
Исследование образцов сыворотки крови человека 36
Хранение биологических образцов и пробоподготовка 38
2.4. Список используемых методов 38
Анализ кобальт-связывающей способности 38
Линейность 38
Сходимость/воспроизводимость 39
Предел обнаружения, предел надежного количественного определения 39
Изучение стабильности биологических проб 40
Оценка параметров биологической вариабельности показателя 41
Определение содержания глобулинов в биологической пробе фотохимическим методом с п-диметиламинобензальдегидом 41
Определение содержания сывороточного альбумина и общего белка в сыворотке крови 42
Окислительная модификация альбумина гипохлоритом натрия 42
Окислительная модификация альбумина системой Фентона 42
Сайт-специфическая модификация сывороточного альбумина 43
Анализ постмодификационных структурных изменений белка 43
2.5. Методы статистической обработки данных 43
ГЛАВА 3 Оптимизация протокола определения уровня кобальт-связывающей способности растворов белков и биологических образцов 45
3.1. Определение условий проведения анализа содержания ионов кобальта в
растворе 46
Исследование спектральных характеристики комплекса ДТТ-Со2+.. 46
Кинетика реакции комплексообразования дитиотрейтола с ионами кобальта.46
Исследование спектральных характеристики комплекса дитиотрейтола с ионами кобальта в присутствии бычьего сывороточного альбумина 48
Исследование стабильности реактивов на основе буферных систем MOPS, ТРИС, HEPES, Трицин 51
3.2. Аналитические характеристики метода 54
3.3. Анализ кобальт-связывающей способности сывороточного альбумина.. 60 Оценка кобальт-связывающей способности бычьего сывороточного альбумина с помощью реактивов на основе HEPES, MOPS, ТРИС 60
Оценка коэффициента вариации метода при определении кобальт-связывающей способности образцов сыворотки 63
Зависимость кобальт-связывающей способности альбумина от времени инкубации с ионами кобальта 64
Изучение кинетики реакции комплексообразования дитиотрейтола с ионами кобальта в присутствии бычьего сывороточного альбумина. 65
3.4. Исследование стабильности образцов сыворотки при хранении 68
Стабильность образцов сыворотки в течение дня 68
Стабильность при повторном замораживании-оттаивании 69
Долгосрочная стабильность образцов сыворотки крови 70
3.5. Протокол проведения анализа 71
ГЛАВА 4 Изменения кобальт-связывающей способности сывороточного альбумина под дейвием окислителей in vitro
Глава 5 Определение региональных референтных пределов уровня кобальт-связывающей способности сыворотки крови здоровых добровольцев 78
5.1. Анализ необходимого размера выборки 78
5.2. Анализ корреляционных зависимостей 81
6. ГЛАВА 6 Исследование показателей биологической вариабельности уровня кобальт-связывающей способности сыворотки крови 82
Глава 7 Исследование динамики показателя у пациентов, перенесшихаорто-коронарное шунтирование 89
Глава 8 Исследование образцов сыворотки крови пациентов без острой ишемии миокарда 92
Глава 9 Экономический анализ 95
9.1. Экономическая оценка рыночной цены разработанного метода, сравнение с зарубежными аналогами 95
9.2. Расчет экономической выгоды от внедрения метода определения кобальт-связывающей способности сыворотки крови для диагностики острого коронарного синдрома в рутинную практику диагностических лабораторий97
Заключение 100
Выводы 103
Практические рекомендации 104
Список используемых сокращений 105
Список литературы 107
Приложение А 120
- Методика определения уровня кобальт-связывающей способности сыворотки крови
- Предел обнаружения, предел надежного количественного определения
- Исследование стабильности реактивов на основе буферных систем MOPS, ТРИС, HEPES, Трицин
- Расчет экономической выгоды от внедрения метода определения кобальт-связывающей способности сыворотки крови для диагностики острого коронарного синдрома в рутинную практику диагностических лабораторий
Методика определения уровня кобальт-связывающей способности сыворотки крови
Необходимость решения данной проблемы диагностического теста указывает на необходимость проведения ряда дополнительных исследований. И тут мы наталкиваемся на еще одну проблему, требующую нашего внимания: отсутствие протокола определения КСС.
Тест не зарегистрирован на территории РФ, а подробный протокол для проведения данного теста производителем не опубликован. Те методики, которые были использованы в различных исследованиях и позднее опубликованы в научных статьях, к сожалению, весьма разноречивы. Производитель АСВ-теста советует использовать сыворотку для проведения анализа (объем 250-350 мкл), но многие исследователи используют плазму. Причем объемы исследуемого биологического материала могут не совпадать с рекомендуемыми производителем. Не определены оптимальные соотношения реагентов при проведении анализа. Не определены также оптимальные условия проведения анализа. Нет общепринятого представления о длине волны для проведения измерений ОП, она варьирует от 470 до 505 нм в разных исследованиях [34, 58, 65]. Отсутствуют общепринятые единицы измерения уровня ИМА. Производителем диагностикумов используются некие условные единицы, физический смысл которых до конца не понятен без протокола проведения АСВ-теста. В тоже время некоторые исследователи используют для оценки уровня КСС оптические единицы [34, 58].
Выше изложенные методологические недостатки делают необходимым и неизбежным разработку подробного протокола анализа КСС биологических образцов.
Для решения этой задачи необходимо провести определение оптимального состава реактивов, соотношения компонентов реакционной смеси и исследовать спектральные и кинетические характеристики комплекса реагента с Со2+, а также определить условия проведения анализа КСС чистых растворов белка и биологических образцов.
Большая доля пациентов с бессимптомными или малосимтомными формами течения ИБС, а также недостатки существующих диагностических подходов вынуждает исследователей к поиску новых объективных методов диагностики.
И действительно, разработка общепринятого маркера для диагностики ранних обратимых стадий острой ишемии миокарда позволила бы быстро и адекватно выбрать тактику лечения пациента, не дожидаясь повышения в крови уровня маркеров некроза кардиомиоцитов.
КСС-тест, принадлежащий к числу именно маркеров ишемии, мог бы быть весьма полезен для ранней диагностики острых форм ИБС, однако без решения аналитических проблем определения ИМА нельзя говорить о значимости и применимости данного метода в клинической практике. В отсутствии четкого представления о природе ИМА и о механизме КСС невозможно оценить диагностическую ценность его результатов.
Несмотря на существование данных о наличии способности связывать ионы двухвалентных металлов не только у сывороточного альбумина, вклад других белков сыворотки в общую КСС сыворотки до сих пор не исследовался. Хотя эти данные необходимы для адекватной оценки значимости теста и должны учитываться при интерпретации его результатов.
При попытке изучить эти вопросы мы сталкиваемся с проблемами отсутствия опубликованного протокола проведения анализа, а также различия в подходах к его проведению разными исследователями. И это неизбежно влечет за собой необходимость разработки собственного протокола исследования.
Таким образом, решение вышеперечисленных задач представляется весьма актуальным. А полученные данные будут полезны для формирования целостного представления о ИМА, как о диагностическом маркере ишемии миокарда. 2. ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе были использованы следующие реактивы: дитиотрейтол (ДТТ) (Диаэм, США), N-2-гидроксиэтилпиперазин-N -этансульфоновая кислота (HEPES), good bufer, P.A., min. 99% (Serva, Германия), морфолинопропансульфониевая кислота (MOPS) (Fluka, Швецария), трис-(оксиметил)-аминометан (ТРИС) (НПО «Биохимреактив», Олайский завод хим.реактивов, Россия), кобальта сульфат, ч.д.а. (Реахим, Россия), трицин (Sigma, США), хлорид натрия, ч.д.а. (Реахим, Россия), бычий сывороточный альбумин (БСА) (Диа–М, Россия), калия фосфорнокислый двузамещенный трехводный, ч.д.а. (Реахимсервис, Россия), натрия фосфорнокислый однозамещенный, х.ч. (Реахимсервис, Россия), аммония-железа(II) сульфат (соль Мора) (Реахимсервис, Россия), меди сульфат пятиводный (Реахимсервис, Россия), натрия азид (Merck, Германия), спирт этиловый 96 % (Реахим, Россия), сефадекс G25 Coarse (Amersham Pharmacia, США), 2,2 -азино-бис-(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота) (ABTS или АБТС), метгемоглобин из эритроцитов крупного рогатого скота, калия гидроксид х.ч. (Реахим Россия), водорода пероксид х.ч. (Реахим Россия), хлорид железа (III), калия гидрофосфат х.ч. (Реахим Россия), натрий фосфорнокислы 2-х замещеный 12-ти водный ч.д.а. (Реахим Россия), иммуноглобулин человеческий нормальный фирмы (Биомед, Россия), п-диметиламинобензальдегид (ПДАБА) (Реахим, Россия), соляная кислота (Реахим, Россия), 5,5 -Дитиобис(2-нитробензойная кислота), 98% (Sigma, США).
В ходе работы были использованы наборы реактивов для определения концентрации общего белка (Диакон-ДиаСис, Россия) и сывороточного альбумина (Диакон-ДиаСис, Россия).
При выполнении работы были использованы следующие инструменты, приборы и лабораторное оборудование: спектрофотометр Olvex diagnosticum SP-ultra («Олвекс», Россия), полуавтоматический титратор Vit90 (Radiometer, Дания), магнитная мешалка MM 1 (Польша), электронные весы модель МЕ-210 (CAS, Корея), автоматические дозаторы (сэмплеры) Finnpipette “Thermo Labsystems” (Финляндия), “Gilson” (Франция) и Ленпипет (Россия), степпер Ленпипет (Россия), спектрофотометр Helios (Англия), спектрофотометр Helios (Англия) мешалки магнитные 1607 (“LKB”, Швеция), весы лабораторные электронные АВ120-01 (Веста, Россия), центрифуги лабораторные ОПН-8 (Россия) и B3.11 (Jouan, Франция), эппендорф (Германия), водяная баня sky line TW-2 (Латвия); термостат суховоздушный ТС 80 (Россия).
Предел обнаружения, предел надежного количественного определения
Изучение стабильности образцов сыворотки проводили согласно рекомендации Управление по контролю качества продуктов и лекарств [107]. При анализе использовали следующий протокол:
1. Стабильность при замораживании-оттаивании. Пробирку с образцом c известной величиной КСС подвергали трем циклам замораживания и оттаивания с интервалом 24 часа. Замораживание проводили при -20С, оттаивание - при комнатной температуре. После чего, определяли КСС в 3-х повторностях;
2. Кратковременная стабильность. Пробирку с образцом c известной величиной КСС оставляли при температуре +4-+6 С на 4 и 6 ч. После чего, проводили анализ КСС в 3-х повторностях;
3. Длительное воздействие температуры (longerm Stability). Образец с известной величиной КСС разделили на аликвоты и заморозили при -20С. Повторно анализировали КСС в 3-х повторностях с интервалом от 1 недели до 1 месяца. Оттаивание проводили при комнатной температуре, каждый раз используя новую пробирку с образцом.
Для проведения этой серии экспериментов был использован вариант ДТТ-реактива, приготовленный на основе 25 мМ буфера HEPES с pH 7,4 и изотоническим содержанием NaCl.
Исследование биологической вариабельности проводили в течение 4-х недель, забор образцов крови проводили 1 раз в неделю. Пробоподготовка и хранение полученных образцов была аналогична описанному выше. Все образцы анализировались в двух приготовления. Расчет RCV (коэффициент критической разницы) проводили по Фрейзеру [66], а также по Харрисону [72] (формула 4 и 5): Pr{ 2I [(D0/1,96)2-2 I 2A]/2(1- I)} = p (4) Pr{ 2I (D0/1,96)2} = p (5) 2I - внутрииндивидуальная вариабельность, D0 – различия в изменениях показателя, 2A – аналитическая вариабельность, p – кумулятивная вероятность, Pr – вероятность выполнения условия I – корреляция между двумя последовательными измерениями.
Концентрацию глобулярных белков в растворах определяли фотохимическим методом, описанным Y. Susuki в [128]. Анализ проводили следующим образом. К 2 мл 1% (масса/объем) раствора ПДАБА в 8,4 М HCl добавляли 0,48 мл H2O и 0,03 мл исследуемой пробы. Реакционную смесь инкубировали 45 минут при комнатной температуре и при освещении люминесцентными лампами со световым потоком 3000 люмен. Оптическую плотность (ОП) окрашенного продукта измеряли при длине волны 635 нм. Калибровку рабочего реактива производили, используя растворы иммуноглобулина человеческого нормального в концентрациях 3,67-36,67 г/л.
Концентрацию сывороточного альбумина и общего белка в сыворотки крови определяли стандартными лабораторными методами (с бромкрезоловым зеленым и биуретовым реактивом, соответственно) с использованием коммерческих наборов фирмы Диакон-ДиаСис, Россия.
Окислительную модификацию альбумина проводили по методу, описанному Hawkins C. L. и Davies M. J. [73]. Окисление исследуемого белка проводили следующим образом. Смешивали 2 мл альбумина в концентрации 10 мг/мл с 0,450 мл раствора гипохлорита натрия. Смесь инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Растворы с концентрацией 0,5–20 мМ гипохлорита натрия готовили в день проведения эксперимента. Концентрация гипохлорит– ионов в исходном растворе устанавливалась обратным титриметрическим методом с тиосульфатом натрия [10]. Низкомолекулярные примеси удаляли c помощью гель-фильтрации на колонках с сефадексом G-25.
К 2,4 мл БСА в концентрации 10 мг/мл добавляли 0,3 мл смеси 1 мМ ЭДТА с 4 мМ раствором соли железа или меди (1:1) и 0,3 мл 0,3 мМ перекиси водорода. Смесь инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Для приготовления системы Фентона растворы солей железа готовили непосредственно перед добавлением в инкубационную смесь, растворы солей меди хранили при комнатной темепературе. Раствор 300 мМ пероксида водорода хранили при +2 – +4С. В день проведения эксперимента готовили 0,3 мМ раствор пероксида водорода. Низкомолекулярные примеси удаляли c помощью гель-фильтрации на колонках с сефадексом G-25.
Исследование стабильности реактивов на основе буферных систем MOPS, ТРИС, HEPES, Трицин
Обеспечить необходимую точность и воспроизводимость в работе реактива невозможно без подбора его оптимального состава. Нами была проанализирована стабильность следующих составов ДТТ-реактива: 25 мМ MOPS с рН 7,4; 25 мМ HEPES с рН 7,4; 50 мМ ТРИС с рН 7,4; 12,5 мМ трицин с рН 7,4. Все варианты реактива содержали хлорид натрия в изотонической концентрации.
Проводили калибровку свежеприготовленного реактива, и реактива после 1-и 2-х суток хранения.
Результаты ОП, полученные для реактива на основе трицина, оказались в несколько раз ниже в сравнении с другими вариантами реактива. Ввиду этого можно сделать вывод о неприменимости реактива данного состава для анализа КСС.
Результаты исследования ОП комплекса в зависимости от концентрации Со2+ для трех независимих измерений и трех приготовлений реактива для остальных буферных систем приведены в табл. 3 и на рис. 7-9. Значения CV при определении Со2+ в диапазоне концентраций от 22,7 до 90,9 мкМ для различных вариантов реактива представлены в табл. 3. На рис. 10-13 по оси ординат отмечена разница ОП, полученных для свежеприготовленного реактива и того же реактива после хранения. По оси абсцисс – конечные концентрации Со2+ в реакционной смеси.
При использовании свежеприготовленных растворов на основе буфера ТРИС значения ОП оказались несколько ниже, чем при использовании МОPS и HEPES (табл. 2). Величина вариабельности для данного варианта реактива оказалась выше таковой для реактивов на основе МОPS и HEPES. Напротив, в случае использования HEPES-буфера коэффициенты вариации (как между измерениями, так и между приготовлениями реактивов) оказались в пределах 10% (табл. 2). Хранение реактива в течении двух суток приводило к резкому снижению окраски реакционной смеси при использовании любой из исследованных буферных систем (рис. 7-9). Этот факт, скорее всего, является следствием постепенного окисления тиольных групп молекулы ДТТ в растворе. При хранении реактива в течении 1 суток в случае ТРИС и MOPS также наблюдали резкое снижение результата. В то же время, в случае реактива на основе HEPES смещение результатов оказалось в пределах доверительных интервалов для свежеприготовленных растворов (рис. 9).
Рисунок 9. Диаграмма рассеяния результатов определения ОП комплекса ДТТ-Со2+ для свежеприготовленного реактива на основе 25 мМ HEPES рН 7,4 (приготовление 1-3) и для реактива после хранения в темном месте при t= 0 - +4 С в течение 1 и 2 суток.
Как показали результаты эксперимента в присутствии трицина ДТТ практически не образует комплекса с ионами кобальта. Это может быть связано с тем, что трицин способен образовывать относительно прочные комплексы с двухвалентными катионами [9], в тоже время нельзя исключить взаимодействия трицина с ДТТ, что может снижать концентрацию активного реагента в инкубационной смеси. Для остальных буферных растворов были получены значения ОП, коррелирующие с изменением концентрации Со2+ в растворе. Особенно устойчивым оказался вариант ДТТ-реактива на основе HEPES, с течением времени их свойства менялись в меньшей степени.
Как уже обсуждалось нами ранее, авторами АСВ-теста используется не прямой метод определения ИМА, природа которого изучена пока недостаточно, а лишь косвенный анализ КСС. В свою очередь ее изменение может быть связано не только с ишемической модификацией альбумина, но и с другими видами модификации этого белка. Кроме того оказывает влияние связь альбумина с различными лигандами (жирными кислотами). Другие белки плазмы также могут влиять на общий уровень КСС. И поскольку нет общепринятого взгляда на механизм образования ИМА, этими факторами нельзя пренебрегать.
С другой стороны в опубликованной литературе нет исследований аналитических характеристик метода определения КСС, что оставляет открытым вопрос о применимости самого метода и адекватности полученных с помощью него результатов. Однако необходимо отметить, что неполное представление о природе аналита препятствует созданию эталонной пробы, которая необходима для оценки целого ряда аналитических характеристик метода. В связи с этим, мы провели анализ некоторых из аналитических характеристик метода определения Со2+ в растворе.
Поскольку реактив на основе буфера HEPES показал большую стабильность своих свойств и меньшую вариабильность полученных результатов, мы исследовали его аналитические характеристики подробно (рис. 10). Был проанализирован диапазон линейности метода определения Со2+, а также оценены такие параметры как сходимость, воспроизводимость, предел обнаружения и предел надежного количественного определения Со2+ в растворе.
Анализ регрессионных прямых для других вариантов реактива представлен на рис. 12 и 13.
Анализ линейности для реактива на основе HEPES-буфера проводили согласно рекомендациям ICH [78, 79]. На основании полученных данных были построены калибровочные прямые и рассчитаны уравнения линейной регрессии, представленные на рис. 10.
Расчет экономической выгоды от внедрения метода определения кобальт-связывающей способности сыворотки крови для диагностики острого коронарного синдрома в рутинную практику диагностических лабораторий
Теперь рассмотрим экономическую эффективность теста определения КСС сыворотки крови для диагностики и стратификации рисков для ОКС при его использовании в рутинной лабораторной практике.
Проблема диагностики ОКС, заключается в относительно высокой частоте ложноположительных и ложноотрицательных диагностических заключений.
Прогностическая значимость отрицательного результата у рассматриваемого метода 96% [34], а число ложных госпитализаций (ЛГ) – около 21%. Таким образом, число необоснованных госпитализаций может быть снижено на 17 % ,что приводит к более эффективному расходованию койко–фонда пациентов кардиологического профиля.
Из всех пациентов, поступивших в стационар с синдромом боли за грудиной, нестабильная стенокардия и NSTEMI составляет 77,83%, следовательно, из 1000 чел поступающих с подозрением на ОКС – 778 чел имеют ОИМ (1000 0,778 = 778 чел). А число дополнительно выявляемых с помощью нашего теста ЛГ - 132. 778 0,17 = 132 чел.
Стоимость лечения пациента с ОКС, включая диагностические исследования из расчета по стандарту на 12 дней составляет 25 788,05 руб. с учетом проведения коронарографии, но т.к. при условии, что пациенту в момент болевого приступа при ОКС данная процедура не проводится, поэтому мы имеем право пренебречь этой услугой в своих расчетах. Для удобства оценки экономической выгоды рассчитаем стоимость 1 дня лечения пациента с ОКС в условиях стационара.
Расчет произведен при условии, что пациент находится на лечении в кардиологическом отделении с подозрением на ОКС до момента подтверждения/отвергания диагноза в среднем 4 дня, лечение в стационаре рассчитано согласно, приказа МЗ и СР РФ от 06.09.2005 № 548 «Об утверждении стандарта медицинской помощи больным с острым ИМ».
Стоимость проведения КСС теста 1 пациенту составляет 60 руб., т.е. для того чтобы провести тест 1000 пациентам, поступающим в приемный покой с подозрением на ОКС необходимо затратить 60 000 рублей. Учитывая, что число ЛГ составляет 132 человека из 1000, можно узнать, сколько стоит отклонение диагноза ОКС еще до поступления пациента в кардиологическое отделение 60000 / 132 = 454,55 руб.
Прямая экономическая выгода от выявления каждого дополнительного случая ЛГ пациентов при подозрении на ОКС составляет 4 767,23 руб. на одного человека
Суммарная выгода от снижения числа ЛГ в расчете на каждую тысячу пациентов, поступающих в приемный покой с подозрением на ОКС составляет 885 544,44 руб., эта цифра почти в 15 раз выше, чем затраты системы здравоохранения, необходимые для проведения 1000 пациентам теста для определения уровня КСС сыворотки крови, а чистая экономическая выгода (с вычетом затрат на проведение анализа) составит 825 544,44 руб.
На сегодняшний день ишемическая болезнь сердца (ИБС) является одной из основных причин смертности, а также временной и стойкой утраты трудоспособности населения в развитых странах мира. В связи с этим проблема ИБС занимает одно из ведущих мест среди важнейших медицинских проблем XXI века. ОКС одна из опаснейших форм ИБС. К этому синдрому относят нестабильную стенокардию и ИМ. От ранней постановки диагноза при этих острых состояниях зависит наличие и тяжесть осложнений, жизнь пациента, ее продолжительность и качество. Сейчас основными диагностическими критериями являются данные ЭКГ и уровень тропонинов крови. Однако ЭКГ обладает низкой чувствительностью, и не может помочь при диагностике NSTEMI и нестабильной стенокардии. А уровень тропонинов повышается спустя несколько часов с момента начала приступа, в этих условиях можно говорить только подтверждении диагноза, но не о экспресс-диагностике. А в случае нестабильной стенокардии их уровень не поднимается, поскольку некроза кардиомиоцитов не происходит. Таким образом, перед современной диагностикой встает проблема необходимости разработки раннего маркера ишемии миокарда, уровень которого повышался еще до некроза сердечной мышцы.
Известно, что ишемия миокарда может приводить к образованию ИМА (Бар-Ором с соавт. в 2000 г.), обладающего сниженной способность связывать двухвалентные катионы, авторы предложили оценивать его содержание посредствам измерения КСС сыворотки крови. Согласно литературным данным уровень ИМА повышается в течение 30 мин с момента начала приступа [86]. Данный маркер позволяет надежно исключить диагноз ОКС (обладает высокой отрицательной прогностической значимостью), избавив пациента от ненужных назначений, а стационар – от неоправданных расходов [34]. Однако коммерческий АСВ-тест (albumin cobalt binding test) не имеет регистрации на территории РФ и не распространяется отечественными дистрибьюторами. Вместе с тем, данные многочисленных исследований, посвященных АСВ-тесту, разноречивы, поэтому внедрение данного диагностического показателя требует разработки нового подхода к его определению, а также проведения дополнительных клинических исследований.
