Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Использование наночастиц в биологии и медицине 11
1.2. Биологическая активность наночастиц железа 21
1.3. Биологическая роль меди 29
1.4. Области применения наночастиц цинка 34
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты исследования 37
2.2. Проведение экспериментальной работы 37
2.3. Биохимический анализ сыворотки крови 38
2.4. Изучение морфологии органов 48
2.5. Методы цитологических исследований 49
2.6. Статистические параметры, использованные в работе 51
ГЛАВА 3. Результаты исследований 52
3.1. Изучение биохимических показателей сыворотки крови у мышей при пероральном введении наночастиц металлов 52
3.1.1. Изменение биохимических показателей сыворотки крови у мышей под влиянием наночастиц железа 52
3.1.2. Воздействие наночастиц меди на биохимические показатели сыворотки крови белых беспородных мышей
3.1.3. Влияние наночастиц цинка на обменные процессы у мышей 76
3.1.4. Исследование действия наночастиц сплава металлов [Fe Си Zn] на метаболические процессы у мышей 86
3.2. Морфологические изменения в органах мышей при пероральном введении наночастиц металлов 98
3.2.1. Анализ морфологии органов под влиянием наночастиц железа 98
3.2.2. Характеристика изменений в органах при пероральном введении нанопорошка меди 105
3.2.3. Влияние перорального введения нанопорошка цинка на морфологические параметры органов мышей 111
3.2.4. Морфологические изменения в органах при введении нанопорошка сплава наночастиц [Fe Си Zn] 117
3.2.5. Сравнительный анализ действия наночастиц металлов на морфологию органов мышей 122
3.3. Оценка генотоксичности наночастиц металлов 128
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 141
Выводы 157
Список литературы
- Биологическая роль меди
- Проведение экспериментальной работы
- Изменение биохимических показателей сыворотки крови у мышей под влиянием наночастиц железа
- Влияние перорального введения нанопорошка цинка на морфологические параметры органов мышей
Введение к работе
Актуальность исследования. Использование наночастиц находит широкое практическое применение в различных областях химии, биологии, экологии. Нанопорошки металлов, полученные различными методами, могут применяться в качестве источников микроэлементов в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве.
Особое внимание уделяется исследованию действия на организм нанопорошков биогенных металлов, в частности меди, цинка, железа, биологическая ценность которых определяется многогранностью функций в сложных биохимических процессах и активным участием в клеточном метаболизме, обеспечивающем нормальное функционирование организма. (Арсентьева И.П., 2008; Глущенко Н.Н., 2007; Давронов К.С., 2006).
Использование наночастиц несет не только несомненные преимущества, но и потенциальную опасность вредного воздействия на здоровье человека и природные экосистемы (Колесниченко А.В. и др., 2008). Взаимодействие наноструктур с такими биологическими компонентами, как молекулы нуклеиновых кислот, белков и клетками в целом, приводят к их уникальному распределению в тканях организма, возможному иммунному ответу и изменениям в метаболизме (Fischer H.C., 2007; Geze A., 2007; Hall J.B., 2007; Jain T.K., 2008; Zieziulewiez T.J., 2003).
Цель работы. Целью данной работы явилось изучение действия наночастиц железа, меди, цинка и сплава данных металлов при их введении per os на обменные процессы у лабораторных животных.
Задачи исследования:
1) Изучить дозозависимые эффекты влияния наночастиц железа, меди, цинка и сплава металлов [Fe Cu Zn] при их пероральном введении на углеводный, белковый и липидный обмены у лабораторных животных.
2) Провести сравнительный анализ действия исследуемых наночастиц железа, меди, цинка и сплава металлов [Fe Cu Zn], введенных перорально, на метаболизм у лабораторных животных.
3) Изучить безопасность перорального введения наночастиц железа, меди, цинка и сплава данных металлов путем оценки их цитогенетического эффекта и влияния на морфологию органов у лабораторных животных.
Научная новизна. Впервые исследовано влияние наночастиц железа, меди, цинка и сплава металлов [Fe Cu Zn] в концентрации 0,05-5,0 мг/кг при пероральном введении лабораторным животным для оценки безопасности применения наночастиц в качестве биологически активных добавок. Комплексное использование биохимических, цитогенетических и морфологических методов анализа позволило выявить негативное влияние наночастиц металлов при их пероральном введении на организм лабораторных животных.
Впервые проведен сравнительный анализ действия наночастиц металлов на изменение активности тканевых ферментов и на концентрацию метаболитов, характеризующих состояние белкового, липидного и углеводного обменов в сыворотке крови у лабораторных животных.
Установлено, что наночастицы железа в большей степени, чем другие исследуемые наночастицы, вовлекались в обмен углеводов и нарушали процессы утилизации глюкозы клетками. Введение наночастиц сплава металлов [Fe Cu Zn] в диапазоне концентраций 0,05-5,0 мг/кг оказывало выраженное биологическое действие на обмен белков.
В воздействии исследуемых наночастиц металлов на организм лабораторных животных отслежен дозозависимый эффект: влияние на протекание биохимических процессов максимально при введении наночастиц в концентрациях 1,25-2,5 мг/кг.
Выявлено, что введение наночастиц перорально вызывало увеличение активности тканевых ферментов в сыворотке крови, что свидетельствует о цитолитическом действии металлов. Полученные данные характеризовали действие наночастицы исследуемых металлов как токсическое в отношении органов и тканей.
Установленные с помощью биохимических методов изменения активности тканевых ферментов под влиянием наночастиц железа, меди, цинка и сплава металлов [Fe Cu Zn] подтверждены изменениями морфологии органов белых мышей. Впервые показано, что основными органами-мишенями для токсического действия наночастиц железа, меди, цинка и сплава металлов [Fe Cu Zn] при их попадании в организм перорально являлись печень и почки, что обусловлено участием данных органов в процессе детоксикации и выведении ксенобиотиков. Выявлен цитогенетический эффект воздействия данных наночастиц металлов на организм лабораторных животных.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Влияние наночастиц железа, меди, цинка и сплава металлов [Fe Cu Zn] на клеточный метаболизм у лабораторных животных определяется видом наночастиц и имеет дозозависимый эффект.
-
Введение наночастиц железа, меди, цинка и сплава [Fe Cu Zn] в концентрации 0,05-5,0 мг/кг лабораторным животным перорально оказывает влияние на обменные процессы, характеризующееся нарушением метаболизма глюкозы по аэробному пути и накоплению в крови животных пировиноградной кислоты (ПВК) и лактата и усилением процессов распада белков.
-
Наночастицы железа, меди, цинка и сплава [Fe Cu Zn] оказывают цитолитическое действие на органы лабораторных животных, проявляющееся в увеличении активности клеточных ферментов в сыворотке крови: креатинфосфокиназы (КФК), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), аланинаминотрансферазы (АлАТ), гаммаглутамилтрансферазы (ГГТ).
-
Введение наночастиц железа, меди, цинка и сплава [Fe Cu Zn] лабораторным животным способствует развитию патологических процессов в печени и почках и появлению клеток с микроядрами.
Научно-практическая значимость. Проведенные биохимические исследования позволяют существенно расширить представления о влиянии наночастиц металлов: железа, меди, цинка и сплава [Fe Cu Zn], введенных per os, на обменные процессы (углеводный, липидный и белковый), протекающие в организме лабораторных животных и создают предпосылки для дальнейшего изучения их механизма действия на организм человека. Установлено, что действие наночастиц на организм определяется их качественным составом: наночастицы железа оказывали влияние на углеводный обмен, наночастицы сплава металлов [Fe Cu Zn] – на обмен белков.
Полученные данные могут быть использованы для оценки адекватности лечения при отравлении данными металлами и дальнейшего создания антидотов.
Выявлены дозозависимые эффекты воздействия наночастиц исследуемых металлов, которые дают возможность определять меры предосторожности при работе с данными частицами. Комплексными исследованиями активности клеточных ферментов, являющихся индикаторами цитолиза, и морфологии органов лабораторных животных установлены токсические аспекты действия наночастиц железа, меди, цинка и сплава данных металлов в отношении печени и почек. Полученные данные представляют интерес для оценки развития возможных патологий при применении наночастиц металлов, в частности, железа, меди, цинка, в качестве пищевых добавок и лекарственных средств, а также позволят разработать методы профилактики при отравлении данными наночастицами.
Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе на кафедре биохимии ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Миндравсоцразвития России.
Апробация результатов исследования. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на международной научно-практической конференции «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» (Ростов-на-Дону, 2007 г.); научно-практической конференции студентов и молодых ученых Саратовского Государственного Медицинского Университета с международным участием: «Молодые ученые - здравоохранению региона» (Саратов, 2008, 2009, 2010, 2011 гг.); VII межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2008 г.); VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ и II Всемирном форуме по астме и респираторной аллергии (Санкт-Петербург, 2009 г.); всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009 г); всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии 2009» (Москва, 2009 г.); межрегиональной научно-практической конференции «Инновации в медицинском образовании и науке» (Саратов, 2010 г.); всероссийском молодежном форуме «Инновационное творчество» (Селигер, 2010 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 работы, 4 из которых изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Общий объем публикаций составил 2,96 п.л., личный вклад в работу - 75 %.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 175 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка использованной литературы, включающего 101 отечественный источник и 59 иностранных. Результаты исследования представлены в 8 таблицах. Работа иллюстрирована 74 рисунками.
Биологическая роль меди
Нанотехнологии представляют собой направление в науке и технологиях, активно развивающееся в последние десятилетия. Объектами для изучения в нанотехнологиях являются материалы размером, не превышающем значения 100 нанометров, к которым относятся нанотрубки, нанокомпозиты, фуллерены, ультрадисперсные порошки, мицеллярные системы и микроэмульсии, липосомы, биомембраны (Медведева Н.В., 2006; Олейников В.А., 2007; Huang S.S., 2001; Lai Y.L., 2003).
Переход от микроразмерных величин к наноразмерным является более не количественным, а качественным; это переход от манипуляции веществом к манипуляции отдельными атомами и молекулами. Сверхмалый размер наночастиц придает им новые физико-химические свойства и функции, существенно отличающиеся от тех, которыми обладают составляющие их молекулы и атомы веществ в частицах большего размера (Warren C.W., 2006).
Применение нанотехнологии и наноматериалов открывает новые возможности перед биологией и медициной.
Использование нанотехнологии в биологии легло в основу создания отдельной отрасли - нанобиотехнологии,одним из приоритетных направлений которой является использование нанопорошков металлов в качестве биодобавок к корму для решения проблем ветеринарии и сельского хозяйства, связанных с необходимостью применения микроэлементов (Арсентьева И.П., 2007). К настоящему времени доказана возможность введения металлов в виде наночастиц в организм, имеются разработки по подготовке металлов для введения в организм, изучены ключевые регуляторные биосистемы. Интерес к биологическим приложениям применения наночастиц определил ряд наиболее перспективных направлений изучения нанопорошков, например, для моделирования экологического прессинга металлов на организм (Глущенко Н.Н., 2002; Коваленко Л.В., 2006). Использованию нанопорошков металлов в сельском хозяйстве посвящен ряд работ (Давронов К.С., 2008; Егоров Н.П., 2008; Коваленко Л.В., 2001; Павлов Г.В., 2002). Установлена высокая физиологическая активность нанопорошков металлов, что может характеризовать их как экологически чистые биологически активные препараты (Федоров Ю.И., 1983; Бурлакова Е.Б., 1979). Изучено действие нанопорошков биогенных металлов, в частности железа, меди и цинка, на целый ряд показателей: всхожесть семян, урожайность, устойчивость растений к болезням и некоторые другие физиолого - биохимические процессы (Давронов К.С., 2004; Кучкаров К.К., 2004; Павлов Г.В., 2002; Тухтабаева Ф.М., 2006; Павлов Г.В, 2003).
Интерес использования наночастиц металлов в животноводстве основан на оптимизации кормления животных и повышении коэффициента полезного действия кормов. Ряд исследований показал возможность применения наночастиц металлов в животноводстве как недорогих и нетоксичных препаратов, улучшающих состояние животных и позволяющих в значительной мере увеличить живую массу крупного рогатого скота (Глущенко Н.Н., 1988).
К настоящему времени установлено, что влияние порошков, состоящих из наночастиц металлов, на биологические объекты (микроорганизмы, растения, животные) существенно может отличаться от действия на те же объекты солей металлов, действие которых в низких концентрациях малоэффективно и кратковременно, а в высоких - токсично (Коваленко Л.В., 2001).
Медицинские приложения использования нанотехнологий привели к созданию отрасли науки - наномедицине, которая эффективно развивается в последния десятилетия (Каплун А.П., 2007). В области медицины возможности нанотехнологий направлены на управление с помощью наноматериалов и наночастиц физическими, химическими и биологическими процессами, протекающих в живых организмах на молекулярном уровне (Yu С.-Н., 2008). В настоящее время на основе нанотехнологий проектируются и внедряются в практику наноустройства, позволяющие выполнять все необходимые операции от диагностики и мониторинга до уничтожения патогенных микроорганизмов, восстановления поврежденных органов, снабжения организма необходимыми веществами (Freitas R.A., 2005, 2006).
Основные направления развития нанотехнологий в медицине представлены нанопротеомикой, созданием биосенсорных нанодиагностикумов, разработкой нанопор для регистрации единичных олигонуклеотидов и секвенирования генома (Барачевский В.А., 2007). Наночастицы можно использовать в качестве лекарственных средств и как контейнеры для доставки лекарств (Иванов Ю.Д., 2007). Возможно использование нанотехнологий в регенеративной медицине, например, в тканевой инженерии (Aslam М., 2005; Kang Н., 2008).
Большое внимание в последнее время уделяется использованию магнитоуправляемых частиц в данных областях наномедицины (Брусенцов Н.А., 2008; Звездина Н.Д., 2007; Aslam М., 2005).
В биологии и медицине применяемые наночастицы, как правило, состоят из ферромагнитного или парамагнитного ядра и имеют калиброванные контролируемые размеры от нескольких нанометров до нескольких микрон, обычно с небольшим разбросом по диаметру. Достижения в области нанотехнологий позволяют синтезировать наночастицы из разнообразных материалов с заданными свойствами, оптимальными для решения конкретных задач (Звездина Н.Д., 2007).
Наночастицы с магнитными свойствами в области биологии и медицины успешно применяют на практике: их используют при создании различных биосенсоров для диагностики заболеваний (особенно онкологических), для клеточного сортинга, основанного на иммуномагнитной сепарации клеток, для выделения и очистки биологически активных веществ из сложных смесей, для адресной доставки лекарств в область патологии, для локальной магнитной гипертермии при лечении злокачественных опухолей (Звездина Н.Д., 2007; Хлебцов Н.Г., 2007).
Все применяемые методы использования магнитоуправляемых наночастиц основаны на общем принципе, основные моменты которого можно представить следующим образом. Поверхность наночастицы химически связывают с биологически активным компонентом, имеющим высокоспецифическое сродство к определенным биологическим объектам -мишеням, что обеспечивает способность конъюгировать между собой мишень и наночастицу. Магнитные свойства частиц в образовавшихся конъюгатах делают последние магнитоуправляемыми; тот же принцип положен в основу выделения клеточных органелл, белков, нуклеиновых кислот. Таким образом, магнитные наночастицы могут одновременно маркировать биологические молекулы и являться их переносчиками (Андреев В.Г., 2008; Звездина Н.Д., 2007; Pankhurst Q.A., 2003).
Наночастицы можно модифицировать: создать из них комплексы-кластеры, возможно, окружив их защитным слоем из полиакриламида, или создать смешанные наночастицы, где металлические ядра непосредственно окружены самособирающимся молекулярным монослоем. Наночастицы, модифицированные таким способом, являются многообещающими материалами для создания биомакромолекулярных рецепторов. Монослои могут создаваться из множества металлических и полупроводниковых материалов, сплавов и оксидов. Введение органических лигандов позволяет предотвратить явления агрегации и агломерации наночастиц и расширяет возможности их использования. Кроме того, органические лиганды, вероятно, могут наделить наночастицы существенными способностями к распознаванию, транспортировке и катализу (Хлебцов Н.Г., 2007).
Наночастицы, в которых ядро представлено металлом, не только создают платформу для закрепления на их поверхности организованных органических слоев с биологическими свойствами, но также проявляют свои собственные поверхностные свойства. Уникальные физические свойства могут придавать другие свойства материалам: оптические свойства наночастиц золота и серебра за счет поверхностного плазмонного резонанса, магнитная активность частиц металлов и оксидов (Хлебцов Н.Г., 2007).
Проведение экспериментальной работы
После извлечения органов (легких, печени, почек, селезенки) от них отрезались кусочки площадью 25 мм , толщиной 5-7 мм, которые помещались в марлевые мешочки и погружались в фиксатор (10% формалин) на 24 часа (Микроскопическая техника, 1996).
После проведения фиксации производится обезвоживание и заливка в парафин по схеме Волковой - Елецкого.
Обезвоживание: спирт 50% - 2ч, спирт 60% - 2ч, спирт 70% - 12ч, спирт 96% в два приема по 12ч, спирт 100% - в два приема по 12ч.
Заливка в парафин: смесь спирта 100% и хлороформа в соотношении 1:1 - 2ч, трехразовая заливка хлороформом (первая заливка на 1,5 ч, вторая и третья - по 0,5 ч), смесь хлороформа и формалина в соотношении 1:1, нагретая до +37С - 3 ч, смесь хлороформа и формалина в соотношении 1:1, нагретая до +56С - 0,5 ч, трехразовая заливка парафином, нагретым до +56С (первые две заливки по 2 ч, третья - на 1 ч).
Далее производятся срезы с использованием микротома и последующая окраска полученных срезов гематоксилином и эозином по стандартной методике. Срезы промываются дистиллированной водой, затем выдерживаются в растворе гематоксилина в течение 10-20 минут, промываются в дистиллированной воде, проводится дифференцировка солянокислым спиртом, затем обрабатываются аммиачной водой, при этом срезы синеют (контроль под микроскопом), промываются в проточной воде в течение 10 минут, споласкиваются дистиллированной водой, выдерживаются в растворе эозина в течение 1-3 минут, обрабатываются 96% спиртом.
Для исследования мутагенного воздействия нанопорошков металлов на организм животных использовался микроядерный тест, методика проведения которого складывается из двух этапов: приготовление клеточных суспензий и анализ полученного материала с подсчетом микроядер.
Получение клеточных суспензий проводилось по «прямому» методу (Карпищенко А.И., 1999). Для этого свежий, отмытый от крови материал (кусочки органов весом 1-5 мг) незамедлительно перенесят в пенициллиновые флаконы с 5 мл 0,9% трехзамещенного безводного цитрата натрия и колхицином в конечной концентрации 2,5 мкг/мл.
Гипотоническую обработку проводить при комнатной температуре 40-50 минут или при температуре +37С 35-40 минут. Затем 2-3 мл гипотонического раствора удаляют пипеткой. Во флакон порциями добавить примерно такой же объем холодного свежеприготовленного фиксатора (смесь метанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1). Первую порцию фиксатора добавить по каплям, встряхивая флакон, затем струйно.
Префиксацию проводят при комнатной температуре 45-90 минут. Весь префиксирующий раствор удаляют, во флакон с кусочками органов наливают 4-5 мл холодного (+4С) фиксатора. Фиксацию проводят 1-2 часа при 0-10С. В чистый пенициллиновый флакон наливают 3-4 мл свежего фиксатора, помещают в него кусочек органа и добавляют равный объем дистиллированной воды. Через 2-5 минут, когда кусочек органа опустится на дно, вынимают его пинцетом, обсушивают фильтровальной бумагой и переносят на чистое обезжиренное предметное стекло, подогретое над пламенем спиртовки примерно до +45-50С, в каплю (0,3 - 0,5 мл) 60% уксусной кислоты. Мацерацию проводят под контролем бинокулярной лупы, наблюдая за выходом клеток в проходящем свете затемненного поля и передвигая кусочек по стеклу препаровальной иглой. Через 2-3 минуты кусочек органа переносят на следующее предметное стекло в каплю уксусной кислоты, а полученную на первом стекле суспензию клеток покачиванием стекла распределяют по поверхности.
Избыток суспензии переносят на следующий препарат. На препарат наносят 2 — 3 капли фиксатора и высушивают над пламенем горелки или поджиганием фиксатора.
Затем производят окраску препаратов по методу Романовского - Гимзе (Саркисов Д.С., 1996). Готовый жидкий краситель перед окрашиванием препаратов разводят из расчета 1 - 2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Препараты окрашивают 10-15 минут при +37С во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажненным фильтром на дне). После окрашивания препараты промывают в проточной воде и сушат.
Пригодными для анализа считались препараты с хорошо расправленными клетками (Буторина А.К., 2002). К микроядрам относили округлые образования с ровными краями, размерами 1/20 - 1/5 диаметра ядра клетки и окраской, соответствующей окраске основного ядра. Микроядра находились на расстоянии не более двух диаметров от ядра.
При подсчете микроядер учитывалось отношение их количества к общему числу ядросодержащих клеток-1000. Формула для расчета частоты микроядер:
Частота встречаемости клеток с микроядрами= (число клеток с микроядрами/общее число проанализированных клеток) 100%. Все полученные в процессе работы данные были подвергнуты статистической обработке с использованием пакета программ Statisticav7.0.61.0. Статистическая обработка данных включала расчет следующих параметров: М- средняя арифметическая, m - ошибка средней арифметической, а — среднее квадратичное отклонение. О достоверности отличий учитываемых показателей контрольной и опытной групп судили по величине t - критерия Стъюдента и р - условной вероятности. При р 0,05 различия считались статистически значимыми.
Изменение биохимических показателей сыворотки крови у мышей под влиянием наночастиц железа
В ходе экспериментального исследования было проанализирована активность КФК (Рис. 14).
Во всех экспериментальных группах происходило увеличение активности КФК: на 92%- при дозировке наночастиц 0,05 мг/кг, на 87%- при концентрации наночастиц 1,25 мг/кг, на 98%- при дозировке наночастиц 2,5 мг/кг, на 99%- при концентрации наночастиц 5,0 мг/кг.
Проведенный биохимический анализ сыворотки крови позволил оценить действие наночастиц меди на обменные процессы у лабораторных животных.
Наночастицы меди в диапазоне концентраций 0,05-5,0 мг/кг оказывают выраженное действие на обменные процессы, при этом наиболее подвержен влиянию наночастиц обмен белков, что проявляется в увеличении концентрации общего белка за счет глобулиновых фракций (возможно, развиваются воспалительные процессы) на фоне снижения уровня альбуминов, происходит увеличение концентрации креатинина вследствие распада белков и снижение синтеза мочевины вследствие возможного повреждающего действия частиц на гепатоциты.
Выявленные существенные дозозависимые изменения показателей индикаторных ферментов у белых беспородных мышей при пероральном введении нанопорошка меди также свидетельствует о токсическом действии наночастиц по отношению к печеночным клеткам, что подтверждается увеличением активности в крови клеточных ферментов (аминотрансфераз, ГГТ, ЛДГ).
Было выявлено, что наночастицы меди оказывают повреждающее действие на поджелудочную железу и желчные протоки, о чем свидетельствуют изменения активности амилазы и ЩФ, а также выявленные изменения в морфологии поджелудочной железы.
Наиболее выраженным действием на обменные процессы из исследуемых концентраций наночастиц меди обладают наночастицы в концентрации 1,25-2,5 мг/кг, что вероятно, обусловлено их большей доступностью для клеток по сравнению с другими дозировками.
Вероятно самых малых концентраций (0,05 мг/кг) недостаточно для проявления выраженного эффекта, а высокие дозы частиц (5,0 мг/кг) приводят к частичному слипанию частиц в конгломераты, что снижает их проницаемость в клетки.
Цитолитическое действие, установленное для наночастиц меди, наблюдается и при введении наночастиц цинка, но проявляется в меньшей мере, что может характеризовать наночастицы цинка как менее токсичные для организма при пероральном способе введения.
Кроме того, наночастицы цинка по сравнению с другими исследуемыми наночастицами в меньшей мере оказывают влияние на обменные процессы, что подтверждается результатами биохимического анализа, описанного далее.
Биохимические аспекты действия различных концентраций наночастиц цинка на организм самцов включали изучение изменений биохимических критериев сыворотки крови, отражающих состояние углеводного, липидного, белкового обменов, а также изучение активности ряда ферментов. Полученные результаты после статистической обработки приведены в таблице 3. Таблица 3. Изменение биохимических показателей сыворотки крови под влиянием наночастиц цинка исследуемая группа контроль цинк концентрация наночастиц 0,05 мг/кг 1,25 мг/кг 2,5 мг/кг 5,0 мг/кг биохимический показатель M±m M±m Р М±т Р М±т Р М±т Р глюкоза, ммоль/л 7,12±0,76 5,94±0,27 0.05 12,01±1.15 0,001 12,05±0,70 0,001 16,40±0.40 0,001 лактат, ммоль/л 22.87±1,62 8.22±0,31 0.001 8.74±0,29 0.001 14.52±0.32 0,001 9,73 0,74 0,001 ПВК, ммоль/л 0,1 1±0,01 0,20±0,01 0.001 0,74±0,01 0,001 0.05±0.01 0,001 1,01 ±0.03 0,001 общий белок, г/л И7.74± 12,00 132,71±5,75 0.05 262,53± 11,25 0.001 286,16±8,45 0,001 300,65±7.34 0,001 альбумин, г/л 58.08±0.27 59,60±0,96 0,05 61,70±1,26 0.05 61,00±1.22 0,05 59,10 1,13 0.05 мочевина, ммоль/л 3,53±0,06 3.13±0,27 0,05 4,66±0,27 0,001 4,23±0,48 0.05 6,41 ±0,11 0.001 креатинин, мкмоль/л 165.30±13.82 173.50±4,22 0,05 188,50±1,95 0.05 144,00±4,64 0,05 156.00±6,21 0.05 холестерин, ммоль/л 4,08±0,35 5,20±0,48 0.05 3,48±О,03 0,05 5.95±0.30 0,001 4,99 0,39 0,05 общий билирубин, мг/дл 1,65±0.02 1,16±0,01 0,001 3,13 0,01 0,001 3,30±0,03 0,001 3,67±0.04 O.00I прямой билирубин,мг/дл 0.63±0.01 0.07±0,01 0,001 0,37±0,01 0.001 0,37±0,01 0,001 1,51 ±0,02 0,001 непрямой билирубин.мг/дл 1.02±0.02 1.10±0,01 0,01 2,78±0,01 0,001 2,91 ±0,03 0,001 2,16±0,04 0.001 Ac AT. ME 120,00±9,25 138.90±8,46 0,05 153.00±8.71 0,05 129.40±4,29 0,05 155,60±9.24 0.05 Ал AT, ME 50,00±2,06 70,90±4,18 0.001 54.80±2.17 0.05 122,00±4,42 0,001 69.00±6,74 0.05 ЛДГ, MP. 2025,00±53.28 1935,40±72.77 0,05 2113,30±137,03 0,05 2259,90± 124,62 0,05 2025,40± 148.06 0,05 ГГТ, ME 103.22± 16.66 132,00±3.59 0,05 129.50±4.68 0.05 140,00±3,25 0,05 159,50±3.02 0,01 ЩФ. ME 3%.00±2,!8 280.20±5,12 0,001 206.50±3,71 О.001 164,00 0,76 0,001 284,20±0,85 о,оо1 КФК. ME 1290,00±60,88 1200,40±48,46 0,05 3498.80±42.70 0,001 3653,90± 10,84 0,001 2803,40±79,95 О.001 Амилаза, ME 444,00±7,20 121.90±4,96 0.001 119,10 6,10 0.001 139.10±7,70 0,001 152.50±5,56 О.001 Примечание, р- уровень вероятности различий в сравнении с контролем. Изучение влияния наночастиц цинка на углеводный обмен оценивалось по трем основным метаболитам: глюкоза, ПВК и лактат (Рис. 15).
В контрольной группе концентрация глюкозы составила 7,12±0,76 ммоль/л. Введение наночастиц цинка в дозировке 0,05/кг существенных сдвигов концентрации глюкозы не вызвало и значение данного показателя колебалось в пределах нормы. Дальнейшее увеличение доз частиц вызывает увеличение уровня глюкозы прямо пропорционально концентрации наночастиц: на 69%- при введении 1,25 мг/кг, на 70% - при ведении 2,5 мг/кг и на 130%- при введении максимальной дозы - 5,0 мг/кг. Гипергликемия, не сопровождающаяся поступлением глюкозы в клетку, вероятно, может способствовать активации компенсаторных механизмов и запускает процессы глюконеогенеза - синтеза глюкозы из лактата. Концентрация молочной кислоты у животных, которым перорально вводились наночастицы цинка, снижена по сравнению с контролем (22,87±1,62 ммоль/л): в 2,7 раза при введении наночастиц цинка в дозировках 0,05 - 1,25 мг/кг, в 1,5 раза - при ведении дозы 2,5 мг/кг и в 2,4 раза - при введении дозы 5,0 мг/кг. Содержание ПВК в сыворотки крови под влиянием цинковых наночастиц цинка увеличивается в 2 - 7 раз при введении низких концентраций частиц: 0,05 мг/кг и 1,25 мг/кг соответственно, и возрастает в 10 раз при введении самой большой концентрации - 5,0 мг/кг. Влияние цинковых нанопорошков в различных концентрациях на белковый обмен оценивалось по основным показателям: общий белок и альбумин и по конечным продуктам обмена белков: мочевина и креатинин
Влияние перорального введения нанопорошка цинка на морфологические параметры органов мышей
Быстрое развитие отрасли нанотехнологии приводит к тому, что наночастицы широко распространяются в окружающей среде и попадают в организм при дыхании, с пищей, через кожу и при внутривенном введении.
Наночастицы могут обладать и более высокой токсичностью по сравнению с обычными микрочастицами, поскольку способны проникать в неизмененном виде через клеточные барьеры, циркулировать и накапливаться в органах и тканях, вызывая более выраженные патоморфологические поражения внутренних органов, а также обладают длительным периодом полувыведения.
Токсичность наночастиц определяется их формой и размерами, при воздействии на организм отчетливо прослеживается связь «доза-эффект».
Серия экспериментов по изучению влияния наночастиц железа в различной концентрации на организм лабораторных животных выявила, что биологическое действие железных частиц проявляется преимущественно в токсическом действии на органы. У животных, находившихся под влиянием наночастиц железа, проявлялись вялость, снижение аппетита, выпадение шерсти, изредка наблюдался тремор. Гистологический анализ срезов органов подопытных животных выявил значимые изменения по сравнению с органами животных, которые не подвергались действию наночастиц.
Оценка состояния печени при введении железных частиц в концентрации 0,05 мг/кг выявила незначительные отклонения от нормы. Дольчатое строение печени сохранено, балки сохранены. Центральные вены расширены, наблюдается умеренное полнокровие. В цитоплазме нескольких гепатоцитов видны скопления частиц металла в виде черно-зелено-коричневой пылевидной зернистости. В контрольной группе животных явления нарушения балочного строения печени, развития дистрофии и полнокровия не выявлено.
При увеличении дозы частиц железа до концентрации 1,25 мг/кг дольчатое строение печени сохраняется, печеночные балки тоже сохранены, желчные капилляры не изменены (Рис. 28). Отмечается зернистая дистрофия гепатоцитов. В цитоплазме гепатоцитов и их ядрах видны скопления частиц железа.
Характер изменений в печени при введении больших доз нанопорошка одинаков и проявляется в следующих изменениях (Рис. 29). Дольчатость строения сохранена, печеночные балки сохранены.
Центральные вены расширены, запустевшие или полнокровны, местами их контуры размыты. В части сосудов отмечается сепарация крови и скопления частиц железа. В просвете крупных сосудов имеются гемолизированные эритроциты, полнокровие наблюдается только в крупных сосудах.
Гепатоциты с множественными гипертрофированными ядрами, в которых хроматин расположен в виде глыбок, в области портальных трактов видны очаговые клеточные инфильтраты, представленные скоплением лимфоцитов и единичных лейкоцитов.
В отдельных полях зрения обращает внимание большое количество клеток Купфера. В отдельных полях зрения видны скопления наночастиц: часть в клетках Купфера, а часть в цитоплазме.
Общий характер изменений в морфологии печени у животных под воздействием наночастиц железа в различных концентрациях заключается развитии деструктивных явлений, что выражается в полнокровии, появлении клеток Купфера и дистрофии гепатоцитов, при этом интенсивность воздействия напрямую увеличивается при увеличении концентрации частиц.
Присутствие скоплений железных частиц в гепатоцитах отмечается для всех концентраций вводимых наночастиц.
Значимые изменения отмечены и при изучении гистологических срезов почек. В контрольной группе животных атологических изменений морфологии почек не выявлено: отсутствуют явления дистрофии и полнокровия, не выявлены спадения или расширения клубочков.
Введение животным суспензий наночастиц железа в концентрации 0,05 мг/кг вызывает умеренное полнокровие органа. В срезах почек видны очаговые скопления клеток плоского эпителия, капиллярные петли в клубочках расширены, занимают почти весь клубочек.
В крупных сосудах наблюдаются агрегированные эритроциты и скопления частиц железа (Рис. 30). Рис. 30. Морфология клеток почек под влиянием наночастиц железа в концентрации 0,05 мг/кг (а) в сравнении с контролем (б). Увеличение дозы вводимых частиц до концентрации 1,25 мг/кг вызывает схожие изменения: имеются очаговые скопления клеток плоского эпителия. В клубочках капилляр петли расширены, полнокровны. Наблюдается выраженное полнокровие крупных сосудов. В клетках почек и в крови присутствие скопления частиц железа. Введение животным железных частиц в концентрации 2,5 мг/кг вызывает более сильное повреждающее действие: клубочки неодинаковые - в части капиллярные петли расширены, полнокровны, занимают почти весь клубочек, просвет капсулы сужен, другие умеренно спавшиеся. Полнокровие крупных сосудов сильно выражено. Цитоплазма эпителия половины извитых канальцев бледная, гомогенная, не прокрашенная эозином, в этих участках отмечается значительное количество металлических гранул; в остальных извитых канальцах отмечается резкая дистрофия и наличие скоплений наночастиц железа.
