Введение к работе
Актуальность темы. Флуоресцентный лантанидный иммуноанализ традиционно используется для определения гормонального статуса и занимает прочное место среди других методов (РИА, ИФА). Он базируется на принципе времяразрешенной микросекундной спектроскопии, в связи с чем, получил название «флуоресцентного иммуноанализа с временным разрешением» (ФИАВР). Европиевые метки обеспечивают большую, по сравнению с ферментативными метками, точность и чувствительность. В отличие от радиоизотопных меток, они безопасны для человека и окружающей среды.
Моноклональные антитела, благодаря таким их свойствам, как химическая гомогенность, высокая аффинность, эффективно используются в клинико- лабораторной диагностике, в том числе и в ФИАВР, для определения гормонов в сыворотке крови, в сухих пятнах крови.
Тироксин - гормон щитовидной железы - отвечает за многие обменные процессы в организме. Нарушение его обмена приводит к серьезным заболеваниям. Так, врожденный гипотиреоз у детей ведет к развитию умственной отсталости - кретинизму. Для своевременной диагностики и лечения врожденного гипотиреоза во многих странах введены программы неонатального скрининга, в связи с чем, представляет интерес разработка отечественных наборов для скрининга.
Наиболее современными направлениями в области разработки биоаналитических систем являются миниатюризация формата и мультианалитные исследования с выходом на высокоэффективный скрининг. В связи с этим развитие флуоресцентного анализа в настоящее время происходит в основном в следующих направлениях: поиск новых способов (технологий) проведения иммунохимических реакций и разделения их компонентов, разработка новых методов детекции и обработки флуоресцентного сигнала, поиск новых высокочувствительных маркеров, в том числе на основе лантанидных хелатов и наночастиц. Поэтому актуальны разработка
иммуноанализа для определения тироксина и изучение возможности использования новых европиевых меток для этих целей.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - разработка лантанидного иммунофлуоресцентного анализа для определения гормона тироксина с использованием моноклональных антител к тироксину и европиевых меток, сопоставление разных меток в выбранной схеме иммуноанализа.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: о получить моноклональные антитела к тироксину с высокой степенью аффинности и специфичности, охарактеризовать полученные мАт; а выбрать наиболее чувствительную схему диссоциативного лантанидного иммуноанализа для определения общего тироксина (Т4) в сухих пятнах крови; а изучить свойства новой флуоресцентной метки (конъюгата N-гадроксисукцинимидного эфира диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ДТПА) и аминобензоилтритфторацетона (АБТФА)) и разработать недиссоциативный метод анализа с ее использованием для определения Т4; а разработать недиссоциативный метод анализа тироксина с использованием латексных наночастиц, содержащих европий - Р-дикетонатный комплекс.
Научная новизна. Разработан трифункциональный хелат, по чувствительности не уступающий бифункциональным хелатам, используемым в диссоциативных схемах. Разработаны методы получения коньюгатов с новой флуоресцентной меткой на основе N-гидроксисукцинимидного эфира ДТПА и АБТФА и изучены их флуоресцентные свойства. Впервые продемонстрировано использование латексных наночастиц, содержащих европий, в конкурентных схемах иммуноанализа.
Практическая значимость работы. Разработан диссоциативный флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением для определения общего тироксина в сухих пятнах крови для целей неонатального скрининга. Разработаны методы недиссоциативного ФИАВР с использованием новой флуоресцентной метки (конъюгата N-гидроксисукцинимидного эфира ДТІІА и
АБТФА) и латексных европиевых наночастиц. Показано использование новой высокочувствительной недиссоциативной европиевой метки (конъюгата N-гидроксисукцинимидного эфира ДТПА и АБТФА) и европиевых наночастиц для определения тироксина с целью повышения предела детекции его в анализе.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на следующих конференциях: Российская школа-конференция молодых ученых «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 28 мая-2 июня 2000г.), I Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 14-18 октября 2002г.) , III Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 14-18 марта 2005г.).
В 2002 году автору было присуждено III место в ежегодном Конкурсе на лучшую научную работу Института биохимии им. А.Н.Баха.
Часть результатов, полученных в ходе работы, была применена в 2000-2001г.г. при выполнении межведомственной научно-технической программы «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего» по договору № 02.03.118 "Разработка иммунофлуоресцентных методов с временным разрешением для определения гормона тироксина".
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в ведущих российских журналах, 2 статьи в российском и иностранном сборниках, 3 тезиса в материалах международных и российских научных конференций.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 246 ссылок. Работа изложена на 168 страницах, содержит 31 рисунок и 10 таблиц.
