Введение к работе
Актуальность проблемы.
Интенсивнее развитие исследований в области иммунодиагностики как в напей стране так и за рубежом стимулирует быстрое развитие научных разработок и стремление к скорейшему переходу от лабораторных моделей к промышленному или полупромышленному производству диагностических тест-систем, изготовленных в форме готовых к использовании наборов. Возможность такого перехода является серьезным стимулом к исследованию и разработке новых материалов, методов, реагентов, способных существенно увеличить чувствительность, специфичность, стабильность, скорость и производительность, простоту создаваемых систем анализа, экономичность их производства.
Стремление к повышению чувствительности иммуноанализа. осуществляемого в варианте количественного учета результатов, определило стратегии, направленную на разработку нового прецизионного аппаратурного оснащения и, как следствие, услоянение и удорожание технологии производства систем количественного анализа и самой процедуры исследования. К таким катодам мозно отнести радиоиммунологический (РИА), иммуноферментный (ИФА) и ряд вариантов био- и хемилиминисцентных типов иммуноанализов. Все перечисленные методы обладают рядом положительных качеств: универсальностью, т.е. позволяют определять любое соединение, против которого возможно получение специфических антител, высокой специфичностью и чувствительностью. Однако, наряду с достоинствами, у названных методов есть существенные недостатки. В первую очередь - это зависимость от сложной и дорогостоящей регистрирукией аппаратуры и ограниченно доступных реагентов, используемых либо в технологии изготовления диагностикумов, либо непосредственно в процедуре анализа, опасность для здоровья, которую представляют введение изотопных меток, подготовка и выполнение РИА, а также использование токсичных и/или канцерогенных хромогенов в ИФА.
Наряду с этим, в последнее десятилетие укрепилась тенденция к создании новых, простых и доступных методов иммунохимических исследований, почти или полностью освобожденных от какой-либо аппаратурной и инструментальной зависимости. Эти методы, закрепившиеся в рабочей терминологии как "безинструментальные'', предназначены для быстрых, скрининговнх исследований любых количеств биологического материала в условиях малых клинических и зпидеии-
- 2 -ологичєских лабораторий, отделений переливания крови, а также полевых условиях и в домашней самодиагностике. Очевидно, чт простота техники проведения анализа и его экспрессность н должны уменьшать чувствительность и специфичность определения, этим связана базовые элементы стратегии в разработке методов им муноанализа, способных составить конкуренцию РИА и ИФА во все спектре их разнообразия. Все это определило стремление к подбор таких меток, которые, заменив собой изотопные и ферментные, об ладали бы рядом новых необходимых качеств - в первую очередь способностью непосредственно визуализировать происходящие стере оспецифические взаимодействия без дополнительной стадии обнару гения самих меток. Вместе с тем, такие метки доланы обладат способностью взаимодействовать с иммунореактивными соединениям с образованием прочных и стабильных конгюгатов. Применение по добных реагентов е системах иммуноанализа помогло бы решить одн из основных задач в конструировании иммунодиагностических сист ем, а именно, освободив от недостатков, имеющих место в совре менных системах иммуноанализа, сохранить и даяе усилить такие и. преимущества как чувствительность и специфичность, дополнив эт: преимущества новыми качествами: простотой, экспрессностью и, чт не менее важно, безопасностью самой процедуры определения.
Цель и задачи работы.
Цель исследования - разработка универсальной технологии по лучения реагентов для прямой визуализации связанных аналитов конструирование эффективных модельных систем безинструментально го иммуноанализа с использованием в качестве новых меток водоне растворимых красителей.
Основные задачи:
1,Подобрать соединения из ряда водонерастворимнх красителе: и исследовать возможность использования их суспензоидных фор: в качестве меток в реагентах для иммунодиагностических целей.
2,Разработать технологически схему и определить оптимальны условия синтеза конъигатов стереореактивных соединений с цветны ми метками.
3.Исследовать стабильность синтезированных реагентов и опре делить оптимальные условия их хранения.
4.Сконструировать ряд модельных систем иммуноанализа.
5.Провести сравнение сконструированных модельных иммунодиагностических систем с существующими по основным параметрам, характеризующим иммуноаналитические наборы: чувствительность, спе-
- з -ричность, стабильность, простота, экспрессность, экономичность готовления.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Впервые использованы частицы водонерастворииых красителей с :окой цветностьй в качестве меток детектирующих компонентов :т-систем, что обеспечило увеличение чувствительности определяя различных аналитов.
Впервые разработана двухэтапная схема ковалентного конъюги-зания аффинных реагентов с цветными метками с использованием утаральдегидной активации пептизированных частиц красителей.
Использование разработанной технологии привело к получению агностических реагентов, которые стабильны при длительном храпни .
Сконструированная модель тест-системы для определения анти-п к ВИЧ-І и ВИЧ-2 продемонстрировала высокую чувствительность :пецифичность анализа при проверке ее работы в официальных папах сывороток, содержащих и не содержащих антитела к ВИЧ—1 ]Ка им.Л.н.Тарасезича.
Сконструированные модельные системы определения хорионическ-з гонадотропина человека, антител к ВИЧ—1 и ВИЧ-2, ДНК фага иода позволили значительно упростить и ускорить процедуру зтветствующих инмунохимических и генно-аналитических исследо-
ГІИЙ.
Основные положения, выносимые на защиту.
Подобранные красители из групп суданов и формазанов и сус-язоидного углерода обладают высокой цветностьй и могут быть лользованы для получения на их основе высокоактивных цветных спензоидных конъюгатоз.
Разработанная универсальная технология ковалентного яъигирования аффинных соединений с суспензоидными частицами ^нерастворимых красителей позволяет получать реагенты, стальные при хранении в течение, как минимум, одного года в диа-зоне температур от +4С до + 22С.
Использование полученных реагентов в модельных системах я безинструментального определения антител к ВИЧ—і и ВИЧ-2, рионического гонадотропина человека и ДНК фага лямбда приводит существенному увеличению чувствительности, специфичности, ста-льности, экспрессности и простоты анализов.
По материалам работы подана патентная заявка с датой приори-га 30 декабря І993 года.
Апробация работы.
Основные положения работы доложены на LXII сессии АМН СССР по проблемам СПИДа в і991 годи и на I Международном симпозиуме "Проблеми токсикологии и охраны окружающей среды" в 1991 годц.
Публикации.
По теме диссертации опубликованы три научные работы.
Объем и структура работы.
Диссертация состоит из введения, первой част;:, состоящей из дбу;: глав, второй части, третьей части, состоящей из 2 глав, заключения, выводов и списка литературы. Материалы изложены на і ОБ страницах машинописного текста, включая 5 таблиц и 12 рисунков. Список литературы содервит 183 наименования работ: 34 на русском и 149 на иностранном языках.