Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Открытие мембранного рецептора цитокининов 10
1.1.1 Бикомпонентная регуляторная система 11
1.1.2. Обнаружение и характеристика генов Л rabidopsis, кодирующих сенсорные гистидиновые киназы, участвующие в передаче цитокининового сигнала 14
1.1.3. Другие белки бикомпонентной регуляторной системы, задействованные в передаче цитокининового сигнала 18
1.1.3.1. Характеристика белков - регуляторов ответа А-типа 20
1.1.3.2. Характеристика белков - регуляторов ответа В-типа 21
1.1.3.3. Обнаружение и характеристика фосфотрансмиттерных белков 24
1.1.4. Обобщение данных о передаче цитокининового сигнала через мембранный рецептор 25
1.2. Цитоплазматические и ядерные цитокинин-связывающие белки 27
1.3. Обнаружение и характеристика цитокинин-связывающих белков в хлоропластах 29
1.4. Множественность путей реализации цитокининовых сигналов в клетках растений 31
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований 34
2.1. Растительный материал 34
2.2. Моноклональные антитела против ЦСБ-70 34
2.3. Вьщеление моноклональных антител из асцитной жидкости мышей
2.4. Выделение моноклональных антител из культуральной среды 35
2.5. Биотинилирование МА 36
2.6. Фракционирование белкового экстракта из проростков кукурузы 36
2.7. Определение цитокинин-связывающей активности белков 37
2.8. Сэндвич-вариант твердофазного ИФА 37
2.9. Получение белковых экстрактов из различных частей проростка 38
2.10. Определение числа клеток 38
2.11. Определение содержания белка 38
2.12. Определение содержания эндогенных цитокининов 39
2.13. Выделение полирибосом 39
2.14. Синтез аффинного сорбента на основе МА и Sepharose CL-4B (Pharmacia) 40
2.15. Синтез аффинного сорбента на основе зеатинрибозида и Toyopearl HW-65 41
2.16. Аффинная хроматография полисом на колонке с иммобилизованными МА 41
2.17. Клонирование кДНК (1-й вариант) 42
2.18. Аффинная хроматография полисом на колонке с иммобилизованным зеатинрибозидом 43
2.19. Клонирование кДНК (2-й вариант) 43
2.20. Анализ библиотек кДНК методом иммуноскрининга на чашках 44
2.21. Анализ клеточных белков Е. coli методом иммуноблотинга 44
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 46
3.1. Моноклональные антитела к ЦСБ-70, их выделение и характеристика 46
3.2. Разработка тест-системы для анализа ЦСБ-70 на основе сендвич-варианта ИФА в сочетании с стрептавидин-биотиновой системой 50
3.3. Локализация ЦСБ-70 в меристеме и зоне растяжения корня 55
3.4. Локализация ЦСБ-70 в этиолированном проростке кукурузы 58
3.5. Динамика содержания ЦСБ-70 в различных органах проростка в процессе его роста 64
3.6. Использование моноклональных антител для выделения мРНК, конструирования и анализа библиотеки кДНК из проростков кукурузы... 67
Заключение 81
Выводы 84
Литература 86
- Обнаружение и характеристика генов Л rabidopsis, кодирующих сенсорные гистидиновые киназы, участвующие в передаче цитокининового сигнала
- Множественность путей реализации цитокининовых сигналов в клетках растений
- Синтез аффинного сорбента на основе МА и Sepharose CL-4B (Pharmacia)
- Моноклональные антитела к ЦСБ-70, их выделение и характеристика
Обнаружение и характеристика генов Л rabidopsis, кодирующих сенсорные гистидиновые киназы, участвующие в передаче цитокининового сигнала
Экспериментальные данные, свидетельствующие в пользу того, что действие цитокининов связано с гистидинкиназой, были получены в результате проведения скрининга на предмет выявления генов Arabidopsis, гиперэкспрессия которых приводила к пролиферации клеток каллусиой культуры, позеленению и формированию побегов в условиях отсутствия экзогенных цитокининов [Kakimoto et.al,, 1996]. Этот анализ позволил идентифицировать ген CKI1, который кодирует белок, имеющий гомологию с гистидинкиназой. Было высказано предположение, что СКП является рецептором цитокининов. Недавно был получен нефункциональный вариант СКП, и оказалось, что он никогда не наследуется через женские гаметы. Это указывало на важную роль СКП при формировании женского гаметофита [Hutchison et al,., 2002]. По данным других исследований активность самого СКП не зависит от цитокининов, хотя его гиперэкспрессия может активировать чувствительные к цитокининам гены [Hwang & Sheen, 2001; Yamada et.aL, 2001]. Таким образом, роль СКП в передаче цитокининового сигнала не ясна.
Практически в одно и то же время было опубликовано несколько работ, в которых были приведены неопровержимые доказательства существования семейства генов, кодирующих рецепторы цитокининов у A. Thalania: АНК2, АНКЗ и АНК4 (CRE1) [Inoue et al... 2001; Suzuki et al., 2001; Ueguchi et al., 2001, Yamada et al., 2001].
В той же лаборатории, где впервые был описан ген СКП, для поиска гена, кодирующего рецептор цитокининов, был проведен скрининг свыше 19000 растений Arabidopsis, подвергнутых мутагенезу этилметансульфонатом. В результате удалось получить мутантное растение с признаками пониженной чувствительности к цитокининам. Мутация, приведшая к появлению «цитокинин-нечувствительного» фенотипа была названа cre-1-l {cylokinin response 1-1) [Inoue et al., 2001]. Было установлено, что локус CRE1 расположен на хромосоме 2 между генетическими маркерами rga и nga 1145. Анализ последовательности ДНК лежащей между этими двумя маркерами, проведенный с использованием данных о полной структуре геномной ДНК Arabidopsis, показал, что в этой области имеется открытая рамка считывания, соответствующая гену At2gOI830, предположительно кодирующему гистидинкиназу. Оказалось, что гипотетический ген At2gOI830, названный CRE1, идентичен гену WOL [Mahonen at all., 2000], о котором было известно, что он важен для формирования сосудистой ткани в корнях, и гену АНК4 [Suzuki et al., 2001,].
Для изучения функций гена CR.E1, была осуществлена его экспрессия в клетках дрожжей, у которых был поврежден ген осмосенсорной гистидинкиназы SLN1 (рис.2). В условиях нормального осмотического давления SLN1 фосфорилирует собственный консервативный остаток гистидина, затем фосфатная группа переносится на консерватиный остаток аспарагиновой кислоты в воспринимающем домене этого же белка, далее через промежуточный медиатор YPD1 на остаток аспарагиновой кислоты регулятора ответа SSK1. Это в свою очередь предотвращает активацию каскада протеинкиназ, приводящих к активации митоген-активируемого белка (mitogen-activated protein - MAP). Мутация slnlA летальна, поскольку не фосфорилированный SSK1 делает МАР-киназный каскад все время активным, что в конечном итоге губительно для клеток в условиях повышенной осмолярности среды. Однако присутствие в среде галактозы этот эффект снимает. Мутанты, несущие мутацию slnlA, трансформированные плазмидой p415CYC-CREl, которая обеспечивает экспрессию гена CRE1, приобретали способность расти на безгалактознй среде, если она содержала транс-зеатин. Следовательно, цитокинин активировал в дрожжевой клетке гистидинкиназу CRE1, которая заменяла поврежденную сенсорную киназу SLN1, и это приводило к передаче фосфатной группы по цепи сигнала, вызывая процессы, необходимые для выживания клеток в отсутствии галактозы в среде. Примечательно, что в этой системе подобный эффект вызывали только биологически активные цитокинины: транс-зеатин, изопентениладенин, бензиладенин и тидиазурон, при добавлении в среду неактивного аналога цитокининов цис-зеатина летальность мутации не супрессировалась.
Концептуально схожие эксперименты, проведенные с генами АНК2 и АНКЗ, дали такой же результат, причем цитокинин-зависимая передача фосфатной группы по цепи фосфатного сигнала была продемонстрирована как на клетках Saccharomyces cerevisiae, так и на клетках Е. coli [Suzuki et al., 2001; Ueguchi et al., 2001, Yamada et al., 2001].
Подтверждение того, что CRE1/AHK4 связывается с цитокинином было получено в опытах с препаратами мембран, выделенных из клеток Saccharomyces cerevisiae, экспрессирующих CRE1 [Yamada et al., 2001]. CRE1 с высокой аффинностью связывал радиоактивно меченный цитокинин изопентениладенин. Конкурентный анализ с немеченым компонентом показал, что только -замещенные аминопурины, обладающие биологической активностью цитокининов могли связываться с CRE1 в условиях этого эксперимента. Рибозилированный цитокинин не связывался с CRE1, и это давало основание полагать, что CRE1 взаимодействует лишь с цитокининами в форме свободных оснований. Примечательно, что синтетические аналоги цитокининов, такие как дифенилмочевина и тидиазурон, значительно отличающиеся по структуре от природных цитокининов, также связывались с CRE1. Как было сказано выше, ген CRE1 идентичен описанному ранее гену WOL. Эксперименты, проводимые с растениям, содержащими мутацию wol, изначально не были нацелены на сбор доказательств в пользу того, что ген WOL кодирует рецептор цитокининов. Однако полученные результаты оказались весьма ценными в плане характеризации цитокининового рецептора, когда стало ясно, что WOL, CRE1 и АНК4 это один и тот же белок. Мутация wol была идентифицирована благодаря тому, что в гомозиготном состоянии она приводила к появлению фенотипа wooden leg (деревянная нога). Это было связано с уменьшением числа клеток и отсутствием флоэмы в сосудистой ткани корней [Scheres et all., 1995]. Клетки Е. coli с дефектным геном гистидиновай киназы RcsC, в которых экспрессировали CREI с wol мутацией, не могли связывать цитокинин. Этот факт в сочетании с точными данными о локализации мутации wol доказывал, что цитокинин-связывающий сайт находится в экстраклеточной части молекулы рецептора [Yamada et al., 2001]. Методом анализа РНК in situ было показано, что ген WOL экспрессируется на разных стадиях эмбриогенеза [Mahonen et al., 2000]., Хотя РНК-транскрипты CREI были выявлены в надземных органах растений, равно как и в корнях, фенотип мутантов woVcrel указывал на то, что CRE1 важен именно для формирования тканей корня.
Множественность путей реализации цитокининовых сигналов в клетках растений
Для стероидных гормонов животных хорошо изучена регуляция экспрессии гормон-зависимых генов путем связывания гормон-рецепторного комплекса с ДНК промоторов этих генов [Tsai et al., 1994]. Однако в настоящее время становится очевидным, что функции этих гормонов реализуются благодаря сочетанию различных механизмов внутриклеточной сигнализации, в которых задействованы как ядерные, так и мембранные рецепторы [Hall et al., 2001]. В свете имеющихся экспериментальных данных нам представляется вероятным, что цитокинины также могут использовать как ядерные, так и мембранные рецепторы для проявления регуляторного действия в растительных клетках. Среди вероятных элементов регуляторной системы, задействованных в реализации цитокининового сигнала, продукты генов СКН1 и СКН2, которые участвуют в регуляции дифференцировки хлоропластов и пролиферации клеток [Kubo & Kakimoto, 2000]. Иммунофилин-подобный белок (продукт гена PAS1) вероятно также является частью механизма, обуславливающего чувствительность клеточных делений к цитокининам [Faure et al., 1998; Vittorioso et al., 1998]. Недавно, с применением технологии микрочипов было показано, что мутантные растения, у которых были повреждены гены мембранных рецепторов цитокинина, характеризуются измененным уровнем экспрессии целого ряда генов, среди которых и некоторые гены первичного ответа на цитокинины [Rashotte et al., 2003]. Изучение свойств и выяснение функций, кодируемых этими генами, белков, вероятно, дополнят наши знания о путях передачи цитокининового сигнала.
Приведенные выше данные, характеризующие ядерные цитокинин-связывающие белки, выделенные из листьев ячменя, Arabidopsis (ЦСБ 67) и из этиолированных проростков кукурузы (ЦСБ 70) указывают на то, что эти белки также являются элементами сложной системы цитокининовой сигнализации. Следует упомянуть, что участвующий в регуляции транскрипции ЦСБ 67 кД подвергается автофосфорилированию, которое регулируется цитокинином [Селиванкина и соавт., 2001]. Не исключено, что в клетке фосфорилирование этого белка происходит при участии мембранного рецептора цитокининов или других элементов бикомпонентной регуляториой системы. Эти факты делают актуальным дальнейшее изучение свойств ядерных ЦСБ со свойствами транс-факторов, к которым относится и ЦСБ 70 кД из проростков кукурузы, являющийся объектом нашего исследования. В работе использовали этиолированные проростки кукурузы (Zea mays L.) Сорта Эльбрус. Семена промывали мыльным раствором, стерилизовали, выдерживая в течение 10 мин в 0.05%-ном растворе КМ1Ю4, промывали дистиллированной водой и высаживали на влажную фильтровальную бумагу в темноте при 25 С и относительной влажности воздуха 95%. Выделение ЦСБ-70 для иммунизации мышей, тестирования антител, методических опытов по подбору пар моноклональных антител для сэндвич-варианта ИФА, а также выделение суммарной фракции полирибосом проводили из побегов 5-дневных этиолированных проростков кукурузы. Гибридомы, продуцирующие МА против ЦСБ-70, были получены в результате слияния клеток мышиной плазмоцитомы SP2/0 со спленоцитами иммунных мышей с использованием ПЭГ-3000 по стандартной методике [Kohler et all., 1975, Wtirzen et all., 1992]. Антиген для иммунизации (ЦСБ-70) выделяли аффинной хроматографией на ZR [Бровко и соавт., 1996]. Для получения асцитной жидкости использовали мышей линии BALB/c в возрасте 10 недель и старше. Предварительно мышам в брюшную полость вводили 0.2 мл пристана (2,6,10,14-тетраметилпентадекан, Sigma, США). Спустя две недели в брюшную полость вводили 106 клеток гибридом, продуцирующих МА против ЦСБ-70. Через 10-15 дней животных, у которых наблюдались явные признаки накопления асцита, убивали методом цервикальной дислокации и отбирали асцит из брюшной полости при помощи шприца. Асцит центрифугировали 20 мин при комнатной температуре при 200g, затем 20 мин при " 800g. Супернатант использовали для дальнейшего выделения антител. Асцитную жидкость разбавляли в 4 раза ФСБ (0.02 М NaH2P04/Na2HP04, 0.15 М NaCl, рН 7.5), к полученному раствору при перемешивании добавляли равный объем насыщенного раствора С А. Смесь инкубировали 30 мин при 4С и перемешивании, затем центрифугировали 20 мин при 3000g при 4С. Осадок растворяли в буфере А (0.02 М NaH2PC 4/Na2HP04, рН 8.0) в объеме равном исходному объему асцитной жидкости и диализовали в течение ночи против этого же буфера. Далее проводили ионообменную хроматографию на колонке Mono Q HR 5/5, предварительно уравновешенной буфером А (0.02 М NaH2P04/Na2HPC«4, рН 8.0). МА элюировали с колонки градиентом концентрации NaCl (0-0.4 М). Клетки гибридом растили во флаконах в среде RPMI 1640 с 20% фетальной сывороткой. Когда клетки в результате делений образовывали сплошной слой на дне флаконов, среду заменяли на RPMI 1640 с 5% фетальной сывороткой и 0.8% глюкозой. Клетки инкубировали в этой среде до появления признаков их массовой гибели. Культуральную жидкость центрифугировали 20 мин при 200g, к супернатанту добавляли СА до концентрации 1 М и Трис-HCl рН 9.0 до концентрации 0.5 М и наносили на колонку с Protein A-sepharose CL-4B (Pharmacia No. 17-0780-01). Иммуноглобулины элюировали с колонки 0.2 М Na-цитратным буфером, рН 3.5. Элюат немедленно нейтрализовали ЇМ трис-HCl, рН 9.0.
Синтез аффинного сорбента на основе МА и Sepharose CL-4B (Pharmacia)
Агарозный гель (5 г потрескавшейся на фильтре, но еще влажной агарозы) суспендировали в 0.1 М NaHCOa (5 мл) при температуре 18С и доводили рН до 11.0 путем добавления 4.0 М NaOH. При осторожном перемешивании на магнитной мешалке постепенно добавляли 0.5 г твердого CNBr. Активацию вели в течение 12 мин, поддерживая температуру 18 С путем добавления в смесь измельченного льда и уровень рН 11.0 - путем добавления 4.0 М NaOH. Активированный гель промывали поочередно ледяным 0.1 М NaHC03 и 5%-ным (об./об.) ацетоном; для заключительного промывания использовали 0.1 М ИаНСОз. К гелю добавляли 10 мл раствора антител, свободных от РНКазной активности, с концентрацией 2 мг/мл в ФСБ. Суспензию оставляли инкубироваться в течение ночи при перемешивании на орбитальном шейкере при 4С. После этого гель тщательно промывали дистиллированной водой, а затем поочередно 0.1 М ацетатом натрия (рН 4.0), содержащим 0.5 М NaCl, и буфером для присоединения (ФСБ). Непрореагировавшие активные группы агарозного геля блокировали путем добавления 0.5 М этаноламина/HCl (рН 9.0). 1 г сорбента Toyopearl HW-65, промытого дистиллированной водой и подсушенного на пористом стеклянном фильтре суспендировали в 2 мл З М NaOH, затем к нему добавляли эпихлоргидрин до конечной концентроции 50% и инкубировали 2 ч при 50С, непрерывно перемешивая на водном термостатируемом шейкере. После этого сорбент тщательно промывали дистиллированной водой, а затем 20%-ным этанолом. Полученный таким образом эпоксиoyopearl суспендировали в 5 мл 25%-ного NH4OH и инкубировали при перемешивании в течение 1 ч при 40С. Полученный в результате аминопропил-Тоуореагі промывали 20%-ным этанолом, а затем дистиллированной водой. Готовили 1 мл 50 мМ раствора зеатинрибозида в метаноле. К нему по каплям при перемешивании добавляли 2 мл 100 мМ NaJ04 и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. Избыток NaJC4 инактивировали добавлением в течение 5 мин при перемешивании этиленгликоля до конечной концентрации 100 мМ. Тщательно промытый водой аминопропил-Тоуореагі суспендировали в минимальном объеме 5% К2СО3 (рН 9.5), затем к нему по каплям добавляли раствор окисленного зеатинрибозида. Инкубацию .проводили в течение 1 ч при комнатной температуре. Свободные альдегидные группы восстанавливали боргидридом натрия, добавляя троекратно по 1 мл свежеприготовленный раствор с концентрацией 1 мг/мл. Содержание зеатинрибозида в полученном сорбенте составляло 25 мкмоль/мл.
Для хроматографии полисом использовали 0.6 мл сорбента с иммобилизованными антителами. Суспензию полисом объемом 10 мл (10 мкг/мл) в буфере нанесения - 20 мМ Трис-HCl (рН 7.5), 5 мМ MgCh, 100 мМ NaCl - пропускали через колонку в течение 30 мин при 4С. Для удаления неспецифически связавшихся продуктов сорбент последовательно промывали буфером для нанесения при комнатной температуре и этим же буфером, содержащим 1 М NaCI, при 37С. Объем буфера для промывки составлял 10 объемов колонки. Элюцию сорбированных полисом осуществляли при комнатной температуре 6 М гуанидингидрохлоридом, содержащим 200 мМ 2-меркаптоэтанола. В этих условиях происходила «разборка» полисом до РНК и белков. Полисомную РНК выделяли фенольной депротеинизацией с последующим осаждением этанолом и использовали для синтеза кДНК. Первую цепь кДНК синтезировали с помощью обратной транскриптазы AMV (Amersham) и олиго(оТзо) в качестве затравки. Вторую цепь кДНК синтезировали по общепринятой методике с использованием РНКазы Н и ДНК-полимеразы [Уотсон К., Дж., 1988]. К полученной кДНК с помощью ДНК-лигазы присоединяли олигонуклеотидные адаптеры -d(AATTCGTCGACATCGAT), которые использовали для ПЦР амплификации кДНК. Синтез кДНК и лигирование адаптеров осуществляли с реактивами и по инструкции фирмы «Promga», (США). 25 циклов амплификации проводили на приборе ТНС-2 фирмы «Techne» (Великобритания) в следующем режиме: 95С - 30 с, 48С - 1 мин, 72С - 1 мин, используя термостабильную ДНК-полимеразу Taq (ИБХ РАН, Москва). Продукты амплификации фракционировали гельфильтрацией на колонке і 0 . 9x10 см, заполненной Toyopearl HW-65 Fine в буфере: 150 мМ NaCI, 1 мМ Ыаг-ЭДТА, 20 мМ Трис-HCl (рН 8.0). Для последующего клонирования использовали ДНК со средними размерами молекул более 500 п.о. ДНК клонировали в составе экспрессирующего вектора XMOSElox по сайтам EcoRI в клетках E.coli B834(DE3). Фаговые частицы для трансдукции клеток E.coli B834(DE3) получали при использовании «паковочного экстракта» фирмы Amersham, следуя прилагающейся инструкции. Хроматографию проводили на колонке с 0.5 мл сорбента зеатинрибозид- Toyopearl, уравновешенной буфером: 20 мМ Трис-HCl (рН 7.5), 5 мМ MgCb, 50 мМ NaCl. Препарат полисом (100 мкг) суспендировали в 1 мл вышеуказанного буфера и добавляли 100 ед. ингибитора рибонуклеаз из плаценты человека (25 ед/мкл, Promega). Полисомы наносили на колонку при температуре 4С со скоростью 5 мл/ч. После этого сорбент последовательно промывали десятью объемами буфера для нанесения при 4С, затем при комнатной температуре, и при 37С. Элюцию полисом осуществляли при 37С 4 М гуанидинтиоцианатом, содержащим 200 мМ 2-меркаптоэтанол. В этих условиях происходила «разборка» полирибосом до РНК и белков. Полисомную РНК, элюированную с зеатинрибозидoyopearl и депротеинизированную, как было описано выше, применяли для синтеза кДНК по методу Schaefer [Schaefer, B.C., 1995] с модификациями. Чтобы исключить из реакций синтеза кДНК деградированные в процессе выделения мРНК, а также рРНК, проводили обработку препарата РНК щелочной фосфатазой, удаляли кэп-структуры с помощью кислой пирофосфатазы из табака, а к образовавшимся 5 -!фосфорилированым. . РНК присоединяли с помощью Т4 РНК-лигазы (Amersham) олигонуклеотидный «якорь» -d(AATTCGTCGACATCGAT). Синтез кДНК проводили с помощью обратной транскриптазы AMV и олииго (сГГзо) в качестве затравки. 25 циклов амплификации кДНК осуществляли с использованием олигонуклеотида «якоря» и олииго (оТзо) в следующем режиме: 95С - 30 с, 48С - 1 мин, 72С - 5 мин, используя смесь термостабильных ДНК-полимераз - Taq (ИБХ РАН, Москва) и Deep Vent (New England Biolabs, США). Клонирование проводили также как в первом варианте. Клетки E.coli штамма B834(DE3), инфицировали фагом XMOSElox, содержащим фрагменты кДНК, рассевали на чашки Петри диаметром 9 см с плотностью 1000 б.о.е. на одну чашку. Колонии-бляшки анализировали на присутствие в них полипептидов, реагирующих с антителами против ЦСБ-70 следующим образом. С поверхности агаризованных сред, на которых росли бактерии, получали реплики (отпечатки) на нитроцеллюлозных фильтрах следуя общепринятой методике [Маниатис Т, 1984]. Реплики погружали в 1%-ный раствор желатина и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем фильтры погружали в раствор, содержащий смесь из четырех биотинилированных моноклональных антител против ЦСБ-70 с концентрацией каждого из антител 5 нг/мл. Для детекции биотинилированных антител применяли конъюгат стрептавидинфосфатазы (Amersham) и проявляющие реагенты: 5-бром-4-хлориндолилфосфат и нитроблютетразолий (Bio-Rad, США) Между стадиями фильтры промывали 5 раз ФСБ и 5 раз ФСБ с 0,1% Tween-20. Идентифицированные таким образом клоны-продуценты реклонировали, и повторно анализировали.
Моноклональные антитела к ЦСБ-70, их выделение и характеристика
К настоящему моменту в научной литературе опубликовано множество работ, свидетельствующих о достижении значительного прогресса в изучении механизмов передачи цитокининового сигнала. У Arabidopsis открыт мембранный рецептор цитокининов CRE1, действующий по принципу бикомпонентной регуляторной системы. В результате изящно спланированных и осуществленных экспериментов получены неопровержимые доказательства участия в передаче цитокининового сигнала мембранного рецептора CRE1 и других белков, имеющих отношение к бикомпонентной регуляторной системе, в частности, RR белков В-типа, обладающих функциями транскрипционных факторов.
Однако в настоящее время становится очевидным, что действие цитокининов реализуется не только в результате передачи сигнала через мембранный рецептор и сопряженной с ним цепи фосфорилирования цитоплазматических и ядерных белков. Значительное количество экспериментальных данных указывает на существование альтернативных путей передачи цитокининового сигнала, что подчеркивает важность выясненя действия в клетках рецепторов цитокининов разного уровня.
Для цитокинин-связывающего белка кукурузы, выделенного в нашей лаборатории, было показано, что он обладает свойствами цитокинин-зависимого транскрипционного фактора. По ряду признаков он был отнесен к семейству ядерных цитокинин-связывающих белков со свойствами рецептора цитокининов, к которому принадлежат и цитокинин-связывающие белки 67 кД (ЦСБ-67) из листьев ячменя [Kulaeva, 1995] и Arabidopsis [Селиванкина и соавт., 2001]. В отношении ЦСБ-67 были получены экспериментальные данные о присущей этому белку протеинкиназной активности, регулируемой цитокинином.
В рамках данного исследования с использованием разработанных иммунохимических подходов было показано, что ЦСБ-70 кукурузы активно экспрессируется в меристематической зоне корня. При переходе к зоне растяжения количество этого белка в клетках значительно уменьшается. Вместе с тем было показано, что содержание физиологически активного цитокинина - зеатина в клетках меристемы ниже, чем в клетках зоны растяжения. Поэтому, если предположить, что ЦСБ-70 в комплексе с зеатином участвует в регуляции деления клеток, то лимитирующим звеном, останавливающим клеточные деления, при переходе клеток из зоны деления в зону растяжения может оказаться именно этот белок. Полученные данные хорошо согласуются со свойствами цитокининов активировать деления клеток и делают актуальным изучение роли ЦСБ-70 в этом процессе. В работах зарубежных авторов для изучения локализации в растительном организме тех или иных белков, связанных с реализацией цитокининового сигнала, были применены подходы, с использованием непрямых методов анализа. Так в одних экспериментах, анализ был основан на определении количества в различных тканях растения РНК-транскриптов соответствующих генов, в других, с использованием репортерных генов, таких как GFP или GUS, анализировалась активность промоторов генов регулируемых цитокинином или белков, участвующих в трансдукции сигнала, третьих - исследуемые белки были экспрессированы в составе гибридных молекул исследуемого белка с продуктами репортерных генов. Полученные с использованием этих подходов результаты не всегда в точности отражают истинное содержание исследуемого белка в ткани. В случае применения анализа РНК-транскриптов следует учитывать тот факт, что экспрессия некоторых белков может регулироваться не только на уровне транскрипции, но и на уровне трансляции, как, например, в случае некоторых ARR белков А-типа. Иными словами количество мРНК не всегда корреллирует с количеством белка. При использовании репортерных генов не стоит забывать, что полученные результаты будут отражать активность тех или иных генов в трансформированном растении. Поскольку вопрос о степени воздействия на растительный организм чужеродных генов до сей поры остается спорным, заключения об уровне экспрессии тех или иных белков, полученные с помощью этой методологии зачастую требуют подтверждений, полученных альтернативными способами. Примененный в нашей работе иммунохимический подход позволил сравнить содержание исследуемого белка в различных частях проростка кукурузы прямым методом, а полученные данные отражают содержание самого цитокинин-связывающего белка, а не его мРНК или продукта репортерного гена. Во второй части работы была продемонстрирована возможность эффективного применения иммунохимических подходов для выделения и последующего клонирования мРНК, служащих матрицами для синтеза белков, несущих антигенные детерминанты для конкретных моноклональных антител. В нашей работе мы использовали моноклональные антитела к ЦСБ-70 и стремились получить рекомбинантные клоны, содержащие последовательность ДНК, кодирующую ЦСБ-70. Двумя незамисимыми методами было достигнуто обогащение мРНК из этиолированных проростков кукурузы матрицами, кодирующими ЦСБ-70. На их основе была сконструирована библиотека кДНК и выделены клоны, синтезирующие полипептид, близкий по молекулярной массе к рецептору цитокининов и взаимодействующий с антителами, полученными против рецепторного белка. 1. Разработан высокочувствительный метод для определения ЦСБ-70 на основе сэндвич-варианта ИФА с использованием пары моноклональных антител к неперекрывающимся эпитопам ЦСБ-70 и стрептавидин-биотиновой системы. 2. С помощью разработанного метода определения ЦСБ-70 впервые изучено его распределение в 4-ех дневных этиолированных проростках кукурузы и установлено, что максимальная концентрация этого белка сосредоточена в меристеме корня и в узле, где в этот период происходят клеточные деления. 3. Установлено, что в меристеме корня клетки содержат существенно больше ЦСБ-70, чем в зоне растяжения, причем доля ЦСБ-70 от общего количества внутриклеточного белка в клетках меристемы в пять раз выше, чем в клетках зоны растяжения. Это доказывает избирательное обогащение меристематических клеток белком со свойствами внутриклеточного рецептора цитокининов и позволяет предположить его участие в регуляции клеточных делений. 4. Исследована динамика содержания ЦСБ-70 в этиолированных проростках кукурузы в период их роста от 3-го до 5-го дня. Для этого периода показано стабильно высокое содержание ЦСБ-70 в меристеме корня, что соответствует происходящим в ней клеточным делениям. В узле обнаружено существенное снижение содержание ЦСБ-70, что связано с происходящими здесь процессами закладки и развития различных типов тканей будущего проростка, при которых доля активно делящихся клеток уменьшается по отношению к общему числу клеток. В остальных частях проростка существенных изменений содержания ЦСБ-70 не обнаружено.
