Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 10
Принцип оптико-биосенсорного анализа межмолекулярных взаимодействий 10
Взаимодействие антиген-антитело 15
1 Методы изучения кинетики реакции антиген-антитело 15
2 Характеристика поверхностного антигена вируса гепатита В 17
3 Характеристика нуклеокалсидного белка вируса гепатита С 20
Взаимодействие белок-липид 22
1 Методы исследования белок-липидных взаимодействий в мембранной цитохром Р450-содержащей монооксигеназной системе 22
2 Мембранные и водорастворимые белки цитохром Р450-содержащих монооксигеназных систем 24
Взаимодействие олигонуклеотид-олигонуклеотид 27
Взаимодействие фермент - низкомолекулярный лиганд 30
Материалы и методы исследования 34
Результаты исследования и их обсуждение 46
Исследование взаимодействия MKA/HBsAg 46
Исследование взаимодействия HCV-core-Ag/anti-core 55
Исследование взаимодействия мембранных и водорастворимых
белков из цитохром Р450-содержащих монооксигеназных систем с иммобилизованными фосфолипидными слоями 59
Исследование кинетики образования и распада дуплексов (p14)-(ODN-11)H (p14)(ODN-14) 76
Исследование взаимодействия NAD-зависимых дегидрогеназ цитозоля с иммобилизованным 5-аминоизатином 81
Общее заключение 86
Выводы 88
Литература 89
- Принцип оптико-биосенсорного анализа межмолекулярных взаимодействий
- Мембранные и водорастворимые белки цитохром Р450-содержащих монооксигеназных систем
- Исследование взаимодействия MKA/HBsAg
- Исследование взаимодействия NAD-зависимых дегидрогеназ цитозоля с иммобилизованным 5-аминоизатином
Введение к работе
Оптический биосенсор позволяет исследовать межмолекулярные взаимодействия в реальном времени без введения меток в анализируемые молекулы. Современные оптические биосенсоры характеризуются высокой чувствительностью, возможностью определять кинетические параметры образования и распада комплексов и быстротой анализа - несколько минут [Yeung et al., 1995]. В настоящее время такие приборы нашли применение в фармакологических и протеомных исследованиях [Myszka and Rich, 2000; Natsume et al., 2000; Nelson et al., 2000], при эпитопном анализе антигенов [Novotny et al., 2000] и для детекции микробных антигенов [Nedelkov et al., 2000; Welschof et al., 1997]. В качестве изучаемых объектов могут выступать различные пары: белок-белок, белок-липид, олигонуклеотид-олигонуклеотид, фермент-низкомолекулярный лиганд и т.д. В представленной работе оптический биосенсор использовался для изучения кинетических параметров взаимодействия антиген-антитело, взаимодействия белков цитохром Р450-содержащих монооксигеназных систем с фосфолипидными слоями, а также для изучения кинетических параметров гибридизации олигонуклеотидов и взаимодействия фермент-низкомолекулярный лиганд.
Актуальность данной работы определяется тем, что с помощью оптического биосенсора "резонансное зеркало" вычислены кинетические параметры образования межмолекулярных комплексов различных видов, и тем самым продемонстрированы возможности оптического биосенсора в экспериментальном исследовании межмолекулярных взаимодействий, а также возможности практического применения биосенсора при разработке биоаналитических методов, биотехнологических систем, в фармакологии и исследовании метаболических путей.
Исследование кинетики взаимодействия антиген-антитело позволяет получить данные, важные как в теоретическом плане (изучение общих механизмов белок-белковых взаимодействий, определение специфичности взаимодействия антиген-антитело, эпитопное картирование), так и для практического применения (разработка иммуно-тест-систем и терапевтических препаратов на основе антител). Поверхностный антиген вируса гепатита В является основным диагностическим маркером ВГВ - инфекции. Со времени открытия HBsAg в изучении различных аспектов ВГВ инфекции достигнут значительный прогресс, однако, вирусный гепатит В продолжает оставаться важной проблемой здравоохранения: у 10% больных он переходит в хроническое течение, а при хроническом гепатите, в свою очередь, в 1% случаев развивается цирроз и рак печени. Гепатит С также представляет серьезную угрозу здоровью людей из-за очень высокой вероятности (до 85% случаев) перехода в хронический процесс, приводящий в дальнейшем к циррозу и гепатоцеллюлярной карциноме. Нуклеокапсидный (core) белок является одним из структурных белков ВГС. Антитела к core антигену появляются одними из первых при острой инфекции, титры антител нарастают при хронической инфекции и сохраняются пожизненно у большинства выздоровевших людей [Giuberti et al., 1992; Yamagushi et al., 2000; Nikolaeva et af., 2002]. Выбор в качестве объектов исследования пар MKA/HBsAg и HCV-соге-Ag/MKA обусловлен большим интересом к разработке новых тест-систем для диагностики гепатитов В и С. Создание эффективных диагностических систем невозможно без информации о кинетических характеристиках взаимодействия белков-маркеров с иммобилизованными белками-зондами. В настоящей работе оптический биосенсор был применен для исследования кинетики взаимодействия пар HBsAg/MKA и HCV-core-Ag/MKA и для детекции HBsAg и anti-core в сыворотке крови.
Актуальность изучения цитохром Р450-содержащих монооксигеназных систем обусловлена их центральной ролью в метаболизме широкого спектра эндогенных субстратов и ксенобиотиков [Арчаков, 1975; Archakov and Bachmanova, 1990]. Липидное окружение может влиять на структуру и функциональные свойства белков. Несмотря на значительное количество работ в области липид-белкового взаимодействия, пока нет стройной модели, описывающей механизм этого взаимодействия. Это обусловлено недостатком данных, в том числе, по кинетическим характеристикам взаимодействия. Кинетические параметры лип ид-бел ковых взаимодействий определялись или по тушению флуоресценции аминокислотных остатков мембранного фрагмента [Dufourcq et al., 1975; Yang et aL, 1981], или путем введения специальных флуоресцентных меток [Leto and Holloway, 1979]. В настоящее время оптические биосенсоры находят все большее применение для исследования в реальном времени белок-белковых взаимодействий [Ivanov et al., 1997, 1999a,b, 2000, 2001 a, b], а также взаимодействий планарный липидный слой - белок [Ramsden et al., 1996; Salamon and Tollin, 1996a,b; Heyse et al., 1998], но созданные за счет адсорбции фосфолипидные слои были нестабильны. В представленной работе были созданы стабильные фосфолипид-содержащие биочипы путем ковалентной иммобилизации фосфолипидов на поверхности аминосилановой кюветы оптического биосенсора и исследовано взаимодействие мембранных и водорастворимых белков цитохром Р450-содержащих монооксигеназных систем с иммобилизованными фосфолипидными слоями.
Специфичная к последовательности модификация одно- и двухцепочечных нуклеиновых кислот реакционноспособными производными олигонуклеотидов, способными образовывать соответствующие дуплексы и триплексы, - один из наиболее перспективных вариантов антисмыслового подхода к регуляции экспрессии генов [Knorre and Vlassov, 1985]. Оли гону клеотиды и их производные могут быть направлены на матричные РНК с целью ингибирования процесса трансляции, а также на вирусные РНК или одноцепочечные ДНК для контроля процессов репликации или транскрипции. В представленной работе оптический биосенсор был применен для определения кинетических параметров взаимодействия олигонуклеотид/олигонуклеотид.
Изатин - низкомолекулярный эндогенный непептидный регулятор, обнаруженный практически во всех тканях и биологических жидкостях животных и человека [Medvedev et al., 1996; Гловер и др., 1997; Sandler et al., 2000]. Хотя изатин-связывающие белки обнаружены в мембранной и растворимой фракциях клеток, идентифицировано всего несколько мишеней действия изатина (моноаминооксидаза, А-подтип рецепторов натри йуретических пептидов и растворимая NO-стимулируемая гуанилатциклаза тромбоцитов человека) [Glover et al., 1995; Medvedev et al„ 1996; Гловер и др., 1997; Medvedev et al., 1998; Sandler et al., 2000]. Однако выявленные мишени действия изатина не могут объяснить всей биологической активности, свойственной этому соединению in vivo. В данной работе с помощью оптического биосенсора было изучено взаимодействие иммобилизованного 5-аминоизатина с NAD-зависимыми дегидрогеназами цитозоля: глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой (ГАФД), глицерол-3-фосфатдегидрогеназой (ГФДГ) и лактатдегидрогеназой (ЛДҐ).
Принцип оптико-биосенсорного анализа межмолекулярных взаимодействий
Метод регистрации белок-белковых взаимодействий с помощью оптического биосенсора появился в начале 1990-х годов. К настоящему времени созданы оптические биосенсоры, характеризующиеся высокой чувствительностью, возможностью определять кинетические параметры образования и распада комплексов и быстротой анализа. Основное преимущество данного метода - анализ в реальном времени быстротекущих межмолекулярных взаимодействий без введения меток в анализируемые молекулы- Существуют два типа оптических биосенсоров: первый, основанный на использовании явления поверхностного плазмон ного резонанса, и второй -«резонансное зеркало». Оба типа основаны на регистрации показателя преломления среды, содержащей исследуемую пару партнеров, с высокой чувствительностью, достигающей 10"11-10"12М при минимальном объеме проб [lAsys Cuvette System. Methods Guide, 1993].
Прибор, основанный на явлении поверхностного плазмонного резонанса, содержит измерительную кювету, дно которой представляет собой диэлектрическую призму (прибор ВІАсоге, фирма Pharmacia Biosensor, Швеция) или дифракционную решетку (BIOS, Швейцария) с нанесенным тонким (несколько сотен ангстрем) слоем металла (обычно золото или серебро). Схема прибора представлена на рис. 1.
Поверхностный плазмонный резонанс - оптическое явление, основанное на том, что энергия фотонов может передаваться электронам в металле. Когда свет сфокусирован через призму на тонкую пленку золота, нанесенную на стеклянную подложку, при определенном угле падения интенсивность отраженного света уменьшается благодаря передаче энергии фотонов электронам золота [Liedberg et al., 1983; Lofas and Johnsson, 1990]. При этом возникает поле затухающей световой волны. Поглощению падающего света при определенном угле падения соответствует провал в распределении интенсивности отраженного света по угловой координате.
Угол отражения света зависит от показателя преломления среды вблизи поверхности золотой пленки. При добавлении в кювету раствора, содержащего молекулы, которые образуют комплексы с молекулами, иммобилизованными на сенсорной поверхности, меняется показатель преломления в приповерхностном слое и наблюдается смещение провала в распределении в зависимости от времени. Разрешение и, соответственно, чувствительность ограничены шириной резонансного пика. Такие приборы применяются в фармакологических и протеомных исследованиях [Myszka and Rich, 2000; Natsume et al., 2000; Nelson et al., 2000], а также при эпитопном анализе антигенов [Novotny et al., 2000].
Прибор другого типа - «резонансное зеркало» - имеет разрешение на порядок выше за счет оптимального подбора оптических структур, формирующих данный тип конструкции [Cush et al., 1993]. Его схема представлена на рис. 2.
Основной частью этого прибора также является измерительная кювета, на чувствительной поверхности которой находится диэлектрический резонансный слой, толщиной 100 нм, с высоким показателем преломления neh- Этот слой отделен от призмы кварцевым слоем с низким показателем преломления nei, толщиной 500 нм, который является достаточно тонким, чтобы свет мог проникать в резонансный слой. На чувствительной поверхности кюветы иммобилизуется один из партнеров взаимодействующей пары. Луч лазера падает на границу призма-кварц; при определенном резонансном угле падения, когда достигается согласование фаз падающего света и резонансных мод слоя с высоким показателем преломления, часть света туннелирует через кварцевый слой и распространяется вдоль слоя с высоким показателем преломления, а затем туннелирует обратно и выходит из призмы. Призма сопряжена с волноводом, что исключает потери света. При резонансном угле падения излучения лазера на чувствительной поверхности кюветы формируется поле затухающей световой волны, интенсивность которого экспоненциально падает с увеличением расстояния от поверхности. При добавлении второго партнера в кювету происходит комплексообразование, в результате чего меняется показатель преломления среды в приповерхностном слое и, соответственно, изменяется резонансный угол. Временная зависимость изменения резонансного угла коррелирует с временной зависимостью комплексообразования взаимодействующей пары. Мониторинг изменения резонансного угла позволяет регистрировать кинетическую кривую образования комплексов. Регистрируя эти кривые при различных концентрациях добавляемого партнера, можно рассчитать константы скорости ассоциации и диссоциации. где t - время; R0 - величина сигнала биосенсора при t=0 (специально вводится, чтобы скорректировать возможный первоначальный сдвиг сигнала, вызванный изменением буфера после добавления раствора В); R - сипнал биосенсора при t=oo (в равновесном состоянии) относительно t=0; [В}- концентрация добавляемого партнера в растворе.
Каждой концентрации добавляемого партнера ([В]) соответствуют определенные значения f и RL Из линейной зависимости /от [В] (уравнение (4)) определяется ко„, которая равна величине тангенса угла наклона прямой. Теоретически коП также может быть определена из уравнения (4), как отрезок на оси ординат, образуемый точкой начала координат и точкой пересечения прямой уравнения (4) с осью ординат. На практике же ошибка определенной таким способом константы в большинстве случаев слишком велика.
Диссоциацию комплекса АВ наблюдают как уменьшение сигнала биосенсора, когда образец в кювете заменяют буфером. В этот момент концентрация свободных молекул [В] уменьшается. Если считать диссоциацию практически необратимой, т.е. предположить, что она происходит в достаточно большом объеме добавленного буферного раствора в условиях очень низкой [В], где повторное связывание освободившихся молекул В не происходит, то тогда диссоциация описывается следующим уравнением:
Мембранные и водорастворимые белки цитохром Р450-содержащих монооксигеназных систем
Нуклеокапсидный (core) белок является одним из структурных белков ВГС. Обнаружено, что он может существовать как в полноразмерной форме (известной как р21 и содержащей 191 аминокислотный остаток), так и в укороченной с С-конца [Ruster et al., 1996]. Белки, имеющие длину не менее 174 аминокислотных остатков, локализованы в цитоплазме, а более короткие обнаруживаются в ядре. Предполагается, что укороченные фюрмы белка играют важную роль в гепатоканцерогенезе [Lanford et al., 1993; Ruster et al., 1996; Morivaetal., 1998]. Белок core является одним из наиболее иммуногенных белков ВГС, он имеет ряд кластеров иммунодоминантных консервативных В-клеточных эпитопов [Chien et al., 1994]. Антитела к core антигену появляются одними из первых при острой инфекции, титры антител нарастают при хронической инфекции и сохраняются пожизненно у большинства выздоровевших людей [Giuberti et al., 1992; Yamagushi et al., 2000; Nikolaeva et a I., 2002]. Наличие anti-core в сыворотке пациентов определяют с помощью ИФА.
Известны примеры использования оптического биосенсора для детекции в человеческой сыворотке антител против вируса гепатита A [Gomara et al., 2000], антител против вируса герпеса I и II типа [Wrttekindt et al., 2000], а также для определения уровня человеческих анти -мышиных антител у пациентов при проведении пассивной иммунотерапии [George et al., 1995]. Таким образом, представляет интерес изучение возможности использования оптического биосенсора для детекции как поверхностного антигена вируса гепатита В, так и антител к нуклеокапсидному белку вируса гепатита С. мембранной цитохром Р450-содержащей монооксигеназной системе. Известно, что липидное окружение может влиять на структуру и функциональные свойства мембранных белков. Добавление фосфолипида к очищенным цитохромам Р450 увеличивает долю высокоспиновой формы Р450 и содержание а-спиралей [Ruckpaul et al., 1982; Omata et al., 1987; Yun et al., 1998]; также фосфолипиды позволяют стабилизировать активную конформацию Р450 [Archakov and Bachmanova, 1990; French et a!., 1980] и способствуют взаимодействию между NADPH-цитохром Р450 редуктазой и Р450, снижая Kd комплексов Р450 с Fp и с субстратами [Miwa and Lu, 1981; Imaoka etal., 1992; Voznesensky and Schenkman, 1994J. Наиболее выраженным действием на гидроксилазную активность обладают отрицательно заряженные фосфолипиды [Ingelman-Sundberg et al.,1981; Ingelman-Sundberg et al.,1983; Blanck et al., 1984; Taniguchi et al., 1984; Imaoka et al.,1988]. Потеря связи мембранных белков с фосфолипидами мембраны при солюбилизации сопровождается падением каталитической активности ферментов, а добавление фосфолипидов или встраивание белков в искусственный фосфолипидный бислой приводит к восстановлению их активности [Bosterling and Trudell, 1982; Ruckpaul and Rein, 1984]. С другой стороны, встраивание белка в мембрану может изменять свойства липидного слоя, в частности, снижать температуру фазового перехода [Taraschi and Mendelsohn, 1980]. Для исследования липид-белковых взаимодействий обычно используют модельные системы двух типов: пленарные фосфолипидные слои и везикулярные (липосомы) со встроенными в них белками [Ingelman-Sundberg and Glaumann, 1980; Вознесенский и др., 1990; Ramsden et al., 1996]. Изучение взаимодействия белков с липосомами проводят с помощью таких методов как ультрацентрифугирование, гель-фильтрация, электрофорез, абсорбционная, флуоресцентная и Раман-спектроскопия, электронная микроскопия, круговой дихроизм, которые позволяют определять количество встроенного белка, геометрические размеры, влияние встраивания белка на конформацию как белка, так и липидных слоев [Sullivan and Holloway, 1973; Dufourcq et al., 1975; Holloway and Katz, 1975; Robinson and Tanford, 1975; Roseman et al., 1977; Yang et al., 1981]. Несмотря на значительное количество работ в области липид-белкового взаимодействия, пока нет стройной модели, описывающей механизм этого взаимодействия. Это обусловлено недостатком данных о кинетических характеристиках взаимодействия, что, в свою очередь, связано со сложностью регистрации этих характеристик. Кинетические параметры липид-белковых взаимодействий определялись или по тушению флуоресценции аминокислотных остатков мембранного фрагмента [Dufourcq et al., 1975; Yang et al., 1981], или путем введения специальных флуоресцентных меток [Leto and Holloway, 1979]. В настоящее время оптические биосенсоры находят все большее применение для исследования в реальном времени белок-белковых взаимодействий [Ivanov et al., 1997; Ivanov et at., 1999 a, b; Ivanov et al., 2000; Ivanov et al., 2001 a, b] и взаимодействий пленарный липидный слой - белок [Ramsden et al, 1996; Salamon and Tollin, 1996a,b; Heyse et al., 1998]. Для создания пленарных липидных слоев использовался ряд методов. Один из них основывался на хемосорбции липидов, содержащих тиольную группу, на слое золота или на поверхности неорганических оксидов [Heyse et at., 1998]. Простой способ организации фосфолипидного бислоя, основанный на физической адсорбции фосфолипидов на Si(Ti)02 поверхности измерительной кюветы оптического биосенсора, был предложен в [Ramsden et al., 1994,1996]. Однако, созданный таким образом бислой был нестабильным из-за нековалентной адсорбции и, кроме того из-за использования ненасыщенного фосфолипида -диолеилфосфатидилхолина. Для получения стабильных фосфолипидных слоев гораздо эффективнее использовать искусственные насыщенные фосфолипиды, так как они не образуют радикалов. Таким образом, представляет интерес использование оптического биосенсора для изучения кинетических характеристик взаимодействия белков с фосфолипидным слоем.
Большой интерес к цитохром Р450-содержащим монооксигеназным системам обусловлен их центральной ролью в метаболизме широкого спектра эндогенных субстратов и ксенобиотиков [Archakov and Bachmanova, 1990]. Цитохромы Р450 могут быть условно разделены на два типа: водорастворимые (в основном бактериальные) и мембранные (все остальные), имеющие гидрофобный мембранный фрагмент, которым они "заякорены" в мембране.
Исследование взаимодействия MKA/HBsAg
Данный раздел посвящен исследованию взаимодействия антиген-антитело. С помощью оптического биосенсора были определены кинетические параметры связывания HBsAg с различными монокпональными антителами. Моноклональные антитела к общегрупповым эпитопам поверхностного антигена вируса гепатита В NE3 были иммобилизованы на КМД поверхности кюветы одноканального оптического биосенсора lAsys (см. Материалы и методы). Кривая иммобилизации NE3 представлена на рис.4.
Из разницы величин сигнала оптического биосенсора до и после иммобилизации была рассчитана поверхностная концентрация антител, которая для NE3 составляет 3,9 нг/мм2 (779 arc seconds - 3,9 нг/мм2, так как для декстрановой кюветы сигнал биосенсора 200 arc seconds соответствует поверхностной концентрации иммобилизованного белка 1 нг/мм2 [lAsys Cuvette System. Methods Guide, 1993]).
На рис. 5 приведены кривые связывания рекомбинантного HBsAg с иммобилизованными антителами NE3, полученные на оптическом биосенсоре. Минимальная концентрация HBsAg, определяемая с помощью КМД кюветы с иммобилизованными NE3, составляет 2 мкг/мл.
В работе также использовались кюветы, содержащие на поверхности карбоксильные группы, но без декстранового покрытия - карбоксилатные. Были проведены эксперименты по иммобилизации на поверхности карбоксилатной кюветы как NE3, так и CEN24. Иммобилизацию проводили по описанной выше схеме (см. Материалы и методы), в качестве блокирующего реагента использовали этаноламин. Для исключения вклада неспецифических взаимодействий применили дифференциальную схему регистрации на 2-х кюветах: 1) рабочая кювета с иммобилизованными на поверхности монокпональными антителами; 2) контрольная кювета, на которой повторяется вся процедура иммобилизации, за исключением добавления пробы, содержащей антитела. Для сывороточного HBsAg не наблюдалось связывания с поверхностью контрольной кюветы, в то время как в рабочей кювете регистрировали образование комплексов МКАим/HBsAg. Путем обработки экспериментальных кривых согласно уравнениям (3) и (6) были вычислены кинетические параметры комплексообразования сывороточного HBsAg с иммобилизованными антителами (табл.2). Минимальная концентрация HBsAg, определяемая с помощью карбоксилатной кюветы к одноканальному биосенсору с иммобилизованными МКА (CEN24), составляет 0,1 мкг/мл.
Однако при работе с сыворотками сигнал на контрольной кювете при добавлении пробы был значительно выше, чем сигнал от добавления такого же количества той же сыворотки в рабочую кювету. Вероятно, подобное увеличение сигнала биосенсора обусловлено сорбцией компонентов сыворотки на поверхности дна контрольной кюветы, не покрытой, как в случае рабочей кюветы, иммобилизованными антителами. Для того, чтобы уменьшить сорбцию на поверхности дна кюветы компонентов сыворотки, использовали различные блокирующие реагенты, рекомендованные фирмой lAsys, а именно: цитохром С, р - казеин, бычий сывороточный альбумин.
Далее в работе использовали двухканальный биосенсор lAsys plus, который позволяет проводить вычитание вклада неспецифического взаимодействия и существенно облегчает тестирование сложных биологических жидкостей. Ниже представлены результаты, полученные на аминосилановой двухканальной кювете, один канал которой был контрольным, а другой - рабочим. В рабочем канале кюветы были иммобилизованы моноклональные антитела NE3, в контрольном канале их не было, в качестве блокирующего реагента использовали бычий сывороточный альбумин. На рис. 6 приведена кривая иммобилизации NE3 на поверхности аминосилановой кюветы.
На рис. 7 представлены результирующие (полученные в результате вычитания сигнала контрольного канала из сигнала рабочего канала) кривые связывания сывороточного HBsAg с NE3HM. Минимальная концентрация HBsAg, определяемая с помощью аминосилановой кюветы с иммобилизованными NE3, составляет 0,4 мкг/мл. Константы скорости образования (/ ), распада комплексов (koff) и равновесная константа ассоциации (Кд) HBsAg с NE3, иммобилизованными на аминосилановой поверхности кюветы двухканального оптического биосенсора представлены в таблице 2.
Был также проведен эксперимент по изучению связывания МКА NE3 с иммобилизованным HBsAg. Сывороточный HBsAg был иммобилизован в рабочем канале карбоксилатной двухканальной кюветы, в качестве блокирующего реагента использовали р - казеин. Поверхностная концентрация иммобилизованного HBsAg равна 1,2 нг/мм2. Кинетические параметры комллексообразования NE3 с иммобилизованным HBsAg, вычисленные из экспериментальных кривых, представлены в таблице 2. Видно, что значение константы аффинности для NE3 не зависит от выбора поверхности кюветы, а также от порядка иммобилизации белков.
Полученные с помощью оптического биосенсора значения константы аффинности (равновесной константы ассоциации) моноклональных антител NE3 и CEN24 согласуются с описанными в литературе данными метода количественной преципитации: монокпональные anti-HBs к "а" детерминанте HBsAg связывались с синтетическими линейным и циклическим пептидами, соответствующими аминокислотам 139-147 основного полипептида HBsAg, а также с полипептидным комплексом др28/р23 из очищенного сывороточного HBsAg, с аффинностью 2-Ю6- 5-Ю6 М"1 [Brown et al., 1984]; в то время как аффинность поликлональных anti-HBs по отношению к этим же синтетическим пептидам и к пол и пептидному комплексу др30/р25 составляла 5,9-106 - 3,5-107 М"1 [Thanavala et al., 1986], Таким образом, показано, что оптический биосенсор может быть корректно применен для анализа взаимодействий антиген-антитело, при этом время анализа достаточно мало.
Представляет интерес использование оптического биосенсора для селективного выявления маркеров инфекционных заболеваний, в частности, HBsAg, в сыворотках крови. При тестировании образцов сыворотки на наличие поверхностного антигена ВГВ в оба канала аминосилановой кюветы добавляли по 6 мкл сыворотки к 54 мкл PBS/t. Если сыворотка содержала HBsAg, образовывались комплексы NE3„M/HBsAg, в результате чего менялся индекс преломления. Результирующая кривая, образующаяся при вычитании сигнала контрольного канала из сигнала рабочего канала, выявляла специфическое взаимодействие поверхностного антигена с иммобилизованными антителами. Для регистрации процессов диссоциации комплексов сыворотку из кюветы удаляли и добавляли PBS/t. На рис. 8 приведены сенсограммы взаимодействия сывороток №46577 и №46618 с иммобилизованными антителами. По данным иммуноферментного анализа сыворотка №46577 содержала HBsAg, а в сыворотке №46618 HBsAg отсутствовал. При добавлении сыворотки №46618 наблюдалось незначительное изменение результирующей базовой линии биосенсора. В случае сыворотки №46577 было обнаружено образование комплексов антиген-антитело: после отмывки PBS/t уровень результирующего сигнала биосенсора выше начального уровня на 60 arc сек.
Исследование взаимодействия NAD-зависимых дегидрогеназ цитозоля с иммобилизованным 5-аминоизатином
В соответствии с поставленной целью - определение с помощью оптического биосенсора кинетических констант образования и распада белок-белковых, белок-липидных и олигонуклеотидных комплексов - были проведены исследования взаимодействий антиген-антитело, белок-липид, олигонуклеотид-олигонуклеотид, фермент-низкомолекулярный лиганд с помощью оптического биосенсора. В диссертационной работе продемонстрировано применение оптического биосенсора для анализа взаимодействия антиген-антитело, в частности, пар MKA/HBsAg и HCV-core-Ag/anti-core. Полученные с помощью оптического биосенсора значения константы аффинности МКА к HBsAg не зависят от выбора типа кюветы и от порядка иммобилизации белков (показано на примере пары NE3/HBsAg), а также согласуются с описанными в литературе данными метода количественной преципитации. Были определены константы скорости ассоциации и константы скорости диссоциации для следующих пар антиген-антитело: NE3/HBsAg, CEN24/HBsAg, HCV-core-Ag/CE11, HCV-core-Ag/CE12, HCV-core-Ag/CD11, HCV-core-Ag/B-1. Также продемонстрирована возможность использования оптического биосенсора для выявления в сыворотке крови людей поверхностного антигена ВГВ и антител к нуклеокапсидному белку ВГС.
Путем исследования взаимодействия белок - липид с помощью оптического биосенсора определены константы скорости ассоциации для процессов адсорбции и встраивания, обусловленного гидрофобными взаимодействиями, а также константы скорости диссоциации белок-липидных комплексов: ДЛФЕ/d-bS, ДСФЕ/d-bS, ДЛФЕ/d-Fp, ДЛФЕ/СІ-2В4, ДСФЕЛІ-2В4. Мембранные белки 2В4, Fp и Ь5 встраиваются в фосфолипидные слои. Была продемонстрирована доминантная роль гидрофобных мембранных фрагментов d-b5 и d-Fp во встраивании их в липидный слой. Наряду с гидрофобными взаимодействиями в процессе встраивания d-b5 и d-Fp принимают участие электростатические силы. Электростатические взаимодействия препятствовали адсорбции цитохрома Ь5 на ДЛФЭ слой, но не влияли на его встраивание, и в то же время способствовали встраиванию Fp в фосфолипидный слой. Эффективность встраивания уменьшалась с увеличением длины ацильной цепи фосфолипида. В буфере низкой ионной силы не наблюдали встраивания Ь5 и Fp в липид с более длинной ацильной цепью (ДСФЭ). Встраивание d-b5 увеличивалось при температуре ДЛФЭ-слоя выше точки фазового перехода.
На примере d-2B4 было показано, что степень агрегации белка влияла на его взаимодействие с липидным слоем; агрегаты d-2B4 не встраивались в фосфолипидный слой. Водорастворимые белки или не адсорбировались на поверхности фосфолипида (Ad), или адсорбировались только за счет электростатических взаимодействий (альбумин), или за счет электростатических и гидрофобных взаимодействий (Р450сат). Причем адсорбция водорастворимых белков была больше в случае фосфолипида с меньшей длиной ацильной цепи. В работе продемонстрировано применение оптического биосенсора для определения кинетических параметров взаимодействия олигонуклеотид-олигонуклеотид. Определены кинетические параметры гибридизации олигонуклеотидов ODN -11 и ODN -14 с иммобилизованным зондом р14. Результаты, полученные с помощью оптического биосенсора, т.е. в гетерогенных условиях, сравнили с данными, полученными в гомогенных условиях: методом температурного скачка, а также рассчитанными из кривых плавления олигонуклеотидных дуплексов. Процесс диссоциации имеет сходные количественные характеристики и в одном, и в другом случае. Процесс ассоциации, происходящий в чувствительном слое биосенсора, более адекватно отражает реакцию в живых клетках. В представленной работе также показана возможность использования оптического биосенсора для изучения взаимодействия фермент низкомолекулярный лиганд на примере NAD-зависимых дегидрогеназ цитозоля и низкомолекулярного эндогенного непептидного регулятора изатина. Показано, что глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа и глицерол-3 фосфатдегидрогеназа являются изатин-связывающими белками. Это взаимодействие является специфическим, поскольку показано также, что еще один NAD-зависимый фермент цитозоля - лактатдегидрогеназа - не взаимодействует с иммобилизованным аналогом изатина. Определены константа скорости ассоциации и константа скорости диссоциации для пары 5-аминоизатиним/ГФДГ. 6. выводы 1. Определены кинетические константы образования и распада комплексов MKA/HBsAg и HCV-core-Ag/MKA с помощью оптического биосенсора. 2. Оптический биосенсор может быть использован для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В и антител к нуклеокапсидному белку вируса гепатита С в сыворотке крови людей. 3. Разработана методика ковалентной иммобилизации фосфатидилэтаноламинов на поверхности кюветы оптического биосенсора. 4. Полноразмерные мембранные белки - цитохром Р450 2В4, цитохром Ь5 и NADPH-цитохром Р450 редуктаза - встраиваются в созданные фосфолипидные спои. Определены константы скорости ассоциации для процессов адсорбции и встраивания, обусловленного гидрофобными взаимодействиями, а также константы скорости диссоциации белок-липидных комплексов: ДЛФЕиМ/сІ-Ь5, ДСФЕии/ d-b5, ДЛФЕим/d-Fp, ДЛФЕи«/сІ-2В4, ДСФЕим -2В4. 5. Оптический биосенсор применен для определения кинетических параметров взаимодействия олигонуклеотид-олигонуклеотид. Вычислены кинетические параметры гибридизации 11-мера TGGGAAGAGGG (ODN-11) и 14-мера TGGGAAGAGGGTCA (ODN-14) с 14-мерным биотинилированным олигонуклеотидом pTGACCCTCTTCCCA (р14), иммобилизованным на 7 [ поверхность декстрановои кюветы через стрептавидин. - - - - _ .. , 6. Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа и глицерол-3 фосфатдегидрогеназа являются изатин-связывающими белками. Это взаимодействие специфическое, поскольку лактатдегидрогеназа, также NAD-зависимый фермент цитозоля, не взаимодействует с иммобилизованным аналогом изатина. Определены кинетические константы образования и распада комплекса 5-аминоизатинин/ГФДГ.
