Введение к работе
Хорошо известно, что специфические свойства клеток нервной тканей в известной мере определяются структурой и функциями нейроспецифических белков (НСБ), посредством которых генетическая информация получает свое реальное воплощение [Березин В А, 1990;Чехопин ВП, 1989-2004, Edelman G.M, 1999, Engl, 1970-2000, Moore B.W, 1976-1982]. Несмотря на то, что за 40-летний период, появились сообщения о более чем 65 НСБ научное направление, связанное с их изучением, продолжает активно развиваться как в фундаментальном, так и в прикладном аспектах [Eng L, 2000; Chekhonin VP, 2002, SharpFR, 2002, Herrmann M., 2003; Ingebrigtsen Т., 2003; MarchiN, 2003; Sny-der-Ramos SA, 2003; Lamers К J, 2003; Verbeek MM, 2003; Welzl K, 2003, PovlsenGK, 2003; Pineda J A , 2004; Bock E, 2004, KiryushkoD, 2004].
Основными методами идентификации НСБ, а также их качественного и количественного определения в биологических жидкостях и тканях являются методы иммунохимического анализа [Moore В W, 1982, Albrechsen М, Воск Е 1985, O'CollaganJP 1991, Rosengren L , 1994, EngL, 2000, Чехонин В П, 2000, Ohta М, 2002, Ross G W, 2003, PetzoldA., 2004].
В этом аспекте, признавая роль поликлональных антител (AT), как инструмента обеспечившего и значительно расширившего концептуальное понимание механизмов функционирования клеток нервной ткани и нервной системы в целом, стало очевидным, что эффективность дальнейшего применения поликлональных AT ограничивается рядом недостатков, которых практически невозможно избежать как при исследовании спектра антигенов нервной ткани, так и при разработке методов диагностики и лечения. Даже иммунизация высо-коочищенными препаратами НСБ не может исключить присутствие в антисыворотках AT к антигенам, содержащихся в основном препарате в виде минорных примесей, не говоря об AT к различным эпитопам антигена [Drivsholm L , 1995; RosengrenLE, 1996, Sterk М, 1999; Eng L., 2000; Chekhonin VP., 2002; Ross G.W., 2003, GurnettCA., 2003; HaghighiS., 2004, PetzoldA., 2004].
Открытие в 1975 Kohler G и Milstein С. способа длительного культивирования Ig-секретируюших клеток, привело [к сазданико^хйрлргии получения
| t^wMore*,*, !
1 і* WtJpjp »
гибридом, способных продуцировать моноклональные AT, специфичные к одной антигенной детерминанте в неограниченных количествах Благодаря тщательному скринингу и отбору гибридомных клонов, участие моноклональных AT в перекрестных реакциях практически исключено, что объясняет высокую специфичность диагностических тест-систем на их основе, а также возможность их полноценной стандартизации.
Преимущества препаратов моноклональных AT перед поликлональными обусловлены, прежде всею, их уникальной гомогенностью и специфичностью Моноклональные AT, являясь продуктом одного клона гибридных клеток, абсолютно идентичны между собой и обладают способностью связывать только один эпитоп молекулы антигена, выявляя его в пикограммовых количествах. Очевидно, что эти свойства моноклональных AT окрывают новые перспективы не только в исследовании субмолекулярной структуры антигенов и эпитопов в частности, но и в разработке диагностических тест-систем [Price С Р 1998, Laurino JP, 1999; Воск JL 2000], а также в создании диагностических и лекарственных препаратов направленного типа действия [von Mehren М, 1996, Ер-enetosA.A., 2001, Carter Р, 2001; TrikhaM., 2002; deJongM., 2003].
Разработка способа получения моноклональных AT для каждого из НСБ, по сути дела, в каждом случае является самостоятельной научной проблемой, напрямую зависящей от природы антигена, его физико-химических свойств, клеточной локализации [Sterk М, 1999; Ross G W, 2003; Haghighi S, 2004]. Невозможно использовать ранее известные методические подходы, применяемые в целях получения гомогенных препаратов одного НСБ, для выделения других НСБ, различающихся по химической структуре и свойствам [Eng L, 2000, Herrmann М., 2003, Ingebrigtsen Т., 2003, Lamers KJ„ 2003; Verbeek MM, 2003, WelzlH, 2003; Pineda J А., 2004; BockE, 2004].
Очевидно, что при видимом однообразии методических приемов получения гибридных клеток к тому и или иному антигену, получение моноклональных AT к конкретному НСБ является самостоятельной научной и биотехнологической задачей
С другой стороны, получение моноклональных AT к нейроспецифиче-скому белку по-новому формирует стратегии повышения его гомогенности ну-
тем очистки методами иммуноафинной хроматографии, анализа в биологических жидкостях, фундаментального и прикладного исследования субмолекулярной структуры и функций НСБ. Особый фундаментальный интерес представляет собой возможность создания банка моноклональных AT для идентификации, биологического сравнения НСБ и стандартизации меюдов их детекции.
Очевидно, что разработка иммунохимических тест-систем анализа НСБ на основе соответствующих моноклональных AT открывает перспективы изучения метаболизма НСБ в норме и при патологии, анализа функций гематоэн-цефалического барьера (ГЭБ) при заболеваниях, сопровождающихся нарушением его резистентности, а также роли анти-НСБ-АТ в патогенезе нервно-психических заболеваний.
Самостоятельное значение могут иметь научные направления, исследующие возможности применения моноклональных анти-НСБ-АТ как транспортирующих векторов для доставки диагностических и лекарственных препаратов к клеткам мишеням нервной ткани.
Получить моноклональные анти-НСБ-антитела, исследовать функции ге-матоэнцефалического барьера с помощью иммунохимических тест-систем, разработанных на их основе, и оценить перспективы создания иммунолипосо-мальных систем транспорта к клеткам-мишеням нервной ткани.
В связи с этим были поставлены следующие ЗАДАЧИ:
-
Разработать способы получения препаратов GFAP, NSE и МВР, степень гомогенности которых удовлетворяет критериям чистоты белковьтх препаратов, необходимых для получения моноклональных антител и создания иммунофер-ментньгх систем анализа;
-
Разработать способы получения моноклональных AT к GFAP, NSE и МВР;
-
Разработать и апробировать в клинико-лабораторной практике иммунофер-ментные тест-системы анализа GFAP, NSE и МВР в биологических жидкостях на основе моноклональных AT, пригодные для практического здравоохранения;
-
Провести иммуноферментный скрининг GFAP, NSE и МВР в биологических жидкостях больных нервно-психическими, нейроонкологическими и со-
матическими заболеваниями, сопровождающимися нарушением проницаемое ГЭБ;
5 Провести сравнительный анализ иммуноферментных тест-систем определения исследуемых НСБ на основе поликлональных и моноклональных AT; 6. Изучиїь клеточную специфичность GFAP, NSE и МБР на срезах препаратов нервной ткани и культурах нейронов, астроцитов и олигодендроглиоцитов с применением тест-систем на основе моноклональных AT;
-
Исследовать проницаемость ГЭБ в направлении кровь-мозг для меченных I моноклональных анти-НСБ-АТ в норме и при экспериментальной ишемии головного мозга крыс.
-
Исследовать перспективы применения моноклональных анти-НСБ-АТ как векторов для направленного транспорта лекарственных и диагностических препаратов к клеткам-мишеням нервной ткани.
Разработанные способы очистки препаратов нейроспецифических белков (GFAP, NSE, MBP), позволили получить моноклональиые AT и создать имму-ноферментные и иммуногистохимические системы анализа НСБ в тканях и биологических жидкостях человека и животных
Модифицированная технология получения гибридных клеток на основе В-лимфоцитов селезенки мышей, предварительно иммунизированных очищенными препаратами НСБ (GFAP, NSE, MBP) и клетками миеломной линии Sp2/0 позволила получить моноклональиые AT к этим антигенам.
Впервые создан отечественный банк гомогенных препаратов нейроспецифических антигенов (GFAP, NSE, MBP) и моноклональных AT к ним, а также разработана стратегия их стандартизации
Впервые разработаны иммуноферментные тест-системы анализа GFAP, NSE, MBP в биологических жидкостях и тканевых экстрактах на основе моноклональных AT и проведена их стандартизация.
Впервые разработаны иммуногистохимические тест-системы, позволяющие высокоселективно визуализировать клетки нервной ткани, синтезирующие НСБ (GFAP, NSE, MBP).
Впервые осуществлена клинико-лабораторная апробация разработанных
иммуноферментных тест-систем анализа НСБ на основе моноклональных анш-НСБ-АТ в биологическом материале больных, в патогенезе заболеваний которых имеет место нарушение функций ГЭБ, а также проведен сравнительный анализ эффективности применения диагностических тест-систем на основе по-ликлональных и моноклональных AT.
Впервые в эксперименте выявлен феномен прорыва через ГЭБ и селективного накопления в ткани мозга меченных I125 анти-НСБ-АТ после их внутривенного введения при индуцированном гипоксически-ишемическом поражении головного мозга крыс. Подобный феномен не наблюдался в случае инъекции соответствующих препаратов животным с нормальным ГЭБ.
Впервые разработана технология создания ПЭГилированных иммунолипо-сомальных контейнеров направленного типа действия на основе моноклональных AT к GFAP и NSE, способных селективно захватываться лишь экспонированными на мембране антигенами соответствующих клеток-мишеней.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. 1 Создан отечественный банк стандартных гомогенных препаратов GFAP, NSE и МВР, степень гомогенности которых позволяет получать гибридные клетки, продуцирующие моноклональные AT к этим НСБ.
-
Разработана технология получения гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к GFAP, NSE и МВР; проведена их стандартизация и создан отечественный банк гибридом, продуцирующих вышеуказанные моноклональные AT.
-
Разработаны и внедрены в клинико-лабораторную практику иммунофер-ментные тест-системы анализа GFAP, NSE и МВР на основе моноклональных AT к ним. Проведена апробация этих тест-систем в клинико-лабораторной практике для комплексного обследования больных, в патогенезе заболеваний которых имеет место нарушение функций ГЭБ. Выработаны рекомендации по применению диагностических тест-систем анализа нейроспецифических антигенов на основе моноклональных AT в клинико-лабораторной практике.
4 Разработана технология получения ПЭГилированных иммунолипосомаль-ных контейнеров на основе моноклональных анти-НСБ-АТ, направленных к клеткам-мишеням нервной ткани.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ-
-
Разработанные способы очистки препаратов нейроспецифических белков (GFAP, NSE и МБР), позволяют применять их для получения гибридных клеток продуцирующих соответствующие моноклональные AT.
-
Модифицированная технология создания гибридных клеток на основе В-лимфоцитов селезенки мышей, предварительно иммунизированных очищенными препаратами НСБ (GFAP, NSE, MBP) и клеток миеломной линии Sp2/0, позволяет получать моноклональные AT к этим антигенам.
3 Полученные препараты НСБ (GFAP, NSE, MBP) и соответствующих мо-ноклональных AT дают возможность разработать на их основе иммунофер-ментные и иммуногистохимические тест-системы анализа GFAP, NSE и MBP, характеризующиеся общепринятыми стандартами параметров точности, воспроизводимости и надежности.
-
Иммуноферментный анализ НСБ на основе моноклональных AT в сыворотке крови и ликворе, может быть применен для диагностики, мониторинга и контроля эффективности проводимой терапий больных нервными, психическими, онкологическими, инфекционными и соматическими заболеваниями, сопровождающимися нарушением функций ГЭБ.
-
Дефинитивный гематоэнпефалический барьер непроницаем для препаратов меченных I125 анти-НСБ-АТ, введеных в кровоток. Гипоксически-ишемическое поражение головного мозга, индуцированное путем окклюзии ветви средней мозговой артерии, приводит к нарушению резистентности ГЭБ, сопровождающемуся феноменом прорыва и накопления в ткани мозга препаратов меченных I125 анти-НСБ-АТ. введеных в кровоток.
-
Разработанная технология получения ПЭГилированных иммунолипосом на основе моноклональных анти-НСБ-АТ позволяет создавать микрокошейне-ры направленного типа действия, способные селективно захватываться соответствующими антигенами мембран клеток-мишеней.
Результаты диссертационной работы применяются в клинике нервных болезней Российского государственного медицинского университета и НИИ невролог ии РАМН. Различные аспекты диссертационной работы явились основа-
ниєм для планирования новых научных тем, продолжающих данное научное направление.
Основные положения были представлены и обсуждены на VIII International Symposium on Recent Advances in Drug Delivery Systems, Salt Lake City, Utah, February 1997; III"rd European Meeting on glial cell function in health and disease, Greece, May 1998; 5 IBRO World Congress of Neuroscince, Jerusalem, Israel, 1999; IV European meeting on glial cell function in health and disease, Barcelona, may 2000; в материалах II Российского Конгресса по патофизиологии, Москва, 2000; XXII CINP Congress, Brussels, Belgium, July 2000; 3-rd International conference "Biological basis of individual sensitivity to psychotropic drugs", Suzdal, May 2001; I Neurotoxicity meeting- mechanisms for neurodegenerative disorders, March 2001, Pucon, Chile; International Conference of Neurochemistry, September 2001, Yerevan; V European Meeting on glial cell function in health and disease, Rome, Italy, May 2002; II Российской конференции «Нейроиммунопатология», Москва, май 2002 г. на семинаре "Актуальные проблемы современной психиатрии", Томск, декабрь 2002 г., на заседаниях Проблемного Совета по биологическим основам психиатрии ГНЦССП им. В.П.Сербскої о, 2000-2003; VI IBRO World Congress of Neuroscince, July 10-15, 2003, Prague, Czech Republic; VI European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease Germany, Berlin, 2003.
По теме диссертации опубликовано 46 печатных работ, результаты диссертации включены в монографию «Иммунохимический анализ нейрослецифи-ческих антигенов» Москва, Медицина, 2000.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ
