Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы . 17
1.1. Спирохеты Borrelia burgdorferi sensu lato как возбудитель иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ) . 17
1.1.1 . История открытия возбудителя ИКБ . 17
1.1.2. Эпидемиология иксодового клещевого боррелиоза 18
1.1.2.1. Географическое распространение возбудителя ИКБ . 18
1.1.2.2. Пути передачи Borrelia burgdorferi sensu lato . 22
1.1.3 Патогенез и клиника ИКБ 26
1.1.4. Механизмы уклонения спирохет Borrelia burgdorferi sensu lato от иммунной системы хозяина 31
1.2. Морфологические и генетические особенности спирохет комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato 36
1.3. Антигены спирохет комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato 38
1.3.1. Семейство внешних поверхностных протеинов (Osp) . 39
1.3.2. Декорин-связывающие белки (Dbp) . 41
1.3.3. Флагеллярные белки (Fla) . 42
1.3.4. Белок Р83 . 43
1.3.5. Белок Р66 . 44
1.3.6 . Семейство основных мембранных белков (Вмр) 44
1.3.7. Белок P35 . 45
1.4. Диагностика ИКБ . 46
1.4.1. Обнаружение спирохет Borrelia burgdorferi sensu lato в биологических образцах методом культивирования на питательных средах . 46
1.4.2. ДНК-диагностика ИКБ 47
1.4.3. Серодиагностика ИКБ . 48
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований . 55
2.1. Реактивы, реагенты и прочие материалы . 55
2.2. Методы работы с ДНК . 57
2.2.1. Получение суммарного препарата ДНК из клещей . 57
2.2.2. Получение суммарного препарата ДНК из культур боррелий... 58
2.2.3. Выделение плазмидной ДНК из E.coli 58
2.2.4. Быстрое выделение плазмидной ДНК из колоний E.coli 58
2.2.5. Электрофорез ДНК в агарозных и полиакриламидных гелях . 58
2.2.6. Выделение ДНК из агарозного геля методом сорбции на мелкодисперсном оксиде кремния «Силика» . 59
2.2.7. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 59
2.2.8. Лигирование фрагментов ДНК с использованием ДНК-лигазы бактериофага T4 . 59
2.2.9. Амплификация ДНК в системе ПЦР . 60
2.3. Методы работы с бактериями 61
2.3.1. Используемые среды и общие приемы . 61
2.3.2. Изоляция спирохет B.burgdorferi s.l. из клещей . 62
2.3.3. Изоляция спирохет B.burgdorferi s.l. с помощью заражения мышей 62
2.3.4. Обнаружение ДНК боррелий в культуре и генотипирование изолятов с помощью ПЦР . 63
2.3.5. Обнаружение ДНК боррелий в клещах и генотипирование изолятов с помощью ПЦР 64
2.3.6. Трансформация компетентных клеток E.coli . 64
2.4. Индукция экспрессии клонированных генов боррелий в клетках E.coli 64
2.4.1. Индукция экспрессии генов, клонированных в составе вектора pREB-SAT, либо в его производных 64
2.4.2. Индукция экспрессии генов, клонированных в клетках E.coli в составе вектора рЕТm
2.5. Анализ белков методом электрофореза в ПААГ . 65
2.6. Очистка рекомбинантных белков аффинной хроматографией на никель-хелатном сорбенте 65
2.7. Исследование антигенных свойств рекомбинантных белков боррелий . 66
2.7.1. Используемые сыворотки 66
2.7.2. Твёрдофазный иммуноферментный анализ 67
2.8. Определение первичной структуры фрагментов ДНК, сравнение аминокислотных последовательностей . 69
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 71
3.1. Получение изолятов Borrelia burgdorferi s.l. и определение их геновидовой принадлежности 71
3.1.1. Культивирование спирохет Borrelia burgdorferi s.l., выделенных из клещей 71
3.1.2 . Культивирование спирохет Borrelia burgdorferi s.l. с помощью заражения лабораторных мышей . 72
3.2. Оценка зараженности клещей Ixodes persulcatus, населяющих рекреационную зону Новосибирского научного центра, спирохетами B.burgdorferi s.l 73
3.3. Конструирование векторов для экспрессии рекомбинантных белков клетках E.coli 77
3.3.1. Клонирование гена gfp в E.coli в составе вектора pREB 80
3.3.2. Конструирование плазмиды pREB3 . 81
3.3.3. Конструирование плазмиды pRAC 81
3.3.4. Конструирование вектора pRAC3 86
3.4. Выбор генов спирохет Borrelia burgdorferi s.l. для клонирования в E.coli в составе экспрессирующих векторов . 88
3.5. Амплификация кодирующих областей генов ospC, ospA, flaA, flaB и dbpB B.garinii 20047T и ospC B.afzelii, подготовка к клонированию . 90
3.6. Клонирование генов ospC и ospA в составе вектора pRAC3 91
3.7. Модификация коммерческого вектора pET36b(+) 93
3.8. Клонирование кодирующих областей генов flaA, flaB и dbpB в составе вектора рЕТm 97
3.9. Переклонирование кодирующих областей генов ospA, ospC и flaA в составе вектора pETm 98
3.10. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей полученных рекомбинантных белков FlaA, FlaB, DbpB, OspA, OspC B.garinii группы 20047Т и OspC B.afzelii . 100
3.10.1. Сравнительный анализ последовательностей антигена FlaA... 101
3.10.2. Сравнительный анализ последовательностей антигена FlaB 101
3.10.3. Сравнительный анализ последовательностей антигена DbpB.. 102
3.10.4. Сравнительный анализ последовательностей антигена OspA.. 102
3.10.5. Сравнительный анализ последовательностей антигена OspC B.afzelii (изолят NSK-05-06) . 103
3.10.6 Сравнительный анализ последоваетльностей антигена OspC B.garinii группа 20047Т (изолят NSK-10-06) . 103
3.11. Получение и очистка рекомбинантных белков 104
3.12. Оценка иммунореактивности рекомбинантных белков в ИФА с сыворотками больных иксодовым клещевым боррелиозом 108
3.12.1. Определение оптимальной концентрации антигена 108
3.12.2. Анализ иммунореактивности рекомбинантных антигенов боррелий в ИФА с сыворотками больных ИКБ 109
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 113
Заключение . 127
Выводы 128
Список литературы . 129
Приложение . 156
- . История открытия возбудителя ИКБ .
- . Семейство основных мембранных белков (Вмр)
- Получение суммарного препарата ДНК из клещей
- . Культивирование спирохет Borrelia burgdorferi s.l. с помощью заражения лабораторных мышей
Введение к работе
По морфологическим и генетическим признакам различают 13 геновидов спирохет комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.) (Baranton et al, 1998), относящихся к семейству SPIROCHAETACAE. Этиологическая роль спирохет этого комплекса как инфекционных агентов, переносимых клещами рода Ixodes была установлена в 1982 г. американскими исследователями и была названа «болезнью Лайма» (Steere, 2006). В нашей стране это природноочаговое трансмиссивное заболевание получило название «иксодового клещевого боррелиоза» (ИКБ). Три геновида этого комплекса являются патогенными для человека (Wang et al, 1999) и три условнопатогенными (Richter et al, 2006; Hofmann, 2005; Stanek and Strle, 2003; Hengge et al, 2003). По широте распространения и уровню заболеваемости ИКБ занимает одно из ведущих мест среди природно-очаговых заболеваний. Ареал инфекции простирается по всей Северной Америке, Европе, России, Японии, Китае (Stanek, 2003).
Отличия в генетической структуре патогенных геновидов боррелий, обусловливают полиморфизм клинических проявлений и органных поражений человека. Основные симптомы ИКБ сходны во всем мире, но есть и региональные отличия. В первую очередь между болезнью, обнаруженной в Америке и вызываемой исключительно геновидом В.burgdorferi sensu stricto (s.s.) с характерными проявлениями артрита, и болезнью, обнаруженной в Европе. В Европе болезнь вызывается, прежде всего, геновидами B.garinii возбудителем, характеризующимся нейротропностью и B.afzelii, поражающим часто только кожу с развитием акродерматитов. При отсутствии своевременного лечения, инфекции переходят в хроническую форму.
В виду разнообразия клинических проявлений заболевания, для подтверждения диагноза используют дополнительные лабораторные методы, среди которых широкое распространение получили методы, основанные на выявление антител к возбудителю. Основным методом, позволяющим быстро и относительно достоверно диагностировать ИКБ, является имунноферментный анализ, однако и он не дает 100% надежности результатов. Поэтому в Европе и США диагностику иксодового клещевого боррелиоза (болезнь Лайма) осуществляют в 2 стадии: скрининговый ИФА с последующим подтверждающим иммуноблотом. Этот вариант представляется трудоемким и протяженным во времени, требует специально оборудованных лабораторий для постановки иммуноблотов и соответствующего персонала. Однако генетическое разнообразие В.burgdorferi s.l., обусловливающее характер течения болезни и различные клинические проявления ставит перед исследователями задачу распознавания конкретного геновида возбудителя. Зачастую, чтобы назначить адекватное лечение пациентам, также необходимо знать стадию болезни. Все это предполагает наличие богатого арсенала информативных методов диагностики заболевания.
Актуальность исследования
Используемые для серологической диагностики белки североамериканских и западноевропейских изолятов боррелий, такие как внешние поверхностные липопротеины, флагеллярные белки, основные мембранные белки, декорин-связывающие белки и некоторые другие хорошо изучены и описаны. Однако, практически отсутствует информация об аминокислотных последовательностях и иммунохимических свойствах антигенов спирохет комплекса В. burgdorferi s.l. распространенных на территории азиатской части России. Генетическое и антигенное разнообразие изолятов боррелий на меж- и внутривидовом уровнях, вследствие сравнительно высокой вариабельности антигенов, затрудняет разработку эффективных методов серодиагностики ИКБ. Большая протяженность территории России с запада на восток позволяет предполагать, значительное отличие антигенов в изолятах циркулирующих на этой территории. Можно предположить, что такие отличия аминокислотных последовательностей антигенов будут обусловливать и их иммунохимические свойства. Все эти причины сдерживают развитие работ по созданию высокоспецифичных и чувствительных методов диагностики иксодового клещевого боррелиоза, что, в свою очередь, остается важной задачей здравоохранения.
Цель работы - получение рекомбинантных иммунодоминантных белков западносибирских изолятов В. burgdorferi s.l. и сравнительное исследование их первичных структур и антигенных свойств.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Оценить зараженность клещей Ixodes persulcatus Shulze, населяющих рекреационную зону Новосибирского Научного Центра, различными геновидами спирохет В. burgdorferi s.l.
2. Получить культуры западносибирских изолятов В. burgdorferi s.l.
3. На основе анализа литературных данных выбрать в качестве объектов исследования белки спирохет B.burgdorferi s.l. наиболее перспективные для создания средств серодиагностики ИКБ.
4. Сконструировать экспрессирующие плазмидные векторы, пригодные для получения в клетках E.coli рекомбинантных белков боррелий и их последующей аффинной очистки.
5. Клонировать кодирующие области генов выбранных иммунодоминантных белков B.burgdorferi s.l. в клетках E.coli в составе экспрессирующих векторов.
6. Определить нуклеотидные последовательности клонированных генов спирохет B.burgdorferi s.l. и исследовать гомологию соответствующих им белков с опубликованными в базе данных GeneBank аналогичными белками боррелий.
7. Получить очищенные рекомбинантные белки западносибирских изолятов B.burgdorferi s.l. и исследовать их антигенные свойства методом ИФА на сыворотках больных ИКБ.
8. Оценить пригодность каждого из рекомбинантных антигенов боррелий для серодиагностики локализованной и диссеминированной стадий ИКБ.
Научная новизна работы
Исследована зараженность клещей Ixodes persulcatus Shulze, отловленных в рекреационной зоне ННЦ в 2003, 2005, 2006 и 2008 годах, различными геновидами спирохет В. burgdorferi s.l. Отмечены зависимые от года наблюдений колебания в количестве инфицированных спирохетами особей (20% - 32%). Установлено, что только два геновида боррелий циркулировали до 2006 г. в популяции иксодовых клещей на обследованной терриртории — B.garinii и B.afzelii, с доминирующим преобладанием первого (70%-80%), включающего представителей двух геномных групп: NT29 и 20047. В 2006 и 2008 г.г. в нескольких особях клещей обнаружены спирохеты геновида В. japonica.
Сконструированы оригинальные бактериальные экспрессирующие вектора pRAC и pRAC3, содержащие химерные регуляторные районы, полилинкер для клонирования генов и участки, кодирующие олигогистидиновые последовательности в С-концевой области рекомбинантных белков. Штаммы E.coli, несущие полученные векторы обеспечивают трёхкратное увеличение синтеза белка GFP по сравнению с клетками, содержащими исходный экспрессирующий вектор pREB.
Определены нуклеотидные последовательности кодирующих областей генов flaA, flaB, ospC, ospA и dbpB западносибирского изолята B.garinii, группы 20047і И гена ospC западносибирского изолята B.afzelii; выведены соответствующие этим генам аминокислотные последовательности белков. Нуклеотидные последовательности выше названных генов депонированы в электронную международную базу данных генетической информации GenBank под инвентарными номерами: EU979631.1, EU979630.1, EU979629.1, EU979628.1, EU979626.1 HEU979627.1.
На основе сравнения аминокислотных последовательностей антигенов FlaA, FlaB, OspC, OspA и DbpB спирохет В. burgdorferi s.l., представленных в базе данных GeneBank (декабрь 2008 г.) и установленных в настоящей работе, показано, что западносибирский изолят B.garinii группа 20047 (NSK-10-06, музейный штамм №10) филогенетически близок изолятам B.garinii, выделенным в Европе. Исследованы антигенные свойства рекомбинантных белков FlaA, FlaB, OspC, OspA и DbpB методом ИФА в экспериментах с сыворотками от больных ИКБ и здоровых доноров. Продемонстрирована перспективность использования названных рекомбинантных белков для серодиагностики ИКБ. Предложена комбинация рекомбинантных антигенов для выявления антител к возбудителям ИКБ в крови больных, как с локализованной, так и с диссеминированной стадиями заболевания.
Практическая значимость работы
Полученные в настоящей работе данные о зараженности клещей Ixodes persulcatus, отловленных в рекреационной зоне ННЦ в 2003, 2005, 2006 и 2008 годах, различными геновидами спирохет В.burgdorferi s.l. могут быть использованы для прогнозирования эпидемической ситуации по ИКБ и возможных клинических проявлений заболеваний.
Создана музейная коллекция западносибирских изолятов B.burgdorferi s.l. распространенных на территории Новосибирской области и определена их геновидовая принадлежность. Коллекция включает 2 изолята B.afzelii, 14 изолятов B.garinii, 7 образцов смеси изолятов B.afzelii и B.garinii. Культуры полученных изолятов боррелий могут быть использованы в качестве посевного материала для культивирования и наработки биомассы спирохет и решения исследовательских и прикладных задач.
Сконструированы векторы pRAC и pRAC3 пригодные для клонирования и эффективной индуцируемой экспрессии генов в клетках E.coli. Штаммы E.coli, содержащие в составе этих векторов экспрессируемые гены флюоресцирующих белков, могут применяться в химической, фармацевтической, пищевой промышленности и в экологическом мониторинге окружающей среды в качестве цельноклеточных биосенсоров для обнаружения генотоксикантов в исследуемых образцах.
Сконструированные штаммы E.coli - продуценты рекомбинантных белков FlaA, OspC, OspA, DbpB и FlaB, специфичных для геновидов B.garinii (группа 20047і), и OspC B.afzelii, могут быть использованы в качестве источников получения соответствующих антигенов боррелий. Разработана технология получения рекомбинантных белков B.burgdorferi s.l. с помощью экспрессии соответствующих им генов в составе сконструированного вектора pRAC3 и модифицированного в настоящей работе лектора pET36b(+) (рЕТт) в клетках E.coli (шт. BL21(DE3) и Rosetta 2) и последующей аффинной очистки рекомбинантных полипептидов на металло-хелатных сорбентах.
Полученные в настоящей работе рекомбинантные антигены FlaA, FlaB, OspC, OspA и DbpB могут быть использованы в серодиагностике ИКБ, вызываемого спирохетами B.burgdorferi s.l., циркулирующими на азиатской территории России.
Положения, выносимые на защиту
1. В рекреационной зоне Новосибирского научного центра в период с 2003 по 2008 г.г. в популяции клещей Ixodes persulcatus Schulze циркулировали только три геновида боррелий — B.garinii, B.afzelii и B.japonica с доминирующим преобладанием B.garinii (более 75%). Заражённость иксодовых клещей боррелиями составляла, в зависимости от года наблюдений, 20% - 32%.
2. Западносибирский изолят B.garinii группы 20047 (NSK10-06, музейный штамм №10) филогенетически близок боррелиям, изолированным на территории Европы.
3. Сконструированные плазмидные векторы pRAC, pRAC3 и модифицированный в настоящей работе вектор pET36b(+) (рЕТт) являются эффективными системами для экспрессии клонируемых в их составе генов в клетках Е. coli.
4. Штамм E.coli, содержащий в составе плазмиду pRAC может применяться в качестве цельноклеточного биосенсора для обнаружения генотоксикантов.
5. По результатам исследований антигенных свойств рекомбинантных белков FlaA, FlaB, OspC, OspA и DbpB, данные белки могут быть рекомендованы для серодиагностики ИКБ. Апробация работы и публикации
Материалы диссертации изложены в 13-ти публикациях и одном патентном документе, доложены на ученом совете НИИ биохимии СО РАМН.
1. Рябченко А.В., Ивлева И.Н., Беклемишев А.Б. Комплексная оценка зараженности клещей Ixodes persulcatus, распространённых в рекреационной зоне новосибирского научного центра, спирохетами Borrelia burgdorferi s.l. II Журнал инфекционной патологии. - 2004. - Т. 11. - № 3-4. - С. 107-110.
2. Рябченко А.В., Терехова Д.В., Ивлева И.В., Бирюков А.Ю., Беклемишев А.Б. Выделение и типирование западно-сибирских изолятов боррелий, возбудителей иксодового клещевого боррелиоза // Тезисы докладов Международного мультидисциплинарного конгресса «Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека». - 2004. - Судак, Украина. - С. 141-142.
3. Рябченко А.В. Получение западно-сибирских культур Borrelia burgdorferi s.l. II Аспирантский сборник НГПУ 2004. - Новосибирск: Изд. НГПУ. - 2004. - Ч. 2.-С. 160-168.
4. Рябченко А.В., Караваев B.C., Ивлева И.Н., Терехова Д.В., Беклемишев А.Б. Оценка пригодности ряда антигенов сибирских изолятов Borrelia burgdorferi sensu lato для диагностики иксодового клещевого боррелиоза // Тезисы докладов Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний». — 2004. — Новосибирск, Россия. - С. 272.
5. Рябченко А.В., Беклемишев А.Б. Оценка зараженности клещей Ixodes persulcatus, отловленных весной 2005 г. в рекреационной зоне Новосибирского научного центра, спирохетами Borrelia burgdorferi s.l. II Журнал инфекционной патологии.-2005.-Т. 12.-№3-4.-С. 109-110.
6. Рябченко А.В., Беклемишев А.Б., Ивлева И.Н. Конструирование вектора для эффективной экспрессии генов в клетках E.coli II Материалы третьего Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития". - М: ЗАО "Экспо-биохим-технология", РХТУ им. Д.И. Менделеева. - 2005. - Ч. 1. - С. 99-100.
7. Рябченко А.В., Караваев B.C., Беклемишев А.Б. Получение рекомбинантных форм некоторых иммунодоминантных белков западносибирских изолятов возбудителя Лайм-боррелиоза и оценка их диагностической значимости // Материалы московской международной конференции «Биотехнология и медицина». - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технология», РХТУ им. Д.И. Менделеева. - 2006. - С. 55.
8. Лавриненко И.А., Лавриненко В.А., Рябченко А.В., Беклемишев А.Б. Создание биосенсорной тест-системы для детекции повреждений ДНК путем использования репортерного белка GFP // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - Т. 141. - № 1. - С. 38-40.
9. Рябченко А.В., Беклемишев А.Б. Мониторинг заражённости клещей рекреационной зоны г. Новосибирска возбудителями Лайм-боррелиоза // Вестник НГУ. - 2007. - Т. 5. - С. 106-110.
10. Лавриненко И.А., Рябченко А.В., Беклемишев А.Б. Создание цельно-клеточной биосенсорной тест-системы для обнаружения генотоксических воздействий на клетку // Вестник НГУ. - 2007. - Т. 5. - С. 95-99.
11. Рябченко А.В., Лавриненко И.А., Беклемишев А.Б. Рекомбинантная плазмидная ДНК для обнаружения агентов, повреждающих генетический аппарат клетки (варианты) // Патент РФ № 2311459 от 27.11.2007.
12. Караваев B.C., Иванов И.Д., Рябченко А.В. Оценка иммунореактивности рекомбинантных белков OspC и фрагмента FlaB (f-FlaB) Borrelia garinii NT29 в экспериментах с сыворотками больных Лайм-боррелиозом // Бюллетень СО РАМН. - 2007. - № 5. - С. 53-57.
13. Рябченко А.В., Мамаев А.Л. Инфицированность клещей Ixodes persulcatus, отловленных весной 2006г. в лесопарковой зоне новосибирского академгородка // Бюллетень СО РАМН. - 2007. -№ 5. - С. 58-61.
14. Караваев B.C., Иванов И.Д., Рябченко А.В., Беклемишев А.Б. Получение рекомбинантных белков OspC и фрагмента FlaB (f-FlaB) западно-сибирских изолятов Borrelia garinii NT29 и исследование их свойств // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. — 2008. — № 1. — С. 18-22.
. История открытия возбудителя ИКБ .
История изучения ИКБ насчитывает более 100 лет, когда впервые были описаны некоторые проявления этого заболевания. Однако до установления точной связи заболеваний с укусами клещей эти изучения носили лишь описательный характер. Впервые сообщение о клещевом боррелиозе как о нозологической форме инфекции появилось в 1975 г, когда А. Стир описал вспышку юношеских ревматоидных артритов в городке Лайм штата Коннектикут (США), и связал начало развития заболевания с укусами иксодовых клещей (Ixodes damini). По названию города, где проводились исследования, заболевание стали называть болезнью Лайма (Steere et al, 1977). В 1982 г. В. Бургдорфер впервые выделил от клещей оригинальные спирохетоподобные микроорганизмы, представляющие собой новый вид из рода Borrelia, которые в последующем получили свое видовое название в честь первооткрывателя – Borrelia burgdorferi (Burgdorfer et al, 1982). Позднее, по отличиям в нуклеотидных последовательностях ДНК возбудителя, выделили 13 геновидов боррелий, которые объединены в комплекс под названием Borrelia burgdorferi sensu lato (Baranton et al, 1998). Совсем недавно коллективом американских ученых в мелких грызунах в юго-восточной области США была обнаружена новая группа спирохет, близкая к комплексу B.burgdorferi sensu lato, однако, обособленная в отдельную группу по нуклеотидному анализу ряда генов (Rudenko et al., 2009). Пока неизвестно, является ли эта группа спирохет патогенной для человека, однако авторы уже предложили обнаруженную группу выделить как отдельный 14-й геновид спирохет комлекса B.burgdorferi s.l. и присвоить название этому геновиду Borrelia carolinensis. В России целенаправленные исследования по изучению ИКБ начали проводиться с 1984 г. (Э.И. Коренберг, В.Н. Крючечников, Е.П. Деконенко, К.Г. Уманский и др.). В настоящее время под иксодовыми клещевыми боррелиозами (синонимы: Лайм-боррелиоз, иксодовый клещевой боррелиоз, болезнь Лайма) понимают группу инфекционных трансмиссивных природноочаговых заболеваний, вызываемых боррелиями группы B.burgdorferi s.l. и передающихся иксодовыми клещами (Steere, 2006).
Иксодовый клещевой боррелиоз встречается не только в Северной Америке, но также природные очаги широко распространены на территориях Европы, России, Китае, Японии; встречаются в Африке и Австралии (Stanek, 2003). В США основными переносчиками являются пастбищные клещи Ixodes scapularis (старое видовое название I.dammini), меньшее значение имеют I.pacificus. Сруктура заболевания в США носит бимодальный характер и состоит из двух пиков, первый из которых приходится на детский период с 5 до 14 лет (MMWR , 2004). В Европе доминирующим переносчиком является Ixodes ricinus (Barbour and Fish, 1993). За прошедшие два десятилетия было опубликовано много исследований о распространении спирохет B.burgdorferi s.l. на территории Европы и их генетической изменчивости (Alekseev et al, 2001; Casati et al, 2004; Christova et al, 2001; Derdkov et al, 2003; De Michelis et al, 2000; Etti et al, 2003; Kampen et al, 2004; Kosik-Bogacka et al, 2004; Wodecka and Skotarczak, 2005). Стало понятно, что болезнь Лайма присутствует на территории всей Европы, кроме «горячего» юга (Сицилия, Южная Испания) и холодного севера (Северная Скандинавия и Северная Россия) (Weber, 2001).
Географическое распределение геновидов B.burgdorferi s.l. в Европе является неоднородным. В обзорной статье Hublek и Halouzka (Hublek and Halouzka, 1997), представлена информация о 1263 изолятах B.burgdorferi s.l. из 26 европейских стран. 501 изолят был классифицирован как B.garinii (39,7%), 469 как B.afzelii (37,1%), 201 - как B.burgdorferi s.s. (15,9%), 85 - как B.valaisiana (6,7%) и 7 - как B.lusitaniae (0,6%). В настоящее время границы областей распределения каждого геновида неоднократно пересматриваются в результате увеличения числа исследований распространения боррелий. B.garinii и B.afzelii, поочередно выступают как доминирующие геновиды в большинстве обследованных европейских стран (Casati et al, 2004; Derdkov et al, 2003; Etti et al, 2003; Hublek and Halouzka, 1997; Kurtenbach et al, 2001); однако, распределение геновидов Borrelia может изменяться даже на относительно маленьких территориях, изменения носят также временной характер (Etti et al, 2003; Hanincov, 2002; Hanincov et al, 2003). Частота встречаемости боррелий в клещах I.ricinus из Восточной Словакии была исследована за 10-летний период Pet ko и др., (Pet ko et al, 1996). За этот период средняя зараженность клещей составила 12,7%. Зараженность колебалась в пределах 2,1-41,7%. Десятилетнее исследование показало значительное локальное колебание зараженности клещей год от года, с увеличением зараженности в течение 3-5 лет. О B.burgdorferi s.s. ранее сообщали, главным образом, из западноевропейских стран, с редкой изоляцией штаммов или обнаружением в Восточной Европе (Hublek and Halouzka, 1997; Postic et al, 1997). Однако, дальнейшие исследования показали наличие B.burgdorferi s.s. в клещах I.ricinus в Чешской республике (Danielova et al, 2004; Derdkov et al, 2003), Словацкой республике (Gern et al, 1999; Kurtenbach et al, 2001), Польше (Stanczak et al, 2004; Wodecka and Skotarczak, 2005), Болгарии (Christova et al, 2001) и России (Alekseev et al, 2001; Масузава и др, 2001).
В Евразии наиболее эффективным переносчиком возбудителя ИКБ является таёжный клещ Ixodes persulcatus, голодные особи могут содержать боррелии в слюнных железах и передавать их сразу после укуса (Алексеев и др., 2001). Причем, к этому способны взрослые, имагинальные формы клещей, их нимфы и даже личинки величиной 2-3 мм, присасывание которых человек часто не замечает. Клещ I.persulcatus на всех стадиях развития отличается высоким уровнем зараженности боррелией. В среднем в ареале России инфицировано 30-60% клещей (Алексеев и др., 1993). Недавно в литературе была опубликована работа обширного исследования ученых Омского НИИ природно-очаговых инфекций Роспотребнадзора, где исследователи проанализировали 271 экземпляр клещей Dermacentor reticulates и выявили зараженность этого вида спирохетами B.burgdorferi s.l. в 23,1%. Кроме того, исследователи наблюдали двух больных непосредственно после укусов клещей D.reticulates. У обоих пациентов наблюдалась характерная для ИКБ клиника, а возбудителями являлись спирохеты геновида B.garinii (Рудакова и др., 2007). Данные, полученные этой группой ученых, подтверждают возможность заражения человека ИКБ через клещей рода Dermacentor, а высокий уровень зараженности этого вида клещей ставит этих переносчиков на один уровень с I.persulcatus.
Из 13 геномных групп боррелий однозначно доказана патогенность для человека трёх геновидов, которые распространены в эндемичных регионах мира неравномерно (Wang et al, 1999). В США только Borrelia burgdorferi s.s. является патогенным, в то время как в Европе найдены различные патогенные геновиды, включающие: B.afzelii, B.garinii, и B.burgdorferi s.s. (Schaarschmidt et al, 2001; Lnemann et al, 2003). В Европе была предпринята попытка классификации этих трех патогенных для человека геновидов на основе серотипования к OspA антигену, в результате было описано семь различных OspA серотипов (Wilske et al, 1993b). Сравнительно недавно, были описаны новые патогенные для человека геновиды: B.spielmanii, обнаруженная в биопсии кожи пациента с мигрирующей эритемой из Нидерландов (Wang G, van Dam AP & Dankert , 1999a; Richter et al, 2006); B.lusitaniae и B.valaisiana в редких случаях являющиеся патогенными для человека (Hofmann, 2005; Stanek and Strle, 2003; Hengge et al, 2003). Штаммы боррелий B.afzelii and B.garinii были обнаружены в Азии, позднее были найдены отличия генетической структуры, однако, микроорганизмы также переносятся клещами I.persulcatus (Masuzawa, 2004). В литературе появились совсем новые данные о том, что спирохеты, сходные с боррелиями копмлекса B.burgdorferi s.l., были обнаружены в клещах Ixodes granulatus на острове Кинмэн (Kinmen) Китайской провинции Тайвань (Chao et al., 2009). Эти данные заставляют пересмотреть устаявшиеся представления о географическом распространении спирохет комплекса B.burgdorferi s.l.
. Семейство основных мембранных белков (Вмр)
Семейство Вмр (basic membrane proteins) включает в себя четыре гомологичных липопротеина (A, B, C, D) с неизвестными функциями. Матричная РНК, соответствующая всем четырем белкам, обнаруживается в культивированных боррелиях. Aнтитела против BмрА, BмрС и BмрD обнаруживаются у инфицированных млекопитающих, в том числе у человека. ВмрА и BмрС обнаружены в B. garinii и B. afzelii (Gorbacheva et al., 2000).
Наиболее сильный иммунный ответ вызывает BмрА (Р39), белок в зрелом виде состоит из 310 а.о. и вместе с липидной частью имеет молекулярную массу около 39 кДа. Наряду с флагеллярными белками является одним из наиболее консервативных иммунодоминантных белков B. burgdorferi s.l. Степень гомологии его аминокислотной последовательности в пределах группы B.burgdorferi s.l. составляет от 86% до 91%. При этом нуклеотидные последовательности соответствующие B. garinii и B. afzelii значительно более сходны между собой. ВмрА вызывает сильный гуморальный иммунный ответ в виде появления в сыворотках больных специфичных IgG (не менее 35% всех сывороток), IgM к ВмрА присутствуют в невысоком титре (от 1% до 8% сывороток). ВмрА из B.garinii и B.afzelii являются более сильными антигенами, чем ВмрА из B.burgdorferi s.s. (Roessler et al., 1997). Новые литературные данные показывают корреляцию экспрессии генов bmpA и bmpB со степенью тяжести Лайм-артрита (Pal et al., 2008). Это позволяет рассматривать BmpA и BmpB как потенциальные маркеры поздних стадий ИКБ, протекающих с преимущественным поражением суставов.
Белок P35 является кодируемым в хромосоме липопротеином с расчетной массой 34.3 кДа. Ген белка Р35 присутствует во всех трех основных геновидах боррелии: B.burgdorferi s.s., B. garinii и B.afzelii. Открытая рамка считывания P35 состоит из 909 п.н., и начинается с необычного инициирующего кодона – TTG, обнаруженного в боррелиях еще только в одном случае - bmpC (Indest et al., 2000). Промотрный участок гена содержит каноническую, АТ-богатую последовательность. За геном р35 через небольшой промежуток находится открытая рамка считывания для иммуногенного липопротеина массой 7.5 кДа. По всей видимости, в данном случае происходит альтернативная трансляция, приводящая к трем возможным белковым продуктам, это предположение подтверждается обнаружением всех трех белков в лизированных клетках боррелий. Такая же картина наблюдается и при иммуноблоттинге лизатов боррелий (Fikrig et al., 2000).
Белок Р35 вызывает сильный иммунный ответ уже на ранних стадиях развития ИКБ. При переходе болезни в хроническую форму снижается как интенсивность иммунного ответа на Р35, так и частота обнаружения соответствующих белку полос при иммуноблоте с использованием сыворотки пациентов. В отличие от большинства других иммунодоминантных антигенов B.burgdorferi s.l. (например, OspC или FlaB), гуморальный иммунный ответ на р35 формируется в основном из IgG. IgM к Р35 обнаруживаются примерно в трети случаев на стадии мигрирующей эритемы и раннем артрите, а IgG на этих стадиях примерно у 80% больных (Akin et al., 1999). 1.4. Диагностика ИКБ
Диагностика иксодового клещевого боррелиоза прошла свой путь развития от классических методов прямого культивирования возбудителя на питательных средах до обнаружения возбудителя с помощью косвенных методов, основанных на определении антител к антигенам возбудителя. Последние методы в настоящее время получили широкое распространение ввиду их наибольшей чувствительности и специфичности. Таким образом, на тесты антител к В.burgdorferi s.l. имеется высокий спрос, даже в микробиологических лабораториях.Обнаружение спирохет В.burgdorferi sensu lato в биологических образцах методом культивирования на питательных средах
Одним из вариантов получения диагноза на боррелиоз, является культивирование возбудителя на модифицированной среде BSK (Preac-Mursic et al, 1991; Wilske and Schriefer, 2003), с последующим выявлением микроорганизмов с помощью световой (в том числе, маркирование специфическими моноклональными антителами) или электронной микроскопии. Для выращивания культур обычно используют образцы биопсии кожи, поскольку в них наблюдается наибольшая концентрация микроорганизмов по сравнению с другими образцами: кровь, сыворотка, моча. Как уже упоминалось ранее, выращивание боррелий – это очень продолжительный по времени метод, характеризующийся низкой чувствительностью (Strle, 1999; Arnez rt al, 2001; Zore et al, 2002). Ввиду ряда особенностей и сложностей этого метода (гетерогенность патогенных штаммов, специальные условия, дорогостоящая среда, продолжительность по времени, квалификация персонала, а главное, низкая эффективность), культивирование микроорганизмов возбудителя используют в индивидуальных случаях. В частности, в тех случаях, когда клиническая картина заболевания пациента предполагает, что у него, несмотря на отрицательной анализ антител на Лайм-боррелиоз, например, в нетипичной мигрирующей эритеме, все же подозревается острый нейроборрелиоз без обнаружения интратекальных антител или Лайм-боррелиоз с иммунодефицитной формой (Wilske et al, 2007). В целом же этот метод признан малоэффективным для диагностических целей, его использование должно быть ограничено лабораториями, занимающимися исследованиями в данных направлениях (Wilske et al, 2007). 1.4.2. ДНК-диагностика ИКБ
В литературе было опубликовано множество методов ДНК-диагностики ИКБ с использованием в качестве последовательностей-мишеней плазмидных генов ospA и ospB, хромосомных генов флагеллярных белков, белка Р66 (клон 2H1), сегмента гена 16 rRNA или межгенной области 5S/23S rRNA (Schmidt, 1997). Однако, обширные сравнительные исследования, показали, что надежного метода обнаружения ДНК боррелий с помощью ПЦР все еще не существует. Прежде всего, это связано с низкой диагностической чувствительностью метода, обусловленной отсутствием или очень низким содержанием возбудителя в крови. Кроме того, метод ПЦР должен позволять определять геновид боррелии, то есть медицинский отчет должен содержать информацию о том, какой из трех (а учитывая последние данные – шести) патогенных для человека геновидов боррелии был обнаружен в исследуемом образце. В целом, диагностическая чувствительность ПЦР примерно такая же, как и при прямом культивировании боррелий (Wilske et al, 2007).
Наилучшими объектами для выделения ДНК спирохет из инфицированных людей и последующего использования в ПЦР признаны образцы синовиальной ткани и биоптаты кожи в районе присасывания клеща (Jaulhac, 1996). В жидкостях тела, таких как сыворотка, моча, спинномозговая или синовиальная жидкость концентрация возбудителя слишком мала, и использование этих образцов для ДНК-диагностики не рекомендуется, так же как и ПЦР-анализ клещей, снятых с пациентов (Brettschneider, 1998). Анализ клещей должен проводиться только для эпидемиологических и других научных исследований (Wilske et al, 2007).
Результаты ПЦР зависят не только от образца, но и от формы протекания инфекции. Так, к примеру, прямое культивирование боррелий и ПЦР имеют самые высокие частоты обнаружения (50-70 %) в биопсиях кожи от пациентов с мигрирующей эритемой или хроническим атрофическим акродерматитом (van Dam et al, 1993; von Stedingk et al, 1995; Zore et al, 2002). В противоположность этому, спирохеты В.burgdorferi s.l. обнаруживаются с помощью ПЦР или культивирования образцов спинномозговой жидкости только в 10-30% пациентов с нейроборрелиозом (Eiffert et al, 1995). Ввиду всех особенностей и низкой чувствительности обнаружения ДНК боррелий с помощью ПЦР, этот метод не получил такого широкого распространения, как в случае других бактериальных инфекций. Однако, этот метод обнаружения боррелий непосредственно в клещах хорошо зарекомендовал себя и успешно используется для оценки эпидемиологической картины эндемичных районов ИКБ (Postic et al, 1996; Beklemishev et al, 2003; Livanova et al, 2003; Коренберг и др., 2006).
Получение суммарного препарата ДНК из клещей
ДНК из живых клещей выделяли методом Chomczynski и Sacchi (Chomczynski and Sacchi, 1987) с некоторыми модификациями. Каждого клеща гомогенизировали (растирали) в полипропиленовых пробирках объёмом 500 мкл в 100 мкл лизирующего раствора (4М раствор гуанидина-изотиоцианата, содержащего 0,5% лаурил-саркозилат натрия 25мМ цитрат натрия, 0,1М -меркаптоэтанол и 20 мкг/мл гликогена). Гомогенат инкубировали 90-120 мин при 60оС в твёрдотельном термостате. В полученный лизат вносили 125 мкл фенола, насыщенного 0,1М Трис , рН 8.0. Смесь интенсивно встряхивали на вортексе и инкубировали при комнатной температуре 10 мин. Затем добавляли 100 мкл хлороформа, энергично встряхивали и центрифугировали 5 мин при 10000g. Надосадочную жидкость аккуратно отбирали, не захватывая промежуточный слой, в новую чистую пробирку. ДНК из надосадочной жидкости осаждали равным объемом ( 120 мкл) изопропилового спирта, выдерживали 30-60 мин при комн. темп., затем преципитаты осаждали центрифугированием 15 мин при 10000g. Осадки ДНК промывали 70% этанолом, затем 96% этанолом, слегка подсушивали на воздухе и растворяли в 30 мкл ТЕ-буфера. Препараты ДНК хранили при –20оС. В ПЦР использовали по 2-5 мкл препарата ДНК на 50 мкл реакционной смеси.
Получение суммарного препарата ДНК из культур боррелий Культуру боррелий, 1000 мкл в среде BSK-II, разбавляли добавлением 500 мкл физраствора, затем клетки осаждали центрифугированием при 10000g 10 мин. ДНК из осадка клеток, суспендированного в 400 мкл лизирующего раствора, выделяли по выше описанной методике 2.2.1. К выделенному очищенному препарату ДНК, растворённому в 50 мкл буфера ТЕ, добавляли 50 мкл автоклавированного 100% глицерина и хранили при -70оС. Для генотипирования и амплификации генов спирохет методом ПЦР использовали по 1-2 мкл препарата ДНК на 50 мкл реакционной смеси.
Выделение плазмидной ДНК из E.coli Плазмидную ДНК выделяли щелочным методом, удаляя примеси РНК обработкой препарата ДНК РНКазой А (Маниатис и др., 1984, стр. 100-102) 2.2.4. Быстрое выделение плазмидной ДНК из колоний E.coli Часть колоний E.coli, выращенных в чашках на селективной агаризованной среде, при помощи стоматологического шпателя соскребали, стараясь не захватить агар, переносили в 50-100 мкл ТЕ и суспендировали на вортексе. Суспензию клеток инкубировали 5 мин на кипящей водяной бане. По окончании инкубации клетки осаждали центрифугированием 3 мин при 10000g. Супернатант, содержащий плазмидную ДНК, использовали для быстрого, скринингового ПЦР-анализа на наличие клонируемых вставок ДНК. . Электрофорез ДНК в агарозных и полиакриламидных гелях
Электрофорез ДНК в агарозных гелях использовался для анализа фрагментов ДНК длиной от 0,3 до 6 т.п.н., электрофорез в полиакриламидных гелях - для анализа фрагментов ДНК длиной от 50 до 1000 п.н. За основу брали приемы и методы описанные, в монографии Маниатиса (Маниатис и др., 1984, стр. 157-185). Результаты электрофореза регистрировали с помощью фотографирования геля при освещении ульрафиолетом (длина волны 302 нм) с помощью цифровой фотокамеры Sony DSC-F717, оборудованной соответствующим светофильтром Выделение ДНК из агарозного геля методом сорбции на мелкодисперсном оксиде кремния «Силика»
Выделение ДНК из гелей агарозы проводили с использованием набора фирмы «Биосилика» (Новосибирск, Россия), согласно прилагаемому к нему протоколу, либо с применением лабораторной методики, основанной на общеизвестном принципе сорбции ДНК на поверхности мелкодисперсного оксида кремния в концентрированных растворах солей (NaI, NaClO4, хлорид гуанидина и др.). В качестве соли, вызывающей сорбцию ДНК, использовали раствор, содержащий 4 М NaClO4, 1 мМ ЭДТА, pH 7.0. Емкость сорбента составляла 2.5 мкг ДНК на 1 мг оксида кремния. Данный метод использовался в основном для очистки фрагментов ДНК от продуктов гидролиза, либо очистки ампликонов от неспецифичиских продуктов ПЦР. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции
Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции проводили согласно инструкциям фирмы-изготовителя ферментов. Гидролизованную ДНК анализировали в агарозных или полиакриламидных гелях, в зависимости от размера фрагментов ДНК. В случае препаративного получения фрагментов ДНК для генно-инженерных работ, гидролизованную ДНК разделяли в агарозных гелях с последующей элюцией из геля необходимых фрагментов ДНК (гл. 2.2.6). Полученные таким образом фрагменты ДНК использовали для лигирования. Лигирование фрагментов ДНК с использованием ДНК-лигазы бактериофага T4
Процедуру лигирования фрагмента ДНК с плазмидой-вектором по липким концам проводили согласно инструкции фирмы-изготовителя ДНК-лигазы бактериофага Т4 («СибЭнзим», Россия; «Promega», США). Молярное соотношение встраиваемого фрагмента ДНК с вектором составляло 5:1, либо 10:1, в случае клонирования малых фрагментов ДНК ( 50 п.н.). Аликвоты реакционной смеси использовали для трансформации компетентных клеток E.coli методом электропорации. 2.2.9. Амплификация ДНК в системе ПЦР
Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), использовали амплификатор МС-2 («ДНК-технология», Москва). Реакцию проводили в пластиковых пробирках объемом 0,5 мл (“QSP”, США). Объем реакционной смеси в одной пробирке составлял 25-50 мкл. Выбор олигонуклеотидов-праймеров проводили с помощью программы Vector NTI (версия 8.0), с помощью этой же программы определяли температуры отжига праймеров с матрицей-мишенью при концентрации каждого праймера в реакционной смеси 0,2 мкМ. Использовали следующие концентрации основных компонентов реакционной смеси: 36 мМ Трис-НCl, pH 8.9-9.0 при 25oC; 16 мМ (NH4)2SO4; 2-5 mM MgCl2; 1-2 е.а./мкл Taq ДНК-полимеразы; 0,06% (об/об) Tween 20; 0,2 мкМ каждого праймера: 50–100 мкМ каждого dNTP. Для точного копирования ДНК-мишеней использовали набор для амплификации ДНК фирмы Finnzymes (Финляндия), содержащий термостабильную химерную ДНК-полимеразу «Phusion» с корректирующей активностью. При необходимости для каждого вида амплифицируемых мишеней подбирали оптимальные концентрации ионов Mg2+, температуры отжига праймеров с матрицей-мишенью, время полимеризации. Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 5-6% ПААГ или в 1,5 - 2% агарозном геле. При амплификации фрагментов ДНК, используемых для генно-инженерных работ, праймеры, как правило, содержали в своей структуре с 5 -конца сайт для какой-либо рестриктазы. Амплификацию с такими праймерами проводили по следующей схеме: первые пять циклов ПЦР проводили при температуре отжига праймера, рассчитанной для нуклеотидной последовательности праймера без учета последовательности сайта рестрикции, последующие 20-30 циклов проводили при температуре отжига, рассчитанной для полной последовательности праймера.
. Культивирование спирохет Borrelia burgdorferi s.l. с помощью заражения лабораторных мышей
В качестве подопытных животных использовали 25 беспородных мышей. Гомогенат клещей, полученный как описано в п. 2.3.2, инъецировали животным внутрибрюшинно. Мышей после инъекций содержали 20 дней, затем извлекали сердце, кровь, мочевой пузырь, помещали их в среду BSK II и инкубировали при 32оС, как описано в гл. 2.3.3. Выявление в среде культивирования спирохет Borrelia burgdorferi s.l. проводили с помощью обнаружения ДНК боррелий методом ПЦР (гл. 2.3.4). В культурах, выращенных из сердца, было получено 8 изолятов боррелий, из мочевого пузыря – 7, и из крови – 12. Результаты получения изолятов боррелий представлены в таблице 3.1.
Культуры боррелий, не содержащие контаминирующей микрофлоры, были помещены в лабораторный музей. Полученные результаты были учтены при определении зараженности клещей (гл. 3.2). Оценка зараженности клещей Ixodes persulcatus, населяющих рекреационную зону Новосибирского научного центра, спирохетами B.burgdorferi s.l. Наиболее простым и чувствительным способом обнаружения боррелий в индивидуальном клеще является метод выявления ДНК спирохет в каждой особи с помощью ПЦР. В нашей работе мы проводили мониторинг зараженности клещей Ixodes persulcatus спирохетами Borrelia burgdorferi s.l. в течение нескольких лет, с 2003 по 2008 г.г. Количество обследованных особей варьировало год от года.
Для обнаружения геномной ДНК спирохет B.burgdorferi s.l. в индивидуальном клеще, мы попытались применить ту же методику (Mejlhede et al, 2003), которую использовали для обнаружения геномной ДНК боррелий в культуре. В ПЦР на ДНК, выделенных из клещей, нарабатывались неспецифические продукты реакции, которые затрудняли идентификацию ампликонов. В связи с этим мы отказались от данного метода обнаружения и типирования геномной ДНК спирохет. Для обнаружения и генотипирования геномных ДНК боррелий, выделенных непосредственно из клещей, мы использовали более трудоёмкий метод, предложенный в работе Postic et al. (Postic et al, 1996) с некоторыми модификациями (Beklemishev et al, 2003) (см. п. 2.3.5).
Этот метод состоит из двух этапов и основан на анализе полиморфизма длин рестриктных фрагментов, полученных гидролизом ампликонов межгенной области rrf-rrl (генов 5S и 23S рРНК) рестриктазой MseI (Tru9I). На первом этапе амплифицируют фрагмент межгенной области rrf-rrl, длина которого составляет в зависимости от геновида 250-270 п.н. На втором этапе полученный ампликон гидролизуют рестриктазой MseI. Представителям каждого геновида и геномной группы спирохет B.burgdorferi s.l. свойственен определённый набор отличающихся по размерам рестриктных фрагментов ампликона межгенной области rrf-rrl (Postic et al, 1994), которые легко можно разделять электрофорезом в 12% ПААГ. Таким образом, по результатам электрофоретического анализа полученных рестриктов можно судить о геновидовой принадлежности боррелий, содержащихся в исследуемом клеще.
На первом этапе продукты ПЦР анализировали в 6% ПААГ. Для исключения ложноотрицательных результатов анализа, реакцию ПЦР проводили в присутствии ДНК внутреннего контроля. Таким образом, в реакционной смеси присутствовало четыре праймера: пара праймеров №126 и №127 (прил. 1) предназначена для амплификации межгенной области rrf-rrl боррелий и вторая пара праймеров №64 и №65 (прил. 1) - для амплификации ДНК внутреннего контроля. ПЦР проводили, как описано в гл. 2.2.9. Температура отжига праймеров составляла 620С, количество циклов реакции - 35.
В качестве ДНК внутреннего контроля использовали клонированный фрагмент генома вируса гепатита В. Размер ампликона, получаемого на ДНК внутреннего контроля, составляет 150 п.н., что хорошо видно на рисунке В качестве положительного контроля в ПЦР использовали геномную ДНК B.burgdorferi sensu stricto эталонного штамма В31, размер ампликона межгенной области rrf-rrl которого составляет 250 п.н. На рисунке 3.2 представлены результаты типичного анализа образцов ДНК клещей на присутствие в них геномных ДНК боррелий.
Электрофореграмма продуктов амплификации межгенной области rrf-rrl, полученных методом ПЦР на образцах ДНК, выделенных из клещей. Электрофорез ДНК проводили в 6% ПААГ. Дорожки: 1 – отрицательный контроль; 2 – маркерная ДНК (pBR322, гидролизованная рестриктазой AluI); 3-14 - продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК, выделенных из клещей; 15 - продукт ПЦР, проведённой на геномной ДНК B.burgdorferi s.s. шт.B31 (положительный контроль). На рисунке 3.3 представлен один из результатов генотипирования ДНК боррелий. Судя по картине электрофореза ампликонов межгенной области rrf-rrl, гидролизованных рестриктазой MseI, 7 исследуемых образцов (дорожки 2, 4, 7, 10-13) содержат геномную ДНК спирохет, относящихся к геновиду B.garinii (геномная группа 20047T); 1 образец (дорожка 3) – B.japonica; 1 исследуемый образец (дорожка 6) содержат смесь геномных ДНК спирохет B.garinii (геномные группы NT29 и 20047T); 1 исследуемый образец (дорожка 8) – B.afzelii; 1 исследуемый образец (дорожка 9) содержат смесь геномных ДНК спирохет B.japonica и B.garinii (геномная группа 20047T). Рис. 3.3. Электрофореграмма рестриктных фрагментов ампликонов межгенной области, полученных в процессе генотипирования анализируемых образцов ДНК B.burgdorferi s.l. Электрофорез проводили в 12% ПААГ.
