Введение к работе
Актуальность темы.
Природные полиамины (ПА) и их синтетические аналоги изучаются уже не одно десятилетие как биологически активные вещества, способные оказывать существенное влияние на рост и развитие самых разных организмов путем регуляции клеточной пролиферации у микроорганизмов, растений и животных, включая человека [Wallace H.M., Niiranen K. 2007; Huang Y., et al. 2009; Carmo A.M., et al. 2011] Установлено, что полиамины вовлечены в целый ряд важнейших внутриклеточных процессов, например, в обеспечение стресс-устойчивости, регуляцию определенных метаболических реакций, развитие апоптоза [Huang Y. et al. 2009; Marco F.,et al 2011; Minois N. et al. 2011]. При этом некоторые полиамины нарушают функционирование клеточных геномов на разных уровнях, в частности, отдельные соединения указанного ряда способны достаточно специфично изменять экспрессию генов и влиять на активность ферментов [Huang Y., et al. 2009; Marco F.,et al 2011; Wu Y. et al. 2012]. Естественно, большой интерес вызывают вопросы, связанные с изучением роли полиаминов в регуляции различных молекулярных процессов у человека и возможностей целенаправленного влияния на эти процессы синтетическими полиаминами. В настоящее время практически ежегодно появляются сообщения о создании новых синтетических полиаминов и использовании различных подходов к определению проявлений их биологической активности [Ignatenko N.A. et al. 2009; Carta F. et al. 2010; Yoon Y.J. et al. 2011; Wu Y. et al. 2012]. Как следствие, возникают объективные потребности в стандартизации условий для определения и сравнительного анализа цитостатических и других функциональных свойств синтетических аналогов полиаминов в рамках доклинических испытаний.
Имеются убедительные данные, свидетельствующие о том, что природные полиамины и их синтетические аналоги способны целенаправленно влиять на определенные этапы биосинтеза белков. В частности, были опубликованы статьи, в которых эффективно использовались протеомные технологии для определения конкретных клеточных белков, подвергающихся различным изменениям после воздействий полиаминов [Yohannes E. et al. 2005; Ignatenko N.A. et al. 2009; Kuo W.L. et al. 2009 и др.]. Таким образом, применение протеомного анализа открывает широкие возможности для получения новых сведений о молекулярных эффектах, которые способны вызывать различные синтетические аналоги полиаминов, а также о потенциальных белках - мишенях.
Наконец важно отметить, что синтетические аналоги полиаминов могут найти применение как лекарственные средства или попадать в организм человека с пищевыми продуктами. Соответственно, представляется весьма актуальным проведение разработок стандартизированных биотест-систем на основе культивируемых клеток человека, что позволит оптимизировать программы доклинических исследований новых синтетических аналогов полиаминов и уменьшит риск возможных осложнений при последующем изучении.
Цель и задачи исследования.
Основной целью данной диссертационной работы стало изучение цитостатических свойств и других биологических эффектов некоторых синтетических полиаминов в различных модельных системах.
В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать в условиях модельной бесклеточной системы влияние ряда синтетических аналогов полиаминов (ДФМО, МГБГ и др.) на общий пул природных полиаминов и некоторые показатели их обмена.
2. Проанализировать цитостатическую активность у отдельных синтетических аналогов полиаминов с помощью модельной системы на культивируемых клетках лабораторных животных.
3. Разработать биотест-систему на основе быстро пролиферирующих, культивируемых клеток человека и с её помощью изучить биологические эффекты ряда синтетических аналогов полиаминов
4. Провести сравнительный протеомный анализ белков в культивируемых клетках человека под действием отдельных синтетических аналогов полиаминов.
5. Исследовать возможность ассоциации отдельных полиморфных вариантов в двух генах, кодирующих ключевые ферменты метаболизма полиаминов, а также в гене одного из актин-связывающих белков с риском рака предстательной железы у этнических русских.
Научная новизна.
Получены новые данные о влиянии ряда синтетических аналогов полиаминов (ДФМО, МГБГ, О-замещенных гидроксиламинов, алифатических гомологов природных полиаминов) на общий пул природных полиаминов, а также на соотношение спермидин / спермин и синтез полиаминов в условиях бесклеточной системы.
Для обеспечения определения цитостатической биологической активности синтетических аналогов полиаминов разработана клеточная биотест-система, использующая в качестве тестируемого объекта быстро пролиферирующие культивируемые клетки рака простаты человека (PC-3 и LNCaP). С помощью этой биотест-системы охарактеризованы четыре новых синтетических аналога полиаминов дифенил-содержащих аминов (ДФСА-1 – ДФСА-4) по их способности подавлять рост опухолевых клеток человека.
По результатам протеомного анализа в клетках линии PC-3 определены шесть белков, количественно изменяющихся под действием ДФСА-1 и 2. При этом, впервые установлено присутствие в этих клетках двух «безымянных белков» - белка, который зарегистрирован в базе данных Protein NCBI под №193783699 (по данным анализа кДНК из ткани матки, локус BAG53610 в Genbank) и считается родственным аспартатаминотрансферазам, а также белка, идентифицированного как «безымянный белок» из семейства РНК-связывающих белков с RBD доменом (№16552153 в Protein NCBI).
Впервые установлено, что у этнических русских по результатам изучения полиморфизма сайты rs61748925 SAT1 и rs1139915 PAOX являются мономорфными и они не пригодны для изучения ассоциаций с РП; в отличие от этого для сайта rs11072170 в гене FMN1 удалось выявить достаточно выраженный полиморфизм со следующими характеристиками: 19.4 % анализируемых образцов были гомозиготны по аллелю G, 27.8% – по аллелю A, и 52.8% - являлись гетерозиготными, Таким образом, можно считать, что полиморфизм rs11072170 в гене FMN1 является перспективным для дальнейшего изучения возможных ассоциаций его аллелей с РП.
Научно-практическая значимость.
Апробировано несколько модельных систем для определения биологической активности синтетических аналогов природных полиаминов и разработана биотест-система, позволяющая оценивать цитостатические (цитотоксические) свойства указанных соединений (биотест-объекты - клетки LNCaP и РС-3; метод тестирования – витальная система регистрации количества клеток).
Изучены показатели биологической активности 15-ти синтетических аналогов природных полиаминов, включая антипролиферативные свойства у 6-ти соединений на разработанной биотест-системе, использующей быстро пролиферирующие клетки рака простаты.
При протеомном анализе белков из клеток PC-3 проведена масс-спектрометрическая идентификация 52 белковых фракций в результате чего расширен информационный модуль в отечественной базе данных «Протеомика рака простаты» (версия 2012 г.), которая предназначена для оптимизации поисков белковых биомаркеров этого заболевания.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Из 13 новых синтетических аналогов полиаминов три соединения (1-аминоокси-3-аминопропан, S-(5-дезоксиаденозил)-S-метил-b-тио-этилгидроксиламин, этилендиамин) обладают наибольшими биоэффектами в бесклеточной тест-системе.
2. В модельных условиях (на культивируемых L-клетках) 1-аминоокси-3-аминопропан и 5-дезоксиаденозил-5-метилтиоэтил-гидроксиламин показали себя как антипролиферативные агенты.
3. С помощью биотест-системы на основе быстро пролиферирующих клеток человека определены биологические эффекты ДФМО и МГБГ, а также 4-х новых синтетических дифенил-содержащих аминов (ДФСА 1-4).
4. Показано, что ДФСА-1 является наиболее перспективным цитотоксическим агентов, поскольку для него выявлено наиболее выраженное антипролиферативное действие.
5. Протеомный анализа белков клеток РС-3 выявил два новых («безымянных») белка человека и позволил расширить информационный модуль «Белки РС-3» в базе данных «Протеомика рака простаты».
6. Показано, что у этнических русских сайт в гене SAT1 (rs61748925) и сайт в гене PAOX (rs1139915) являются мономорфными, т.е. они не пригодны для изучения ассоциаций с РП; а для сайта rs11072170 в гене FMN1 существует полиморфизм со следующими характеристиками: 19.4 % образцов были гомозиготны по аллелю G, 27.8% – по аллелю A, и 52.8% - являлись гетерозиготными, что позволяет считать его перспективным для изучения возможных ассоциаций его аллелей с РП.
Апробация работы.
Материалы работы докладывались на международных, российских конференциях и на научных съездах, в том числе: XVIII Межд. конф. «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», 2010. Украина, Ялта-Гурзуф; Intern. polyamine confer., 2010, Gotemba, Japan; I Межд. научно-практ. конф. «Экология и медицина: современное состояние, проблемы и перспективы», 2010, Москва; Intern. Congress on Polyamines, Istanbul, Turkey, September, 2012 и др.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, среди которых 3 статьи в рецензируемых профильных журналах, рекомендованных ВАК РФ, а также 14 тезисов докладов на отечественных и международных научных конференциях.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 128 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (289 ссылок на публикации отечественных и зарубежных авторов). Работа содержит 10 таблиц и 39 рисунков
