Эффекты синергизма в совместном действии -токоферола и ферментативных антиоксидантов при окислении модельных гетерогенных липидных систем in vitro в присутствии биологически активных олигопептидов Болдырева, Юлия Викторовна

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Болдырева, Юлия Викторовна. Эффекты синергизма в совместном действии -токоферола и ферментативных антиоксидантов при окислении модельных гетерогенных липидных систем in vitro в присутствии биологически активных олигопептидов : диссертация ... кандидата медицинских наук : 03.01.04 / Болдырева Юлия Викторовна; [Место защиты: ГОУВПО "Тюменская государственная медицинская академия"].- Тюмень, 2010.- 150 с.: ил.

Введение к работе

Актуальность проблемы. В последнее десятилетие отмечается повышенный интерес к изучению широкого круга индивидуальных олигопептидов, эффективных в качестве органоспецифических биорегуляторов; адаптогенов, нейропро-текторов, соединений, проявляющих гормональную активность, выраженное антимикробное действие [Ашмарин И.П. и др., 2007; Морозов В.Г. и др., 2008; Липкин В.М., Сурина Е.А., Сторожева З.И., 2009; Хавинсон В.Х., Арутюнян А.В, Козина Л.С, 2009]. Считают, что регуляторные пептиды (РП) отвечают за первичное реагирование организма, запуск систем защиты в ответ на действие факторов внешней и внутренней среды [Арутюнян А.В. и др., 2007; Лысенко А.В., Финоченко ТА, Шейчова Р.Г., 2008 Nuttal S.L., Martin U., Hutchin Т., 2006]. Показано, что нарушение пептидной регуляции на стадии биосинтеза РП и переноса информационно значимых молекул между клетками ведет к снижению устойчивости организма, способствует развитию патологий и ускоренному старению организма [Рыжак Г.А., Коновалова С.С., 2004; Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 2008; Lysenko A.V., Morgul R.G., Sheykhova Т.Д., 2007]. Концепция пептидной биорегуляции получила в последние годы признание в качестве перспективного направления современной медицины [Арутюнян А.В., Козина Л.С., 2007; Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 2008; TernerAJ. etal.,2007].

Механизм действия эндогенных олигопептидов в настоящее время недостаточно изучен. Считают, что регуляторные олигопептиды изменяют функциональную активность генома, воздействуют на процессы транскрипции м-РНК, кодирующих синтез специфических клеточных белков и пептидов, регулирующих гомеостаз клетки [Войтон Е.В., Ряжак ГА, 2004; Козина Л.С., Лысенко А.В., 2007]. Существует мнение об участии пептидов в регуляции апоптоза патологически измененных клеток [Стволинский С.Л., Лесняк В.В. и др., 2007; Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 2008; Papa S.etal., 2006].

Известна гипотеза об антиоксидантний активности (АОА) эндогенных пептидов, трактующая их эффекты в рамках теории свободнорадикального окисления [Арутюнян А.В., Козина Л.С. и др., 2006; Козина, 2009]. Так, карнозин и эпиталон проявляли антирадикальную активность в реакции со стабильными радикалами 1,1-дифенил-2-пикрил-гидразина [Козина Л.С, Стволинский С.Л., Федотова Т.Н., 2008], но ряд других пептидов, напротив, ускоряли окисление. Установлена способность карнозина и анзерина тушить синглентный кислород [Егоров С.Ю., Ку-релла Е.Г., Болдырев А.А., Красновский АА, 1992]. Известна роль глутатиона в процессе окисления ненасыщенных липидов [Кулинский В.И., Колесниченко Л.С.1990, Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б., 2001]. Антиоксидантное (АО) действие ряда олигопептидов констатировано при изучении кинетики тушения хе-милюминесценции, накопления продуктов в моделях Ре²⁺-индуцированнога окисления [Рожкова Е.А., Евстигнеева Р.П. и др., 1996; Котельников А.И., Сырцова Л.А. Санина НА, 2009] или [Комаров Ф.И., 1996; Козина Л.С, Хавинсон В.Х., 1996; Хавинсон В.Х., Арутюнян А.В., 2008], при отсутствии в системе катионов металлов переменной валентности, выполняющих роль инициаторов, действие пептидов на процесс окисления не изучалось. Методом ЭПР показано, что при радиационном облучении, из пептидов и белков генеририруются свободные радикалы [Каюмов Л.П., Львов К.М., Пулатова М.К., 1972, Прайор У., 1979], которые в дальнейшем повреждают структуру ДНК [Карп О.Э., Гудков СВ., Брусков В.И., 2010]. Показано, что при введении мышам олигопептиды усиливают синтез АО ферментов (катала-зы и супероксиддисмутазы) [Хавинсон В.Х., Арутюнян А.В., Козина Л.С, 2007], что может рассматриваться также в качестве механизма ответа на фактор, повышающий интенсивность свободнорадикальных процессов.

Таким образом, результаты изучения влияния пептидов на процесс окисления немногочисленны и противоречивы. Отсутствуют данные о характере взаимодействия пептидов с природными ингибиторами окисления, влиянии ферментативных АО (каталазы, пероксидазы) на кинетику окисления систем, включающих олигопептиды различного строения.

Цель исследования изучить действие ряда индивидуальных биологически активных олигопептидов, моделирование кинетических эффектов ингибирования композиций, дополнительно включающих низкомолекулярные ингибиторы природного происхождения (а-токоферол, Р-каротин) и ферментативные АО (каталазу, пероксидазу хрена) в процессе инициированного окисления гетерогенных липидных систем in vitro.

Задачи исследования:

Изучить кинетику инициированного окисления (в присутствии Fe²⁺ или азо-соединений) гетерогенной системы, включающей модельный субстрат (мети-лолеат, МО), олигопептиды разного химического строения (глицилглицилгли-цина (Gly-Gly-Gly), карнозина (P-A(a-L-His), глутатиона (у-Glu-Cys-Gly), вилона (Lys-Glu), везугена (Lys-Glu-Asp), пинеалона (Glu-Asp-Arg), хонлутена (Glu-Asp-Gly), овагена (Glu-Asp-Leu), кристагена (Glu-Asp-Pro), карталакса (Ala-Glu-Asp), элиталона (Ala-Glu-Asp-Gly)) и ПАВ (додецилсульфат натрия) (ДЦС-Na).
Выявить особенности концентрационных зависимостей действия исследуемых пептидов в процессе окисления гетерогенных липидных систем.
Изучить возможность образования нитроксильных радикалов в процессе окисления пептидов (методом ЭПР и методом спиновых ловушек).
Изучить особенности кинетики накопления гидропероксидов (ГП), расходования р-К в присутствии и в отсутствии пептидов в системе окисления.
Исследовать кинетику действия индивидуальных природных АО а-токоферола (а-ТФ) и р-каротина (Р-К) в присутствии коротких пептидов и аскорбиновой кислоты (АК).
Изучить кинетику окисления гетерогенных липидных систем, включающих олигопептиды, АО ферменты (каталазу и пероксидазу хрена (ПХ)), а также их смеси с а-ТФ.

Новизна исследования. В работе впервые в системе in vitro при различных способах инициирования исследованы АО свойства ряда индивидуальных олигопептидов: глицилглицилглицина (Gly-Gly-Gly), карнозина (P-Ala-L-His), глутатиона (y-Glu-Cys-Gly), вилона (Lys-Glu), везугена (Lys-Glu-Asp), пинеалона (Glu-Asp-Arg), хонлутена (Glu-Asp-Gly), овагена (Glu-Asp-Leu), кристагена (Glu-Asp-Pro), эпитало-на (Ala-Glu-Asp-Gly), карталакса (Ala-Glu-Asp).

Доказано, что большинство исследуемых веществ тормозят Fe²⁺-индуцированный процесс окисления и существенно ускоряют АИБН-инициированное окисление. Установлена возможность связывания индивидуальными олигопептидами солей железа в ферри-форме (Fe²*), что снижает скорость инициирования и скорость окисления липидов в целом.

При отсутствии в системе металлов переменной валентности пептиды играют роль инициаторов процесса окисления, служат дополнительными источниками свободных радикалов. Исключение составляют пептиды, имеющие в своей структуре гетероциклический фрагмент (остаток имидазола или пролина) (карнозин, кристаген), либо SH-группу (глутатион).

Показано, что в присутствии пептидов значительно увеличивается скорость накопления ГП - первичных продуктов окисления липидов, возрастает скорость расходования АО, в частности, р-К.

Установлено, что пептиды разного химического строения проявляют эффект антагонизма в композициях с природными АО (а-ТФ и р-К), уменьшая их ингиби-рующее действие в смеси до 80%.

АК в системе с пептидами и биоАО способствует повышению стабильности системы, но не более чем на 20%, при высоких концентрациях.

Показано, что АО ферменты (каталаза и ПХ) позволяют преодолеть инициирующее действие пептидов и существенно повысить окислительную устойчивость системы. При этом ПХ более чем в 2 раза эффективнее каталазы, ферменты обеспечивают увеличение периодов индукции в 3,0 и 7,0 раз, соответственно при сравнимых массовых долях 4,3х10"³% (1,720><10'⁷ моль/л каталазы и 0,975*10 моль/л ПХ). Показано, что ингибирующее действие ферментов прямо пропорционально их количеству в системе окисления.

Доказано, что бинарные композиции АО ферментов (каталазы, ПХ) и а-ТФ эффективно стабилизируют in vitro процесс свободнорадикального окисления ли-пидных систем, дополнительно включающих пептиды. Между периодами торможения окисления и количеством а-ТФ и ферментов существует прямая корреляционная связь.

Впервые показано, что в процессе окисления пептиды не образуют нитро-ксильных радикалов, продукты окисления пептидов не взаимодействуют с водорастворимыми модельными маркерами нитроксильных радикалов.

Практическая значимость. Предложены способы стабилизации окисления гетерогенных липидных систем, включающих олигопептиды, за счет дополнительного введения АК, АО ферментов (каталазы, ПХ) и их синергических смесей с а-ТФ. Практическое использование методических подходов, изложенных в диссертации, может обеспечить длительное сохранение биологической ценности и окислительной устойчивости нутрицевтиков, фармацевтических и косметических средств, включающих липиды и олигопептиды.

Внедрение результатов исследования. Результаты работы использованы в элективном курсе для студентов 1 и 2 курса лечебного и педиатрического факультетов на кафедрах общей и биоорганической химии и биологической химии.

Апробация работы. Результаты доложены на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации», Тюмень, 2008, 2009, 2010 гг.; Всероссийской конференции «Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты», М., 2008 г.; Крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии», Судак, 2008, 2009 гг.; Международной конференции «Современные проблемы химической физики», Ереван, 2008г.; научно-практической конференции «Фармация и общественное здоровье», Екатеринбург, 2009 г.; 75-й студенческой конференции КрГМА, Краснодар, 2009г.; XVII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». - Гурзуф, 2009 г.; IV Национальном конгрессе терапевтов Урала, Тюмень, 2009 г.; XXVII Всероссийской школе-симпозиуме молодых ученых по химической кинетике. - М., 2009 г.; конференции «Химия под знаком «сигма»: исследования, инновации, технологии». -Омск, 2010 г.; VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» - М., 2010 г.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах компьютерного текста, состоит из; введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных экспериментов, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложения. Список литературы включает 305 источников, из них 177 отечественных и 128 зарубежных. Работа иллюстрирована 31 рисунком и 15 таблицами.

Публикации. По теме исследования опубликовано 17 печатных работ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

Кинетика окисления модельных липидных систем, инициированых солью Мора (Fe²⁺), либо за счет термического разложения азосоединений, в присутствии индивидуальных олигопептидов: глицилглицилглицина (Gly-Gly-Gly), кар-нозина ((З-Ala-L-His), глутатиона (y-Glu-Cys-Gly), вилона (Lys-Glu), везугена (Lys-Glu-Asp), пинеалона (Glu-Asp-Arg), хонлутена (Glu-Asp-Gly), овагена (Glu-Asp-Leu), кристагена (Glu-Asp-Pro), карталакса (Ala-Glu-Asp), эпиталона (Ala-Glu-Asp-Gly).
Механизм действия олигопептидов при окислении липидов. Результаты изучения кинетики накопления ГП, расходования биоАО ((3-К) в присутствии и в отсутствии пептидов в системе окисления. Исследование методом ЭПР и методом спиновых ловушек возможности образования нитроксильных радикалов в процессе окисления пептидов.
Кинетика совместного АО действия природных АО (а-ТФ и р-К) в присутствии коротких пептидов. Изучение эффектов синергизма а-ТФ с АК в присутствии олигопептидов.
Кинетика окисления гетерогенных липидных систем, включающих олигопеп-тиды и АО ферменты (каталазу и ПХ).
Кинетика брутто-ингибрующего действия смесей а-ТФ и АО ферментов (ка-талазы, ПХ) при окислении липидных систем, содержащих олигопептиды.