Введение к работе
Актуальность проблемы. В головном мозге существует более
тесная, чем в других органах., связь системі энаргопродукции и функциональной активности органа. Это обусловлена исключительно высокой интенсивностью процессов образования и утилизации энергии, отсутствием в мозге запасов субстратов окисления и кислорода, наличием гематоэнцефалического барьера, тесной связью обмена Е2::с:ейі~ тормазгакс :: возСуздйкіщх ыодиаир^ь (ГАМК. аминокислоты группы глугГ«и"ы) с системой і."іііїохондриального окисления in..ива-нов, Ю.Кисляков, 1979; А.ЛаОори, 1974; А.Лениндаер, 1985; B.SlesJo, 1978].
Глюкоза является основным- энергетическим субстратом клеток мозга, а кинетические характеристики гликолиза допускают его 40-кратную активацию при возрастании энергозапросов [А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит и др., 1981; A.Chapman, B.Meldrum, B.Sleajo, 1977: J.Folbergrova, М.ТпэтаГ;'BbSiesjo, 19S1; B.SIeaJo, "і97ЄЗ. В связи с іпїоксй проницаемостью ГЗВ для лактата защита органа от лактацидоза обеспечивается реакциями утилизации конечных продуктов гликолиза митохондриями (MX) [А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит и др., 1981; B.Slesjo, 1978). Однако, принятая концепция регуляции митохоїідриального окисления, основанная на контролирующей роли узких мест ЦТК (цитратсинтазная и изоцитратдегидрогенпзная реакции) и шфува-і'дегидрогеназнсго комплекса не позволяют объяснить,-каким образом осуществляется метаболизм излишне продуцируемой при возрастающих .энергозапросах молочной кислоты, поскольку в норме вышеупомянутое ферменты работают со скоростями, близкими к максимально возможным [Э.Ньюсхолм, К.Старі, (9'і"7; А.Уайт, З'.Хешглер, Э.Смит и др., 1981].
Существуют многочисленные данные, показывающие высокую стабильность содержания АТФ в ткани мозга при патологических сог.тоя-і.шх, сопровождающихся экс ремалышмм енергозатратами Пї.Архшіоі!.' А.Вулонцов, 1986; Г.Зенкевич, 1Э70; К.Иванов, Ю.Кисляков, 1979; У.Ласт, Дж.Иасоїшеу, 1982; К.Погодаев, 1986; М.Самойлов, 1У85; Е.Хватова, А.Сидоркине, Г.Миронова, 1987; H.Bachelard, 197в; B.Siesjo, 19781, К таковым, в частности, относятся стресс-реакция, генерализованные судорожные припадки, церебральная- ишемия [B.SlesJo,- 1978). По существующим представлениям, основными механизмами, поддерживающими стабильность аденилатного энаргетическо-
го заряда клеток мозга являются, . наряду с окислительным фосфори-лированием, нуклеозид-дафосфат-киназная реакция, связывающая пул' ГТФ и АТФ, и креатинкиназная реакция, поддерживающая взаимосвязь пула КФ и АТФ [А.Уайт, Ф.Хендлєр, Э.Смит и др., 1981; Е.Хватова, А.Сидоркина, Г.Миронова, 1987% Пул КФ в отношении АТФ выполняет буферную функцию и затрагивается только при уменьшении аденилат-ного энергетического заряда' либо снижении внутриклеточного рН [С.Лиходий, Ст.Лиходий, Л.Сибельдина и др., 1988; W.Hass, 1983; R.Corbett, -A.Laptook, R.Nunnally, et al., 1988; E.Nemoto, 1978]. Содержание ГТФ является одним из наиболее лабильных - показателей состояния системы энергопродукции головного мозга [Е.Хватова, Е.Щуматова, Г.Миронова и др., 1976; Е.Хватова, А.Сидоркина, Г.Миронова, 1987; ' Е.Хватова, А.Сидоркина, Л.Якобсон, В.Ваулина, 1981 ].. Синтез ГТФ в реакции субстратного фосфоршшрования при образовании из 2-оксоглутарата янтарной кислоты указывает на особое значений этого звена ЦТК в регуляции энергетического метаболизма мозга.
Существующее представление о функционировании ЦТК предпола
гает основной приток субстратов в цикл через пируватдвгидрогеназ-
ный комплекс и равномерную интенсификацию кругооборота цикла ' при
необходимости увеличения продукции АТФ MX [Э.Ныосхолм, К.Старт,
1Э77; А.Уайт, Ф.Хендлер, Э.Смит и др., 1981], Вместе с тем, мед
ленные ферменты (изоцитратдегидрогеназа и цитратсинтаза), в рам
ках теории функционирования замкнутого цикла Кребса, ограничивают
возможность интенсификации продукции макроэргов органеллами, что
не согласуется с данными об уровне, .компенсируемых окислительным
фосфорилированием, энергозатрат мозга при экстремальных энерго
запросах [К.Иванов, Ю.Кисляков, 1979; Р.Глебов, :Г.Крыжановский,
1983]. . , '
М.Н. Кондрашова [1989, 199П, на основе структурна-кинетической организации митохондриалышх процессов пришла к заключению-о существовании быстрого и медленного путей метаболизма субстратов в MX и доминирующей активации быстрого пути при возрастании энергозапросов органа. Быстрый путь представляет собой ускоренный механизм образования и окисления янтарной кислоты (ЯК) через сопряжение сукцинатдегидрогбназной (СДГ) реакции с аспартат-аминот-рансферазой и 2-оксоглутарвтдегидрогеназой. Он замыкается в цикл с участием аминотрансфераз цитозоля, поддерживая приток'субстра-
тов (глутамат, пируват, малат) в MX. Обходя начальний медленный участок ЦТК, бистрий путь позволяет реализовать кинетическое преимущество СДТ и мощность окисления генерируемой в MX ЯК обеспечивает интенсивную продукцию ГТФ и АТФ. В 1000 раз большая мощность потока водорода и электронов при окислении вндогашо продуцируемой ЯК, по сравнению с другими субстратами MX, обеспечивает высокий уровень энергетической регуляции метаболизма органелл, поддержание ионного (Са , Н*) гомеостазе клеток мозгя, вносит ьклад в активную антиперекиснуп защиту Ш.Кондрашова, 1989; В.Chance, B.Schroeder, 196П.
Не ясно, в какой мере предложенная схема регуляции энергопро-дукции MX реализуется.в формировании адаптивной реакции органа при патологиях,- характеризующихся экстремальными энергозапросами, каковы механизмы реализации потенциальной активности системы окисления ЯК при нарастании патологического воздействия. Отсутствуют данные, в какой степени сукцинатзависимзя система энергопродукции реально участвует в поддержании метаболического гомеостазе головного мозга, осуществляя контроль энергетической регуляции метаболизма, поддерживая взаимосвязь гликолиза и мг.то-хондриольного окисления, обеспечивая кальциевый гомеостаз нейронов. Практически не исследовано участие системы окисления ЯК в антиперекисной защите головного мозга. Неизвестно, как описанные механизмы участвуют в реализации терапевтического эффекта лекарственных препаратов, используемых в неврологии.
В качестве моделей патологии ЦНС мы использовали стресс-реакцию, неполную общую церебральную ишемию и генерализованные судорожные припадки. Первая и вторая модели соответствуют ведущим компонентам большинства патологических процессов головного мозга ІЗ.Араратян, 1984; М.Биленко, 1989; С.Ефуин, В.Юпектор, 1981; Р.Кветнанский, Т.Белова, О.Опршаловя, Ю.Ч/лмэн, 1981; B.Sieojo, 19781, а последняя отражает состояние крайней степени выраженности энергозатрат органа [К.Погодаев, 1964, 1986; В.Повдеев, 1980; H.Bachelard, 1976; 'A.Chapman, B.Moldrum, B.SlesJo, 1977; L.King, O.Lowry, J.Pasaoneau, V.Venson, 19673. Известно, что формирование повреждения клеток мозга при указанных патологических состояниях тесно связано с нарушением процессов энергопродукции (B.Siesjo, 1978), однако роль системы окисления янтарной кислоты в адаптивной и патологической реакциях органа в рамках изложенных
- A -
представлений совершенно не учитывается и до настоящего времени не исагэдована. Практически не изучено,- с позиции регуляции реакций быстрого пути окисления субстратов в MX, влияние на сукцинат-зависиму» энергопродукцию мозга используемых при вышеуказанных формах патологии препаратов - адаптогенов, антигипоксантов, анти-конзульсантов.
Вышеизложенное свидетельствует о высокой актуальности проблемы изучения формирования адаптивной реакции в системе энергоп-родукции головного мозга при нарастающих энергозапросах, в частности оценки вклада быстрого и медленного пути окисления субстратов, а также роли ЯК в поддержании метаболического гомеостаза органа в норме, при патологических состояниях и в механизме действия лекарственных препаратов. Вскрытие фундаментальных механизмов регуляции энергетического метаболизма головного мозга в норме и патологии необходимо для успешной разработки патогенетически обоснованной фармакотерапии и.создания лекарственных препаратов нового типа действия. Настоящая работа выполнялась в рамках разработки новых Еысокозффектившх адаптогенов, антигипоксантов и антиконвульсантов,
Цель исследования. Экспериментальное обоснование доминирующей роли системы образования и окисления янтарной кислоты головного мозга в формировании адаптивной реакции энергетического метаболизма органа при нарастающем патологическом воздействии , на примерах иммобилизационного стресса, судорожных припадков, неполной генерализованной церебральной ишемии и их фармакотерапии.
Основные задачи исследования
-
Изучить роль системы окисления янтарной кислоты в поддержании энергетического гомеостаза митохондрий головного мозга ин-тактных крыс.
-
Выявить вклад сукцинатзавиоимой энергопродукции в формирование основных этапов адаптивгой реакции головного мозга на нарастающие энергозапросы при кммобшшзационном стрессе, судорожных припадках, неполной генерализованной церебральной ишемии.
-
Оценить вклад быстрого пути метаболизма'субстратов в митохондриях в поддержание уровня рН, кальциевого гомеостаза мозга, энергетической регуляции штохондриальных процессов, в норме, при стрессе, судорожных припадках и церебральной ишемии.
- о -
4. Исследовать вклад системы сукцинатзависимой энергопродук-щш в реализацию терапевтического эффекта адаптогенов, антакон-вульсантов, антигипоксантов при защите головного мозга от повреждения соответственно при иммобилизациошгом стрессе, генерализованных судорожных припадках, церебральной ишемии.
Научная новизна работы
і. Впервые установлено участие в анергопродукции головноv-мозга быстрого и медленного путей окисления субстратов в митохондриях. Показана доминирующая роль быстрого пути при нарастании энергозапросов органа, реализация кинетических преимуществ системы окисления янтарной кислоты в рамках функционирования быстрого кластера ЦТК, роль реакций переаминирования глутамата в образова-' нии эндогенной янтарной кислоты, важная физиологическая роль механизма активации и торможения сукцинатдегидрогеназы в обеспече-нгат адаптивной реакции митохондрий при стрессе, судорожных припадках и церебральной ишемии. В нормоксических "словиях эксперимента исследовано состояние энергопродукции ипохондрий мозга с позиции оценки вклада быстрых и медленных реакций ЦТК, показана высокая чувствительность сукцинатдегидрогеназного и трансаминаз-ного звеньев быстрого пути окисления субстратов к высоким концентрациям кислорода при Ггшероксии.
2. Впервые исследовано участие быстрого кластера ЦТК в формировании адаптивной реакции головного мозга при нарастающей нагрузке на систему анергопродукции. Показано на уровне функционального состояния митохондрий наличие трех этапов адаптивной реакции .- возбуждения, резистентности и истощения. Выяь эна доминирующая активация реакций быстрого пути окисления субстратов при уменьшении вклада NAD-зависимых дегидрогеназ в цикле Кребса на этапе тревоги и резистентности и ингибнровэние на этапе истощения. Продемонстрирована первичная роль системы образования и окисления янтарной кислоты в формировании на уровне митохондрий трех этапов адаптивной реакции голоеного мозга при иммобилизационном стрессе, судорожных припадках и церебральной ишемии. Впервые показана активация кальцийт-трансюртирущей функции митохондрий,-ограничение развития лактацидо.за, перекисного окисления липидов в ткани мозга при "формировании этапа резистентности на уровне реакций быстрого пути окисления субстратов в цикле трикарбоновых кислот.
-
Впервые установлена взаимосвязь адаптогенного действия п-тирозола, противосудорожного действия фенобарбитала и бензона-ла, антигипоксического действия бемитила, этомерзола, натрия оксибутирата и эшксипина со способностью указанных препаратов активировать адаптивную реакцию быстрого пути окисления субстратов в цик^е Кребсг на этапах тревоги и резистентности и тормозить развитие этапа истощения адаптивной реакции энергетического метаболизма головного мозга.
-
Разработан новый методический подход к исследованию митохондрий мозга - нормоксические условия эксперимента, который позволил приблизить реакции органелл к таковым in situ и устранить маскирующее влияние гипероксического воздействия кислорода на ти-оловые ферменты и восстановленность переносчиков дыхательной цепи. Выявлена сезонная динамика процессов окислительного фосфори-лирования в митохондриях мозга, ее связь с функциональным состоянием органа. На основе сочетания методов математической статистики и теории нечетких множеств разработан и применен для оценки функционального состояния митохондрий оригинальный комплексный количественный критерий.
Научно-практическая ценность работы
1. Усовершенствован комплекс методических приемов позволяющий углубленно изучить митохондрии мозга в условиях, максимально сохраняющих их нативное состояние. Разработана оригинальная конструкция гомогенизатора ткани мозга, конструкция установки для исследованиявыделенных митохондрий в условиях контролируемого состава газовой среды и температурного режима. , Отработаны приемы оценки и коррекции сезонных особенностей метаболизма ипохондрий при исследовании функционального состояния органелл (авторское сви^зтельство N13T77L0), что особенно важно для исследований, проводимых в разные сезоны года. Разработанный и апробированный нами способ' исследования митохондрий мозґа в условиях, соответствующих внутриклеточным по содержанию кислорода в используемых средах (авторское свидетельство N1745258), позволяет получить более точные данные о состоянии процессов энергопродукции в ЦНС в норме, патологии и при исследовании действия лекарственных препаратов. При выпо.гчении данного исследования нами разработан и апробирован комплексный количественный критерий интактности функци-
опального состояния митохондрий, который может быть использован в исследовании различных биологических объектов, 'анализируемых небольшому числу параметров, в ситуациях, требующих принятия однозначного решения (авторское свидетельство Ш668945).
-
Сформулированно. представление о роли быстрого пути окисления субстратов в митохондриях в развитии адаптацій и дезадаптации 'системы энергопродукции головного мозга при патологических состояниях, сопровождающихся экстремальными энергозапросами, указтает на целесообразность поиска лекарственных препаратов, активирующих реакции быстрого пути окисления субстратов в цикле Кребса и ограничивающих глубокое ингибирование среди средств, оказывающих прямое или опосредованное влияние на активность сукцинатдегидрогеназы, обеспечивающих продукцию эндогенной янтарной кислота в реакциях ГАМК-шунта и активирующих реакции пере аминирования в ткани мозга. В работе показана обоснованность фармакологической активации реакций образования и окисления эндогенной янтарной кислоты на этапе формирования активней резистентности энергетического метаболизма головного мозга при стрессе, судорогах и церебральной ишемии и использования препаратов, ограничивающих последствия срыва энергетической регуляции на этапе истощения компенсаторних возможностей системы сукцинатзввисимой энергопродукции (антиоксиданти). Продемонстрирована важность для восстановления метаболического гомеостаза органа реактивации быстрого кластера ЦТК (устранение глубокого торможения сукцинатдегидрогеназы) при патологиях, сопровоадакхцихся выраженным низко-энергетическим сдвигом в системе митохондриального окисления головного мозга.
-
Полученные в ходе выполнения работы данные., касающиеся биоэнергетических аспектов действия исследованных препаратов, вошли.в материалы, представленные в Фармакологический комітет МП ГФ для разрешения клинических испытаний: п-тирозола в качестве средства повышения неспецифической сопротивляемости организма: этомерзэла и эмоксишша, как корректоров нарушений кровоснабжения и энергетического метаболизма головного мозга..
1. Адаптивная реакция системы энергопродукции головного мозга на экстремальные воздействия характеризуется начальной активацией
быстрого пути окисления субстратов в митохондриях, последующим поддержанием ьысокой активности процесса, переходом в глубокое ингибирование при истощении компенсаторных возможностей.
-
Поддержание энергетического гомеостаза головного мозга при формировании адаптивной реакции связано с доминирующим окислением янтарной кислоты.
-
Лекарственные препараты, поддерживающие активность быстрого пути окисления субстратов в митохондриях, способствуют сохранению энергетического гомеостаза головного мозга.
Апробация работы
Результаты настоящего диссертационного исследования докладывались на Международном симпозиуме по достижениям и церспективам в исследовании митохондрий'(Бари, Италия, 1985), Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического метаболизма" (Пущино, 1986), Всесоюзной конференции "Фармакологическая коррекция гипоксических состояний" (Москва, 1988), Всесоюзной конференции "Физиология, патофизиология и фармакология мозгового кровообращения" (Тбилиси, 1983), VI Всесоюзном съезде фармакологов (Ташкент, 1988), III Всесоюзной конференции "Биоан--. тиоксвданты" (Москва, 1989), Международной конференции "Регуляция свободнорадикальных реакций" (Варна, Болгария, 1989), Всесоюзной конференции "Оценка фармакологической активности химических соединений: принципы и подходы" (Москва, 1989), 20-м съезде федерации европейских биохимических обществ.(Будапешт,- Венгрия, 1990), Третьем конгрессе общества фармакологов Болгарии (София, 1990), Всесоюзной конференции "Физиология и биоэнергетика гипоксии" (Пущино, 1990), Всесоюзной конференции "Молекулярные.механизмы и регуляция энергетического метаболизма" (Пущино, 1990), II Всесоюзной конференции "Фармакологическая коррекция гипоксических состояний" (Гродно, 1991), Всесоюзном совещании по результатам клинического и экспериментального исследования препаратов 1% и ЗЖ эмоксипина и мексидоло (Москва, 1991), 15-м международном съезде биохимиков (Иерусалим,'Израиль, 1991).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 50 работ, 'Получено 3 авторских свидетельства.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из ввдения, обзора литературы, посвященного роли системы окисления . янтарной
иіслоти'в""энергетическом обмене головного мозга, глави материалы \ методи исседовашія, главы результаты исследования, заключения, зыводов и библиографического указателя. Работа изложена на 317 зтраницах, иллюстрирована 72 таблицами и 34 рисунками. Библиография включает 422 источника.
