Содержание к диссертации
Введение
Цели и задачи исследования 8
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Общие представления о болезни Альцгеймера 10
1.2. Предшественник амилоидного пептида, его свойства и функции 13
1.3. Протеолитический процессинг предшественника амилоидного пептида 17
1.4. Свойства амилоидного пептида 23
1.5. Выведение Ар из организма и мозга 26
1.6. Амилоид-деградирующие ферменты 26
1.6.1. Неприлизин 27
1.6.2. Эндотелин-конвертирующий фермент 31
1.6.3. Инсулин-деградирующий фермент 34
1.6.4. Плазмин 39
1.6.5. Другие агенты 41
1.7. Динамичность уровня содержания А{3 42
1.8. Факторы, влияющие на баланс Ар 45
1.8.1. Возраст 45
1.8.2. Гипоксия и ишемия мозга 48
1.8.3. Пренатальная гипоксия 51
1.9. Современные подходы к лечению болезни Альцгеймера 55
1.10. Обоснование целей и задач данного исследования 58
Глава 2. Экспериментальные модели и методы исследования 60
2.1. Материалы 60
2.2. Модели гипоксии 61
2.2.1. Модель пренатальной нормобарической гипоксии 61
2.2.2. Модели острой гипоксии взрослых животных 62
2.2.2.1. Модель нормобарической гипоксии 62
2.2.2.2. Модель гипобарической гипоксии 63
2.2.3. Модель гипоксии культивируемых нервных клеток 63
2.3. Модель экспериментальной ишемии мозга крыс 63
2.4. Метод культивирования нервных клеток 64
2.4.1. Культивирование клеток нейробластомы человека 64
2.4.2. Получение и культивирование первичных нейрональных клеток из мозга новорожденных крыс 65
2.4.3. Оценка выживаемости клеток в культуре с помощью окрашивания трипановым голубым
2.5. Выделение фракций растворимых и мембраносвязанных белков методом дифференциального центрифугирования 67
2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле 69
2.7. Исследование уровня экспрессии белков с помощью метода иммуноблотинга 69
2.8. Методы анализа экспрессии белков с использованием иммуноцитохимии и флуоресцентной конфокальной микроскопии... 71
2.9. Исследование уровня экспрессии белков на уровне мРНК с помощью методов полимеразной цепной реакции 72
2.9.1. Выделение РНК и определение содержания нуклеиновых кислот 72
2.9.2. Электрофорез в агарозном геле 72
2.9.3. Проведение одноэтапной полимеразной цепной реакции с помощью обратной транскриптазы 73
2.9.4. Количественная полимеразная цепная реакция 73
2.10. Анализ активности а-секретазы с использованием клеток нейробластомы человека 74
2.11. Флуоресцентный метод определения активности неприлизнна.. 74
2.12. Метод определения активности ацетилхолинэстеразы 75
2.13. Методы определения содержания белка 77
2.14. Анализ влияния кортикальных инъекций ингибитора а-секретазы батимастата на формирование памяти у крыс 78
2.15. Статистические методы обработки полученных данных 79
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 82
3.1. Возрастные изменения экспрессии АРР и продукции его растворимых фрагментов в норме и после пренатальнои гипоксии 82
3.2. Возрастная динамика экспрессии амилоид-деградирующего фермента НЕП и ЕСЕ-1 в норме и после пренатальнои гипоксии 88
3.3. Влияние острой нормобарической гипоксии у взрослых животных на экспрессию АРР и активность ферментов, участвующих в его метаболизме 95
3.4. Влияние острой гипобарической гипоксии на активность НЕП в коре и гиппокампе крыс 98
3.5. Влияние ишемии и реперфузии на экспрессию ферментов, участвующих в метаболизме АРР 100
3.6. Влияние ишемии и реперфузии на экспрессию амилоид- деградирующих ферментов НЕП и ЕСЕ-1 в коре мозга крыс 107
3.7. Влияние специфического ингибитора а-секретазы на формирование памяти у крыс
3.8. Анализ участия а-секретазы предшественника амилоидного пептида в секреций растворимой формы ацетилхолинэстеразы 113
3.9. Влияние гипоксии и окислительного стресса на активность и экспрессию амилоид-деградирующих ферментов в клетках нейробластомы человека 122
3.10. Влияние гипоксии на активность и экспрессию НЕП в первичных культурах нейрональных клеток мозга крыс 133
3.11. Поиск путей регуляции активности амилоид-деградирующих, ферментов 135
Глава 4. Общая оценка результатов исследования 140
Заключение 144
Выводы 146
Слова благодарности 148
Список цитируемой литературы 149
- Общие представления о болезни Альцгеймера
- Модель пренатальной нормобарической гипоксии
- Возрастные изменения экспрессии АРР и продукции его растворимых фрагментов в норме и после пренатальнои гипоксии
- Общая оценка результатов исследования
Введение к работе
Болезнь Альцгеймера является одним из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний нервной системы, сопровождающимся тяжелыми нарушениями деятельности мозга и встречающимся, в основном, у людей пожилого возраста. В связи с увеличением средней продолжительности жизни число людей, страдающих старческой формой данного заболевания, возрастает каждый год. По данным Международной организации здравоохранения сейчас в мире насчитывается около 24 миллионов людей, страдающих этим заболеванием, а к 2020 году их число составит 42 миллиона. Только в Европе к 2010 году затраты на лечение больных, страдающих этим заболеванием, будут составлять более 500 миллионов евро в год. Кроме того, существуют генетически обусловленные формы болезни Альцгеймера, встречающиеся в более молодом возрасте, и требующие специальных подходов диагностики и лечения. Несмотря на то, что в мировой литературе накоплен значительный экспериментальный материал по изучению морфологических, физиологических и биохимических основ болезни. Альцгеймера, в настоящее время все еще нет ясной концепции патогенеза этого заболевания и адекватных подходов к его лечению. Одним из факторов, приводящим к гибели нервных клеток и когнитивным нарушениям, сопровождающим болезнь Альцгеймера, является патологическое накопление в ткани мозга агрегатов [3-амилоидного пептида, являющегося основным компонентом так называемых сенильных бляшек. Последние являются одним из наиболее характерных морфологических проявлений болезни Альцгеймера. Амилоидный пептид (А(3) образуется в результате протеолиза более крупных молекул белка, называемого предшественником амилоидного пептида или (ЗАРР (p-amyloid precursor protein) под действием ряда протеиназ. Амилоидный пептид обладает высоко выраженными фибрилогенными свойствами и его олигомеры являются токсичными для нервных клеток, вызывая дегенерацию и гибель нейронов, и нарушение, в частности, холинергической синаптической передачи.
До недавнего времени считалось, что накопление амилоидных фибрилл в ткани мозга является необратимым, однако становится все более очевидным, что амилоидный метаболизм является динамическим процессом, зависящим как от разнообразных внутренних факторов (генетических, клеточных, васкулярных), так и факторов окружающей среды (например, гипоксия и стресс). Перечисленные факторы могут влиять как на формирование и накопление амилоидного пептида, так и на его деградацию различными амилоид-деградирующими ферментами и выведение его из мозга по периваскулярным путям. Поскольку частота проявлений болезни Альцгеймера в пожилом возрасте существенно повышается в связи с нарушением снабжения мозга кислородом при ишемии и инсультах, представляет большой интерес систематическое исследование влияния гипоксии и ишемии мозга на процессы образования р-амилоидного пептида, а также на активность и экспрессию в ткани мозга как амилоид-образующих, так и амилоид-деградирующих ферментов. На эту роль в последние годы претендует все большее число хорошо известных ферментов. Такое исследование представляет несомненную практическую ценность, поскольку позволяет не только ближе подойти к пониманию молекулярных основ патогенеза болезни Альцгеймера, но также открывает новые стратегические пути лечения и даже профилактики данного заболевания.
Общие представления о болезни Альцгеймера
Болезнь Альцгеймера является дегенеративным заболеванием центральной нервной системы, характеризующимся прогрессирующим снижением интеллекта, расстройством памяти и изменением поведения. Впервые это заболевание было описано в 1906 году немецким психологом Алоисом Альцгеймером, в честь которого оно и получило свое название. Подробное описание симптомов данного заболевания дано Альцгеймером в его наиболее часто цитируемой работе (Alzheimer, 1907), а также обобщено в обзоре, опубликованном в 1911 году (Alzheimer, 1911). Данное заболевание обычно возникает у людей пожилого и старческого возраста и его патогенез связан с накоплением в паренхиме мозга агрегатов р-амилоидного пептида в виде так называемых сенильных бляшек. Другим характерным морфологическим признаком болезни Альцгеймера является нарушение цитоскелета нервных клеток и накопление в них нейрофибриллярных клубков, состоящих в основном из нерастворимых филаментов гипер-фосфорилированного белка тау (Selkoe, DJ., 1986). Считается, что вначале появляются амилоидные фибриллы, которые нарушают функции нервных клеток, а затем в них происходит формирование нейрофибриллярных клубков (Oddo et al., 2003). Эти процессы ведут к дегенерации и гибели нейронов в основном в коре и гиппокампе мозга, вызывая нарушение синаптической, в основном, холинергической передачи (Curnmmgs. & Back, 1998; Oddo et al, 2006), хотя при данном заболевании также наблюдается снижение содержания серотонина, норэпинефрина и других моноаминов в ткани мозга (Palmer & DeKosky, 1993).
Диагностика болезни Альцгеймера (деменции альцгеймеровского типа), особенно на относительно ранних этапах ее течения, вызывает нередко серьезные трудности и требует дифференциации с иными формами психической патологии, сопровождающимися нарушениями разных сторон познавательной деятельности, поведения и социальной адаптации больного. Поэтому для постановки диагноза болезни Альцгеймера необходимо исключить другие вызывающие симптомы деменции заболевания, особенно те из них, что поддаются лечению, а именно опухоли, травмы, инфекции, нарушения обмена веществ, передозировка лекарственных препаратов, а также психические расстройства, такие, как депрессия или тревожные синдромы. Даже после исключения других заболеваний диагноз болезни Альцгеймера остается предположительным. Подтвердить его можно только микроскопическим исследованием мозговой ткани, которое обычно производится посмертно. В настоящее время разрабатываются методы прижизненной диагностики с помощью биопсии или сканирования мозга.
Модель пренатальной нормобарической гипоксии
Для получения животных, перенесших пренатальную гипоксию, беременные самки подвергались действию нормобарической гипоксической гипоксии на 13-1.4-й день развития плода. Гипоксические условия создавались в специальной камере емкостью 100 л, содержавшей системы терморегуляции, вентиляции, адсорбции выдыхаемого С02 и газового анализа. В ходе эксперимента содержание кислорода снижалось в камере с 21 до 7% в течение 10 минут, и удерживалось на этом уровне 3 часа. Концентрация углекислоты в камере не превышала 0.1%, а температура поддерживалась на уровне 22С. Контрольные самки содержались в течение этого же периода времени в клетке в том же помещении, но при нормальной концентрации кислорода. В ряде экспериментов животные проходили период прекондиционирования к мягкой гипоксии (15%, 2 часа) в той же камере в течение 3-х последовательных дней до воздействия острой гипоксии (02 7%, 3 часа) с интервалом перед каждым воздействием 24 часа.
Животные подвергались пренатальной гипоксии на стадии, когда в нервной трубке происходит активная пролиферация нейробластов и начинается формирование исследуемых структур головного мозга. На 13 день у эмбрионов крыс образуется сосудистая зона (Оленев, 1978). Миграция нейробластов в краевую зону, дающую начало неокортексу, начинается у крыс на 12-13 день эмбрионального развития, а формирование гиппокампа - на 13-14 день. Таким образом, гипоксическое воздействие на исследуемые структуры оказывали в критические сроки их формирования, в то время, когда они наиболее уязвимы.
Возрастные изменения экспрессии АРР и продукции его растворимых фрагментов в норме и после пренатальнои гипоксии
Для анализа возрастных изменений экспрессии мембраносвязанного АРР и эндогенной продукции его растворимьж фрагментов (sAPP) использовали экстрагируемые слабым солевым раствором и Тритоном-ХЮО фракции коры, стриатума, гиппокампа и амигдалы мозга крыс разного возраста. Динамика изменений изучалась как в структурах мозга контрольных животных, так и у потомства крыс, подвергнутого пренатальной гипоксии на 13-ый день эмбриогенеза. Результаты содержания АРР в сенсомоторной коре представлены на рисунке 6. Как видно из рисунка 6А, в нормальных условиях уровень содержания мембраносвязанного АРР увеличивался с 1 по 5-й день после рождения и затем практически не изменялся до 30 дня, однако снижался на более поздних сроках онтогенеза (к 180 дню), оставаясь приблизительно на таком же уровне до 600 дня жизни. У животных, перенесших пренатальную гипоксию, уровень экспрессии АРР в сенсомоторной коре существенно отличался от контрольных величии. Так в первый день после рождения его содержание было на 40% выше, чем у контрольных животных. Повышенное содержание мембраносвязанного АРР наблюдалось в этой структуре мозга практически на всех исследованных этапах постнатального онтогенеза, включая 180 и 600 дни.
В стриатуме контрольных животных наблюдалась отличная от коры картина возрастных изменений содержания мембраносвязанного АРР (рис. 6А). К моменту рождения содержание АРР в стриатуме было на 40% выше, чем в коре, однако оно падало к 10 дню, а затем снова повышалось к концу первого месяца и снижалось к 600 дню.
Общая оценка результатов исследования
В результате проведенных биохимических исследований показано, что гипоксия и ишемия мозга приводят к существенным изменениям уровня экспрессии предшественника амилоидного пептида и активности ферментов, участвующих в формировании амилоидного пептида и его деградации. Это, в свою очередь, может приводить к сдвигу амилоидного метаболизма в сторону накопления патологически высоких концентраций амилоидного пептида, являющегося одним из факторов патогенеза болезни Альцгеймера. Полученные данные позволяют объяснить наблюдаемый клиницистами факт повышения риска развития болезни Альцгеймера у людей, страдающих ишемией мозга, а также перенесших инсульты.
В данном исследовании впервые описана динамика экспрессии предшественника амилоидного пептида в сенсомоторной коре, стриатуме, гиппокампе и амигдале крыс в ходе постнатального онтогенеза. Выявленное нами повышенное содержание растворимых форм АРР (sAPP) в этих структурах мозга в течение первого месяца после рождения, когда формируется большинство синаптических связей между нервными клеткам и происходит интенсивное созревание нервной системы, а также снижение их содержания в процессе старения подтверждает роль sAPP в синаптогенезе, экспериментально выявленную рядом авторов в условиях in vitro. Уровень содержания sAPP также может свидетельствовать о повышении активности а- и р-секретаз в период интенсивного формирования нервной системы.
С использованием модели нормобарической гипоксии беременных крыс и тестирования потомства в постнатальном онтогенезе впервые показано, что пренатальная гипоксия приводит к существенным изменениям уровня экспрессии предшественника амилоидного пептида и дефициту активности а секретазы, расщепляющей этот белок по неамилоидогенному пути с образованием его нейропротекторной формы, а также способствующей формированию растворимой формы фермента АХЭ, обладающей свойствами фактора роста нервов. Это приводит к отставанию развития поведенческих реакций и дефициту обучения и памяти у животных, перенесших пренатальную гипоксию, и может быть причиной развития нейродегенеративных изменений мозга на более поздних этапах развития животных. Введение ингибитора а-секретазы батимастата в кору мозга крыс в период раннего постнатального онтогенеза также приводило к нарушению формирования краткосрочной памяти в период половозрелости животных, что свидетельствует о важной роли этого фермента в период интенсивного развития нейрональных сетей мозга. У взрослых животных введение батимастата также вызывало нарушение рабочей памяти, однако это явление носило краткосрочный характер.
