Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1. Понятие о циркадных ритмах. Роль и механизмы циркадных ритмов 12
1.1. Общая характеристика циркадных ритмов 12
1.2. Физиологические и биохимические механизмы регуляции циркадных ритмов ... 14
1.3. Молекулярно-генетические механизмы генерации циркадных ритмов 19
2. Роль циркадных генов в развитии патологических состояний организма 29
2.1. Ассоциация полиморфных маркеров циркадных генов с заболеваниями 29
2.2. Биохимические механизмы взаимосвязи циркадных генов и патологических процессов 32
3. Циркадные гены и сердечно-сосудистые патологии 35
3.1. Циркадные гены сердечно-сосудистой системы. Связь физиологических функций органов сердечно-сосудистой системы с циркадными ритмами 35
3.2. Механизмы влияния циркадных генов на развитие сердечно-сосудистых
патологий 39
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 46
1. Материал для исследования. Характеристика исследуемых групп доноров 46
2. Генотипирование 47
3. Определение уровня транскриптов генов 49
4. Иммуноферментный анализ 52
4.1. Количественное определение мелатонина в плазме крови 52
4.2.Количественное определение адренокортикотропного гормона в плазме крови... 53
4.3. Количественное определение кортизола в плазме крови 54
4.4. Количественное определение альдостерона в плазме крови 55
4.5. Количественное определение ангиотензинпревращающего фермента в плазме крови 56
4.6. Количественное определение тестостерона в плазме крови 57
4.7. Количественное определение ингибитора активатора плазминогена первого
типа в плазме крови 57
5. Определение липидного состава плазмы крови 58
5.1. Количественное определение общего холестерина 59
5.2. Количественное определение триглицеридов 59
5.3. Количественное определение холестерина липопротеинов высокой плотности... 60
5.4. Количественное определение холестерина липопротеинов низкой плотности 61
6. Статистическая обработка данных
ГЛАВА 3. Результаты исследования 63
1. Ассоциация полиморфных маркеров генов CLOCK и BMAL1 с риском развития ЭАГиИБС 63
1.1. Распределение частот аллелей и генотипов по полиморфным маркерам генов CLOCK и BMAL1 в контрольной группе и у пациентов, страдающих ЭАГ и ИБС 63
1.2. Связь полиморфных маркеров генов CLOCK и BMAL1 с риском развития ЭАГ и ИБС 70
2. Уровень транскриптов генов CLOCK, BMAL1 и PER1 в клетках буккального эпителия доноров контрольной группы и пациентов с диагнозом ЭАГ в зависимости от вариантов генов СЕОСКи BMAL1 72
2.1. Уровень транскриптов генов CLOCK, BMAL1 и PER1 в клетках буккального эпителия доноров контрольной группы и пациентов с диагнозом ЭАГ 72
2.2. Уровень транскриптов генов CLOCK, BMAL1 и PER1 в клетках буккального эпителия доноров контрольной группы в зависимости от вариантов генов CLOCK и BMAL1 74
2.3. Уровень транскриптов генов CLOCK, BMAL1 и PER1 в клетках буккального эпителия пациентов с диагнозом ЭАГ в зависимости от вариантов генов CLOCK и BMAL1 3. Содержание мелатонина в плазме крови больных ЭАГ и доноров контрольной группы в зависимости от вариантов генов CLOCKnBMALl 86
4. Содержание адренокортикотропного гормона в плазме крови больных ЭАГ и доноров контрольной группы в зависимости от вариантов генов CLOCKTABMALI 89
5. Содержание кортизола в плазме крови больных ЭАГ и доноров контрольной группы в зависимости от вариантов генов CLOCK и BMAL1 92
6. Содержание альдостерона в плазме крови больных ЭАГ и доноров контрольной группы в зависимости от вариантов генов CLOCKHBMALI 96
7. Содержание ангиотензинпревращающего фермента в плазме крови больных ЭАГ и доноров контрольной группы в зависимости от вариантов генов CLOCK и BMAL1 98
8. Содержание тестостерона в плазме крови мужчин в группе больных ЭАГ и в контрольной группе в зависимости от вариантов генов CLOCK и BMAL1 100
9. Содержание ингибитора активатора плазминогена первого типа в плазме крови и уровень транскриптов гена PAI-1 в клетках буккального эпителия доноров контрольной группы и пациентов с диагнозом ЭАГ в зависимости от вариантов генов CLOCKHBMALI 101
10. Липидный состав плазмы крови больных ЭАГ и ИБС и доноров контрольной группы в зависимости от вариантов генов CLOCK я BMAL1 107
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 115
1. Распределение частот аллелей и генотипов по полиморфным маркерам генов CLOCK и BMAL1 в контрольной группе и у пациентов, страдающих ЭАГ и ИБС. Связь полиморфных маркеров генов CLOCK и BMAL1 с риском развития ЭАГ и ИБС. 115
2. Уровень транскриптов генов CLOCK, BMAL1 и PER1 в клетках буккального эпителия доноров контрольной группы и пациентов с диагнозом ЭАГ в зависимости от вариантов генов CLOCK и BMAL1 119
3. Биохимические показатели плазмы крови доноров контрольной группы и пациентов с диагнозами ЭАГ и ИБС в зависимости от вариантов генов CLOCK и BMAL1 128
3.1. Содержание мелатонина в плазме крови больных ЭАГ и доноров контрольной группы в зависимости от вариантов генов CLOCKnBMALl 128
3.2. Содержание адренокортикотропного гормона в плазме крови больных ЭАГ и доноров контрольной группы в зависимости от вариантов генов CLOCK и BMAL1 131
3.3. Содержание кортизола в плазме крови больных ЭАГ и доноров контрольной группы в зависимости от вариантов генов CLOCK и BMAL1 134
3.4. Содержание альдостерона в плазме крови больных ЭАГ и доноров контрольной группы в зависимости от вариантов генов CLOCKaBMALl 138
3.5. Содержание ангиотензинпревращающего фермента в плазме крови больных ЭАГ и доноров контрольной группы в зависимости от вариантов генов CLOCK и BMAL1 141
3.6. Содержание тестостерона в плазме крови мужчин в группе больных ЭАГ и в контрольной группе в зависимости от вариантов генов CLOCKnBMALl 142
3.7. Содержание ингибитора активатора плазминогена первого типа в плазме крови и уровень транскриптов гена PAI-1 в клетках буккального эпителия доноров контрольной группы и пациентов с диагнозом ЭАГ в зависимости от вариантов генов CLOCKH BMAL1 146
3.8. Липидный состав плазмы крови больных ЭАГ и ИБС и доноров контрольной группы в зависимости от вариантов генов CLOCKH BMAL1 154
Заключение 163
Выводы 170
Перечень сокращений и условных обозначений 171
Список литературы
- Физиологические и биохимические механизмы регуляции циркадных ритмов
- Количественное определение кортизола в плазме крови
- Связь полиморфных маркеров генов CLOCK и BMAL1 с риском развития ЭАГ и ИБС
- Содержание альдостерона в плазме крови больных ЭАГ и доноров контрольной группы в зависимости от вариантов генов CLOCKaBMALl
Введение к работе
Актуальность темы. Биологические ритмы - фундаментальное свойство организмов, обеспечивающее их способность к адаптации и выживанию в циклически меняющихся условиях внешней среды. Центральное место среди ритмических процессов занимает пиркадный ритм, он относится к группе ритмов средних частот и имеет наибольшее значение для организма (Halberg, Reinberg, 1967), поскольку практически все физиологические и биохимические процессы организма подвержены суточным колебаниям (Otto et al., 2004). Циркадные ритмы организма запрограммированы системой циркадных генов, среди которых особое место занимают гены, кодирующие транскрипционные факторы, например CLOCK и ВМАЫ (Voinescu, 2009). В настоящее время не подвергается сомнению важная роль системы циркадных генов и кодируемых ими белков в регуляции метаболизма. В экспериментах с модельными объектами показано, что около 10% транскриптома регулируется пиркадными генами в печени (Akhtar et al., 2002), примерно столько же в сердце (Storch et al., 2002) и гипоталамусе (Panda et al., 2002). Циркадные гены регулируют гены многих ключевых, скорость-лимитирующих ферментов метаболизма (Oishi et al., 2003). Нарушения молекулярных механизмов регуляции работы циркадных генов могут приводить к дисрегуляции метаболических процессов (Marcheva et al., 2010) и развитию ряда патологий, в том числе кардиоваску-лярных расстройств (Takeda, Maemura, 2011). Все чаще циркадные гены рассматриваются как гены-кандидаты, участвующие в этиологии и патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) (Anea et al., 2009; Curtis et al., 2007; Woon et al., 2007). Однако такого рода сведения малочисленны и касаются в основном экспериментов на модельных объектах. А механизмы, посредством которых варианты циркадных генов могут участвовать в развитии сердечнососудистых патологий, практически не изучены.
Степень разработанности темы. Популяционные исследования, касающиеся изучения роли однонуклеотидных замен в генах циркадных ритмов в развитии ССЗ, малочисленны. Так, обнаружена ассоциация мутации в интроне гена ВМАЫ с развитием артериальной гипертензии у жителей Великобритании (Woon et al., 2007). Другими авторами показана ассоциация с развитием гипертензии одной из мутаций гена NPAS2 в финской популяции (Englund et al., 2009). Нужно отметить, что исследования по оценке риска возникновения ССЗ в зависимости от вариантов генов циркадного ритма в популяциях жителей России не проводились. Известно, что многие гены, вовлеченные в работу сердечно-сосудистой системы, экспрессируются по циркадному типу (Rudic et al., 2005; Saifur et al., 2005; Guney et al., 1999). Уровень транскришов этих генов регулируется генами циркадных ритмов и зависит от колебаний их экспрессии. На данный момент имеются сведения о молекулярных механизмах
регуляции циркадными генами транскрипционной активности генов-мишеней, вовлеченных в регуляцию гемостаза (Schoenhard et al., 2003), кровяного давления (Doi et al., 2010). Большинство работ по изучению биохимических механизмов связи вариантов циркадных генов с развитием ССЗ касаются отдельных биохимических показателей и выполнены с привлечением модельных объектов (Doi et al., 2010; Somanath et al., 2011; Anea et al., 2009). Комплексное исследование биохимических показателей у человека в зависимости от генотипа по полиморфным маркерам циркадных генов ранее не проводилось.
Цель работы - изучение биологической роли вариантов генов циркадных ритмов в изменении биохимических показателей при развитии эссенциальной артериальной гипертензии и ишемической болезни сердца (на примере населения Карелии).
Задачи исследования:
-
Проанализировать распределение частот аллелей и генотипов по полиморфным маркерам генов CLOCK и BMAL1 у людей, страдающих эссенциальной артериальной гипертензией (ЭАГ) (I-II стадии, степень АГ 1-2) и ишемической болезнью сердца (ИБС) (острым инфарктом миокарда) (ОИМ), и у людей без клинических проявлений данных заболеваний в зависимости от пола пациентов. Оценить риск развития данных заболеваний у носителей разных генотипов по полиморфным маркерам генов CLOCK и ВМАЫ.
-
Провести сравнительное изучение уровней транскриптов генов CLOCK, BMAL1 и PER1 в клетках буккального эпителия у носителей разных генотипов по полиморфным маркерам генов CLOCK и BMAL1 в группе людей, страдающих ЭАГ (I-II стадии, степень АГ 1-2), и у людей без клинических проявлений данного заболевания.
-
Исследовать содержание некоторых гормонов (мелатонина, адренокор-тикотропного гормона, кортизола, альдостерона, тестостерона), ангиотензин-преврашающего фермента, ингибитора активатора плазминогена первого типа в плазме крови, а также уровень экспрессии гена PAI-1 у носителей разных генотипов по полиморфным маркерам генов CLOCK и BMAL1 в группе людей, страдающих ЭАГ (I-II стадии, степень АГ 1-2), и у людей без клинических проявлений данного заболевания.
-
Провести сравнительный анализ липидного состава плазмы крови у носителей разных генотипов по полиморфным маркерам генов CLOCK и BMAL1 в группах людей с диагнозами ЭАГ (I-II стадии, степень АГ 1-2) и ИБС (ОИМ) и у людей без клинических проявлений данных заболеваний.
Научная новизна. Впервые исследовано распределение частот аллелей и генотипов по полиморфным маркерам генов CLOCK и BMAL1 в российской популяции (у жителей республики Карелия). Впервые проведена оценка риска
развития ЭАГ (І-П стадии, степень АГ 1-2) и ИБС (ОИМ) у носителей определенных вариантов генов CLOCK и BMAL1. Впервые выявлена связь между полиморфными маркерами 3111ТС, 862ТС и 257TG гена CLOCK и развитием ЭАГ и ИБС (ОИМ).
Впервые получены данные о динамике уровней транскриптов циркадных генов CLOCK, BMAL1, PERI и гена PAI-1 в клетках буккального эпителия людей с диагнозом ЭАГ (I-II стадии, степень АГ 1-2) и доноров контрольной группы в зависимости от генотипа по четырем полиморфным маркерам гена CLOCK и одному полиморфному маркеру гена BMAL1. Впервые показаны достоверные различия уровней экспрессии основных генов циркадных ритмов CLOCK, BMAL1 и PER1 у носителей разных генотипов по полиморфным маркерам 3111ТС и 257TG регуляторных областей гена CLOCK Впервые показано, что уровни транскриптов гена PAI-1 у больных ЭАГ (I-II стадии, степень АГ 1-2) и доноров без клинических проявлений ЭАГ и ИБС различаются в зависимости от генотипа по полиморфному маркеру 3111ТС гена CLOCK
Впервые проведено исследование комплекса биохимических показателей плазмы крови носителей разных генотипов по полиморфным маркерам генов CLOCK и BMAL1, страдающих ЭАГ (I-II стадии, степень АГ 1-2), и людей без клинических проявлений данного заболевания. Проведено сравнительное изучение концентрации некоторых гормонов (мелатонина, адренокортикотропно-го гормона (АКТГ), кортизола, альдостерона, тестостерона), ангиотензинпрев-ращающего фермента (АПФ), ингибитора активатора плазминогена первого типа (PAI-1) в плазме крови. Выявлены достоверные различия уровней гормонов (мелатонина, АКТГ, тестостерона) и содержания PAI-1 в плазме крови у носителей разных генотипов по полиморфным маркерам регуляторных областей гена CLOCK, ассоциированным с риском развития ЭАГ и ИБС. Впервые показаны различия в содержании определенных фракций липидов в плазме крови у носителей разных генотипов по полиморфным маркерам гена CLOCK с диагнозами ЭАГ (I-II стадии, степень АГ 1-2) и ИБС (ОИМ).
Теоретическая и практическая значимость работы. Значение результатов диссертационной работы для фундаментальной биологии и медицины заключается в получении новых сведений о роли вариантов циркадных генов в механизмах регуляции метаболизма человека и в развитии ССЗ. Полученные результаты могут служить основой для дальнейшего изучения системы циркадных генов и их продуктов в молекулярно-генетическом и физиолого-биохимическом аспектах. Варианты гена CLOCK, для которых показана связь с риском развития ЭАГ и ИБС, могут быть использованы в качестве дополнительного критерия для оценки предрасположенности к ССЗ у жителей республики Карелия. Проведенный анализ комплекса биохимических показателей плазмы крови у носителей разных генотипов по полиморфным маркерам генов
CLOCK и BMAL1 будет полезен для корректировки медикаментозного лечения и профилактики осложнений ССЗ. Материалы диссертации могут быть использованы в лекционных курсах по клинической биохимии, молекулярной биологии и генетике для студентов биологических и медицинских факультетов вузов, для написания учебных пособий, монографической литературы. Положения, выносимые на защиту:
-
Полиморфные маркеры 3111ТС, 862ТС и 257TG гена транскрипционного фактора CLOCK ассоциированы с риском развития ЭАГ (I-II стадии, степень АГ 1-2) и ИБС (ОИМ) у жителей Республики Карелия.
-
Наличие однонуклеотидных замен в регуляторных областях гена CLOCK может приводить к изменению уровней транскриптов как самих циркадных генов {CLOCK, BMAL1, PERI), так и генов-мишеней (PAI-1).
-
Варианты регуляторных областей гена CLOCK, ассоциированные с риском развития ЭАГ и ИБС, могут влиять на уровень гормонов (мелатонина, АКТГ, тестостерона), содержание регулятора фибринолитичекого каскада PAI-1 и липидный состав плазмы крови.
Достоверность результатов. Результаты получены современными биохимическими и молекулярно-генетическими методами. Основные выводы работы и выносимые на защиту положения являются обоснованными и полностью соответствуют полученным результатам. Достоверность выводов подтверждается корректной статистической обработкой данных.
Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены и обсуждены на российских и международных научных мероприятиях: Всероссийский научно-образовательный форум «Профилактическая кардиология 2010» (Москва, 2010); VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (Москва, 2010); 11-ая Международная научно-практическая конференция «Высокие технологии, образование, промышленность» (Санкт-Петербург, 2011); IV Всероссийская конференция с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека» (Ульяновск, 2011); ГХ молодежная научно-практическая конференция «Интеллектуальный потенциал XXI века: ступени познания» (Новосибирск, 2012); I и П Международная интернет-конференция «Медицина в XXI веке: традиции и перспективы» (Казань, 2012, 2013); Всероссийская научно-практическая конференция «Актуальные проблемы лабораторной диагностики и биотехнологии» (Кемерово, 2012); IV Всероссийская научная конференция с международным участием «Экологические проблемы северных регионов и пути их решения» (Апатиты, 2012); II Всероссийская научная конференция молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (результаты отмечены дипломом Ш степени за устный доклад) (Санкт-Петербург, 2012); Международный форум
по проблемам науки, техники и образования «III тысячелетие - новый мир» (Москва, 2012). Работа прошла апробацию на объединенном семинаре лаборатории генетики, лаборатории экологической биохимии ИБ КарНЦ РАН и лаборатории молекулярной генетики врожденного иммунитета ПетрГУ.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК. Исследования проводились при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 гг.», № г.р. 01201056445, ГК № 02.740.11.0700; программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине»; Гранта Президента РФ «Ведущие научные школы РАН» НШ-3731.2010.4; Гранта Правительства РФ по постановлению №220 (вед. ученый АН. Полторак); Гранта Российского фонда фундаментальных исследований 12-04-31368 мола
Личный вклад автора. Личный вклад автора в работу включал разработку идей, последовательное планирование и постановку комплексных экспериментов, обработку и анализ полученных данных, участие в написании статей.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 198 страницах машинописного текста, содержит 34 таблицы, 56 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов. Список литературы включает 361 источник, в том числе 326 работ зарубежных авторов.
Физиологические и биохимические механизмы регуляции циркадных ритмов
Свет представляет собой первично-периодический фактор: закономерная смена дня и ночи, как и сезонные изменения длины светлой части суток, происходят с определенной ритмичностью. Для гомойотермных животных основным триггером является фотопериод (длительность суточной и сезонной освещенностей). Фотопериодическая система организма представляет собой нейрофункциональную систему, воспринимающую изменение длительности суточной (циркадный компонент) и сезонной (циркануальный компонент) освещенностей [31]. В составе циркадной компоненты фотопериодической системы выделяют следующие элементы: световоспринимающий аппарат; основной пейсмейкер организма -супрахиазматическое ядро (СХЯ) гипоталамуса; нервная эффекторная цепь, передающая информацию на периферию к органам и тканям; эпифиз, трансформирующий информацию об изменении освещенности в нейроэндокринный ответ; нейросекреторные ядра гипоталамуса и туберальная часть гипофиза как гуморальные эффекторные элементы; внутренние нейрональные и гуморальные связи, соединяющие элементы системы между собой [250].
В 1972 году американским исследователям Роберту Муру и Виктору Эйхлеру удалось показать, что циркадным ритмом млекопитающих управляет СХЯ, расположенное в головном мозге в основании гипоталамуса. Показано, что СХЯ способно in vitro генерировать устойчивые циркадные циклы изменения электрической активности, концентрации Са + в цитоплазме [157] и генной экспрессии [351]. Об особой устойчивости циркадных ритмов, генерируемых в СХЯ, свидетельствует тот факт, что единственный нейрон СХЯ в дисперсной культуре показывает циркадный ритм электрической активности [336]. В отдельных экспериментах показана координирующая роль СХЯ переднего гипоталамуса и эпифиза в циркадной организации многих физиологических функций [222]. Эти ядра расположены над перекрестом зрительных нервов и включают у человека около 20 тысяч нейронов, частота электрических потенциалов которых колеблется спонтанно. Каждое СХЯ способно генерировать собственный автономный циркадный ритм, а также подчинять ритму другие системы организма.
Первичный синхронизатор циркадных ритмов в окружающей среде у млекопитающих -суточный цикл света/темноты. Информация об изменении освещенности поступает в организм через световоспринимающие рецепторы. У разных животных расположение этих рецепторов существенно отличается. У рыб, амфибий и рептилий фоторецептором является непосредственно эпифиз, у птиц он расположен в гипоталамо-гипофизарном тракте. У млекопитающих циркадный ритм организма синхронизируется с периодом светового дня посредством глутамат-эргической иннервации СХЯ, которое принимает сигнал из сетчатки глаза [36]. Обнаружено, что отходящие от сетчатки пути имеют переключения в СХЯ (главный зрительный тракт, верхние и нижние добавочные тракты и ретино-гипоталамический тракт) [188]. Сигнал с фоторецепторов поступает в супрахиазматическое ядро, где активируется генная экспрессия через каскад Са2+-зависимых казеинкиназ, которые являются полифункциональными серин/треониновыми протеинкиназами. Эти ферменты индуцируют экспрессию генов, содержащих CRE-элементы (Са +- cyclic AMP response elements). К таким генам относятся циркадные гены Perl и Рег2 [309].
Фоторецепция в сетчатке осуществляется палочками и колбочками, кроме того, существует другая фоторецепторная система, основу которой составляет меланопсин, экспрессирующийся в ганглионарных клетках сетчатки, которые посылают сигнал напрямую в СХЯ [143]. На мышах показано, что мутанты, у которых утрачена функция фоторецепции палочек и колбочек, сохраняют способность к фоторецепции [40]. Нокаут гена меланопсина у мышей приводит к ослаблению ответных реакций на свет in vivo, при этом светочувствительность сохраняется [245]. Известен еще один участник фоторецепции -криптохром, выполняющий функцию циркадного фоторецептора у растений и насекомых; у млекопитающих в геноме есть ген криптохрома, но фоторецепторная функция белка утрачена. Мутантные мыши с отсутствием криптохромов, палочек и колбочек, частично утрачивают фоточувствительность, в то время как мыши с отсутствием меланопсина, палочек и колбочек утрачивают ее полностью [40]. Таким образом, вопрос о фоторецепторах, передающих информацию в СХЯ, остается малоизученным.
Под влиянием внешнего освещения СХЯ посредством химических сигналов (цАМФ, протеин-киназа С, глюкокортикоиды, ионы Са2+) синхронизирует периферические осцилляторы в тканях, вызывая экспрессию генов циркадного ритма, ответственных за цикличность биохимических процессов и запускающих транскрипцию соответствующих генов [125]. Кроме того, клетки периферических тканей и органов способны генерировать собственные ритмы и изменять их в соответствии с локальными потребностями [52]. Циркадная регуляция циклов суточной активности включает также паракринную регуляцию. Например, СХЯ секретирует трансформирующий фактор роста-а [180]. Секреция других регуляторных молекул, таких как мелатонин и кортикостероиды, зависит от интеграции взаимодействий нейронов [64].
СХЯ передает сигнал в периферические органы и ткани организма, роль посредника в этом процессе выполняет основной индоламин эпифиза - мелатонин (1Ч-ацетил-5-метокситриптамин). Выявлено, что фотопериодическая информация, переключаясь в СХЯ, поступает через ряд звеньев к эпифизу, в ответ на сигнал из СХЯ эпифизом секретируется мелатонин. Мелатонин по принципу обратной связи ограничивает ритмичность и метаболические процессы в этих ядрах. В настоящее время выявлен широкий спектр биологической активности мелатонина, участвующего в регуляции центральной и автономной нервных систем, эндокринных органов и иммунной системы. Молекула этого гормона небольших размеров и высоко липофильна, в силу чего для нее не существует в организме никаких преград, включая плацентарный и гемато-энцефалический барьеры [85]. У млекопитающих выброс эпифизарного мелатонина контролируется СХЯ. СХЯ и эпифиз млекопитающих - основные составляющие биологических часов в организме, находящиеся между собой во взаимотормозящих отношениях. Яркий свет стимулирует нейроны СХЯ, но тормозит выработку мелатонина эпифизом. В свою очередь, мелатонин, из-за высокой насыщенности высокочувствительными рецепторами СХЯ и смежных участков преоптической области, способен блокировать активность СХЯ. При этом мелатонин взаимодействует с веществами, модулирующими активность СХЯ: нейромедиаторами (глутамат и серотонин) и нейропептидами (нейропептидтирозин и вещество П). Таким способом в системе внутрисуточной ритмики млекопитающих поддерживается динамический гомеостаз [59].
В последнее время к структурам, участвующим в синхронизации биоритмов, помимо СХЯ и эпифиза, относят гиппокамп. Считают, что от анализаторных систем информация (сигналы о временных интервалах) приходит и в лимбическую систему (в частности, в гиппокампальный круг), где происходит конвергенция афферентных импульсов разной модальности. Гиппокамп по эфферентным связям передает длительные тонические разряды к различным двигательным и вегетативным образованиям. Отношения между гиппокампом и мозговыми структурами (СХЯ, эпифиз), участвующими в синхронизации биоритмов, определяют как реципрокные и функционально конкурентные. Показана физиологическая роль СХЯ в синхронизации, а гиппокампа - в десинхронизации колебательных процессов [3].
Особенностью продукции мелатонина эпифизом является выраженная циркадная цикличность с пиками в ночное время. Наступление темноты является внешнесредовым сигналом, запускающим синтез и секрецию мелатонина эпифизом. Обычно концентрация мелатонина начинает возрастать за два часа до привычного для данного человека времени отхода ко сну. Даже кратковременное освещение подавляет процесс синтеза данного биогенного амина независимо от пола и от того, какой образ жизни ведет животное - дневной, ночной или сумеречный [248]. В связи с четким суточным ритмом секреции и зависимостью ее от длительности фотопериода, мелатонин считают координатором циркадного и сезонного ритмов [19]. Нейротрансмиттером, регулирующим повышение ночной активности биосинтеза мелатонина в эпифизе, является норадреналин. Последний усиленно вырабатывается в темное время суток окончаниями симпатических нервов и активизирует р-адренорецепторы эпифиза и в меньшей степени а-адренорецепторы. Во второй половине ночи у дневных животных и человека существенно повышается чувствительность и растет плотность р-адренорецепторов пинеалоцитов. В условиях темноты у млекопитающих норадреналин, высвобождаясь из симпатических терминален и связываясь с (3-адренорецепторами на наружной мембране пинеалоцитов, обусловливает возрастание активности внутриклеточной аденилатциклазы, что влечет за собой увеличение продукции цАМФ и активацию цАМФ-зависимой протеинкиназы. Протеинкиназа активирует специфический Gs-белок, который стимулирует транскрипцию гена, кодирующего N-ацетилтрансферазу. При возрастании количества фермента в пинеалоцитах интенсифицируется процесс превращения серотонина в мелатонин [19].
80% мелатонина синтезируется в эпифизе, кроме того, выявлены клетки, синтезирующие мелатонин экстрапинеально: в желудочно-кишечном тракте, дыхательных путях, поджелудочной железе, надпочечниках, щитовидной железе, тимусе, мозжечке, мочеполовой системе, плаценте, печени, почках и других органах. Экстрапинеальный мелатонин обнаружен также в тучных клетках, естественных киллерах, эозинофильных лейкоцитах, тромбоцитах, эндотелиоцитах [63]. Такое широкое распространение мелатонина отражает его важную роль как межклеточного нейроэндокринного регулятора и координатора многих сложных и взаимосвязанных биологических процессов.
Количественное определение кортизола в плазме крови
Циркадная периодичность физиологических показателей и процессов систем органов организма обусловлена циркадными изменениями экспрессии многих генов, которые, в свою очередь, регулируются генами циркадных ритмов и зависят от колебаний их экспрессии. Кроме того, оказалось, что уровень транскриптов генов циркадных ритмов отличается в контрольных группах и группах объектов, имеющих различные патологии.
Есть сведения, показывающие, что изменения в экспрессии циркадных генов и развитие злокачественных новообразований связаны между собой. Например, показано значительное уменьшение уровня экспрессии гена PER1 в спорадических опухолях груди у женщин по сравнению с нормальными тканями. Кроме того, обнаружено достоверное уменьшение уровня транскрипции гена PER1 и гена PER2 в наследуемых опухолях груди по сравнению со спорадическими [342]. Изменения экспрессии гена PER] могут быть обусловлены снижением количества или отсутствием эстрогенового рецептора в клетках. Эти результаты указывают на роль как PER1, так и PER2 в нормальном функционировании клеток молочных желез у женщин. Вероятно, нарушение регуляции циркадных генов в этих клетках может быть важным фактором в развитии семейной формы рака груди. Действительно, снижение экспрессии циркадных генов может влиять на трансактивацию сигналов, которые управляют клеточным циклом и на способность клеток подвергаться апоптозу, потенциально способствуя канцерогенезу [342]. В настоящее время многие авторы считают, что изменение экспрессии циркадных генов может служить биомаркером опухолевых процессов. Показано изменение по сравнению с контролем экспрессии циркадных генов в опухолях груди [81], толстой кишки [181] и других органов.
Таким образом, наличие полиморфных сайтов в генах циркадных ритмов, а также изменения их транскрипционной активности, могут ассоциироваться с развитием некоторых полигенных заболеваний. Однако, как отмечено выше, механизмы, посредством которых гены околосуточных ритмов участвуют в формировании различных патологий, до конца не выяснены. Основываясь на данных литературы, можно выдвинуть несколько предположений относительно механизмов влияния циркадных генов на опухолевый процесс. Например, известно, что под контролем циркадных генов находятся гены, которые играют существенную роль в регуляции клеточного цикла. В связи с этим логичным выглядит предположение о том, что связь между нарушением циркадного ритма и возникновением опухолей опосредована изменением процессов клеточной пролиферации. Так, транскрипционный димер CL0CK:BMAL1 непосредственно контролирует экспрессию гена Weel, который регулирует переход G2/M в клеточном цикле [212]. Другое предположение касается роли циркадных генов в репарации ДНК и апоптозе. Так, в экспериментах in vitro на клетках линии НСТ116 (рак толстого кишечника) было показано, что трансфекция гена Perl при последующем облучении клеток ионизирующей радиацией в дозе 10 Гр приводит к их апоптозу, запускаемому радиационным повреждением ДНК. В случае ингибирования экспрессии гена Perl радиационное повреждение клеток не вызывает апоптоза, и такие клетки продолжают делиться [130]. Эти данные свидетельствуют о том, что гены Per являются потенциальными супрессорами опухолевого роста.
В настоящее время появились работы по исследованию экспрессии циркадных генов в связи с изучением их возможной роли в патогенезе других заболеваний, например, диабета 2 типа и ожирения. Так, обнаружено, что уровень транскриптов генов PER2, PER3 и CRY2 достоверно ниже в (3-клетках доноров, страдающих диабетом 2 типа, по сравнению с контролем. Кроме того, экспрессия этих генов в (3-клетках положительно коррелирует с содержанием инсулина, а для генов PER3 и CRY2 показана отрицательная корреляция их экспрессии с уровнем гликолизированного гемоглобина [294]. Авторы предполагают, что изменения в функционировании циркадных компонентов могут вносить вклад в патогенез диабета 2 типа. Экспрессия генов PER2, BMAL1, и CRY1 изучалась также у пациентов, страдающих ожирением. Уровень транскриптов этих генов в жировой ткани оказался значительно выше у женщин по сравнению с мужчинами, и наблюдалась достоверная корреляция экспрессии циркадных генов с уровнями холестерина липопротеинов низкой и высокой плотности [134].
Как уже упоминалось, экспрессия многих генов в организме регулируется продуктами циркадных генов. Циркадным колебаниям подвержены многие биохимические показатели клетки. Например, исследование транскриптома в аорте мышей показало, что из 7000 генов около половины экспрессируются по циркадному типу, среди них гены, участвующие в процессах фолдинга и деградации белков, метаболизма глюкозы и липидов, созревании адипоцитов [269].
При обнаружении связи определенных вариантов циркадных генов с тем или иным фенотипом требуется изучение биохимических механизмов этой взаимосвязи. Эта задача реализуется исследователями с помощью двух основных подходов.
Первый подход связан с оценкой ассоциации определенных вариантов гена с тем или иным биохимическим показателем. Например, при исследовании жителей Финляндии было показано, что однонуклеотидный полиморфизм в гене PER2 ассоциируется с изменениями концентрации глюкозы в плазме, причем у носителей минорного аллеля снижен риск повышения содержания глюкозы в крови. В то же время различий в содержании в плазме крови холестерина липопротеидов низкой плотности у носителей разных генотипов по данному полиморфному маркеру не обнаружено [116]. При изучении ассоциации полиморфных маркеров гена CLOCK с метаболическим синдромом у жителей Великобритании обнаружена ассоциация некоторых гаплотипов с уровнем лептина в плазме крови пациентов [285]. В японской популяции человека была обнаружена связь однонуклеотидной замены 3111ТС гена CLOCK с содержанием липопротеинов низкой плотности [310].
Другой подход в изучении связи вариантов циркадных генов и биохимических показателей связан с использованием модельных объектов с мутантными, нокаутированными или делегированными генами. Описана роль Bmall и Clock в регулировании гомеостаза глюкозы. Нокаут генов Bmall и Clock у мышей подавляет суточные изменения уровней глюкозы и триглециридов. Удаление Bmall останавливает глюконеогенез, мутация Clock снижает интенсивность процесса, но регуляторный ответ кортикостерона и глюкагона на индуцированную инсулином гипогликемию остается. Кроме того, высокожирная диета модулирует метаболизм углеводов через увеличение амплитуды циркадных изменений толерантности к глюкозе и чувствительности к инсулину. Bmall и Clock осуществляют глубокий контроль над восстановлением после инсулин-зависимой гипогликемии [270]. У мутантных по Clock мышей нарушена толерантность к глюкозе, снижена секреция инсулина и наблюдаются дефекты пролиферации Р-клеток поджелудочной железы. Нарушение экспрессии Clock приводит к изменениям в экспрессии множества генов транскриптома Р-клеток, вовлеченных в процессы роста, везикулярного транспорта и других [205].
С помощью нокаута генов на мышах была показана роль циркадных генов в процессах репродукции. У нокаутов по гену Bmall был нарушен стероидогенез, самцы и самки утрачивали фертильность, у самцов наблюдался низкий уровень тестостерона и высокий уровень лютеинизирующего гормона. Авторы предположили, что это связано с понижением экспрессии гена StAR, продукт которого регулирует скорость-лимитирующую стадию стероидогенеза у мышей [41].
Связь полиморфных маркеров генов CLOCK и BMAL1 с риском развития ЭАГ и ИБС
Для проведения иммуноферментного анализа (ИФА) использованы следующие приборы: центрифуга 5417С («Eppendorf AG», Германия), термостат суховоздушный для планшетов с функцией орбитального шейкера ТСП-37-01 («Март ППП», Россия), вортекс V-l plus («BIOSAN» Латвия), промыватель планшетный ПП2-428 («Иммедтех», Россия), роторный испаритель RE-52AA («YARONG», Китай), анализатор иммуноферментный фотоэлектрический АИФ-Ц-01С (ООО «Системы анализа», Россия).
В качестве материала для ИФА использовали плазму крови, которую получали центрифугированием (15 мин при 1800 об/мин) дозы консервированной венозной крови (в качестве антикоагулянта использовали 0,5М ЭДТА) и выделением из нее нативной плазмы, собирающейся в верхней части пробирки с кровью после осаждения форменных элементов. Забор крови производился строго натощак в 8 часов утра.
Все определения проводили в двух аналитических повторностях, результат рассчитывался как среднее арифметическое двух определений. Контроль качества анализа проводился путем сравнения результатов измерений всех стандартов и контролей, поставляемых с набором, с диапазоном допустимых значений, указанных изготовителем в сертификате контроля качества. Для получения калибровочной кривой по результатам измерения оптической плотности стандартов использовали автоматический метод расчетов, осуществляемый на анализаторе АИФ-Ц-01С. Концентрацию аналитов в образцах определяли в автоматическом режиме из соответствующей калибровочной кривой.
Для определения концентрации мелатонина в плазме крови использованы 40 образцов крови больных ЭАГ, 40 - доноров контрольной группы (с равным количеством мужчин и женщин в каждой группе). Средний возраст пациентов с диагнозом ЭАГ составлял 47,6±1,5 лет. Средний возраст людей из контрольной группы составлял 45,5±1,3 года. Концентрацию мелатонина в плазме крови определяли методом твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа (ELISA - enzyme linked immunosorbent assay) с использованием набора для ИФА («IBL International GmbH», Германия).
Этапы ИФА мелатонина:
Процедура экстракции образцов, стандартов и контролей (на колонках для экстракции). В колонки для экстракции (поставляются в наборе для ИФА) вносили по 1 мл неразведенного метанола, центрифугировали в течение 1 мин при 10000 об/мин. Элюат удаляли. Затем в колонки вносили по 1 мл бидистиллированной воды, центрифугировали в течение 1 мин при 10000 об/мин. Элюат удаляли. Вносили по 0,5 мл стандартов, контролей и образцов в колонки, затем по 0,5 мл бидистиллированной воды, центрифугировали в течение 5 мин при 10000 об/мин. Элюат удаляли. Дважды промывали колонки с образцами, стандартами и контролями 1 мл 10 % раствора метанола в бидистиллированной воде, центрифугировали в течение 5 мин при 10000 об/мин. Элюат удаляли. Элюировали экстракты 1 мл неразведенного метанола при центрифугировании в течение 1 мин при 10000 об/мин. Испаряли метанол с помощью роторного испарителя, перерастворяли сухие образцы в 0,15 мл бидистиллированной воды. Перемешивали на вортексе не менее 1 минуты и немедленно приступали к анализу.
Процедура анализа. В соответствующие лунки микропланшета (покрытые козьими поликлональными анти-кроличьими антителами) вносили по 50 мкл каждого экстракта стандарта, экстракта контроля и экстракта образца, затем по 50 мкл мелатонин-биотина и по 50 мкл антисыворотки (кроличей, поликлональной) к мелатонину. Инкубировали в течение 14-20 ч при 2-8С. Лунки микропланшета промывали трижды фосфатным буфером. В каждую лунку вносили по 150 мкл свежеприготовленного ферментного конъюгата (содержит антитела к биотину (козьи), конъюгированные с щелочной фосфатазой). Инкубировали 120 мин при температуре 25С в термостате с функцией орбитального шейкера при средней частоте встряхивания. Лунки промывали 3 раза фосфатным буфером. В лунки микропланшета вносили по 200 мкл свежеприготовленного PNPP субстратного раствора (р-нитрофенил фосфат в PNPP субстратном буфере, содержащем диэтаноламин, воду). Инкубировали в течение 40 мин при температуре 25С.
Останавливали реакцию добавлением PNPP стоп-раствора (содержит 1М NaOH, 0,25М EDTA). Измерение оптической плотности проводили при длине волны 405 нм (длина волны сравнения 620 нм) на анализаторе АИФ-Ц-01С в течение 60 мин после добавления стоп-раствора. Построение калибровочной кривой по результатам измерения оптической плотности и определение концентрации мелатонина в плазме крови проводили в автоматическом режиме.
Для определения концентрации адренокортикотропного гормона (АКТГ) в плазме крови использованы 39 образцов крови больных ЭАГ (19 мужчин, 20 женщин), 39 - доноров контрольной группы (19 мужчин, 20 женщин). Средний возраст пациентов с диагнозом ЭАГ составлял 47,4±1,5 лет. Средний возраст людей из контрольной группы составлял 46,1 ±1,3 года. Концентрацию АКТГ в плазме крови определяли методом твердофазного неконкурентного ИФА («сэндвич»-метода) с использованием набора для ИФА («Biomerica», США).
В соответствующие лунки микропланшета (покрытые стрептавидином) вносили по 200 мкл каждого стандарта, контроля и образца, затем по 25 мкл биотинилированных антител к АКТГ (аффинно очищенных козьих анти-человечьих), затем по 25 мкл антител к АКТГ (мышиных моноклональных анти-человечьих), меченных пероксидазой. Инкубировали в темноте в течение 35 мин при температуре 25С в термостате с функцией орбитального шейкера при средней частоте встряхивания. Лунки микропланшета промывали 5 раз буфером для промывок, содержащим поверхностно-активные вещества. Вносили по 150 мкл раствора субстрата ТМБ (тетраметилбензидина) в каждую лунку. Инкубировали в темноте в течение 4,5 ч при температуре 25С.
Останавливали реакцию добавлением стоп-раствора (IN серная кислота). Измерение оптической плотности проводили при длине волны 450 нм на анализаторе АИФ-Ц-01С в течение 10 мин после добавления стоп-раствора. Затем проводили аналогичное измерение оптической плотности при длине волны 405 нм, которое предназначено для расширения диапазона достоверных измерений калибровочной кривой на значение, получаемое для самого высокого стандарта, с концентрацией приблизительно 500 пг/мл.
Построение калибровочной кривой по результатам измерения оптической плотности и определение концентрации АКТГ в плазме крови проводили в автоматическом режиме. Проводилось построение двух калибровочных кривых - по результатам измерений оптической плотности при длине волны 450 нм, полученных для первых пяти стандартов, поставляемых с набором, т.е. стандартов с концентрациями АКТГ от 0 до 185 пг/мл; и по результатам измерений оптической плотности при длине волны 405 нм, полученных для трех стандартов с самыми высокими концентрациями, поставляемых с набором, т.е. стандартов с концентрациями АКТГ от 67 до 528 пг/мл. Концентрацию АКТГ в образцах определяли из соответствующей калибровочной кривой. Таким образом, концентрации АКТГ, превышающие 150 пг/мл, могли быть рассчитаны с использованием результатов считывания при 405 нм. В общем случае, при концентрациях АКТГ до 150 пг/мл, содержание АКТГ в образцах плазмы пациентов и контролях были рассчитаны по результатам измерений при длине волны 450 нм.
Содержание альдостерона в плазме крови больных ЭАГ и доноров контрольной группы в зависимости от вариантов генов CLOCKaBMALl
В результате анализа динамики экспрессии гена CLOCK в группе больных ЭАГ, достоверных различий уровней транскриптов данного гена у носителей разных генотипов по маркеру 2121GA гена CLOCK и маркеру 56445ТС гена BMAL1 не обнаружено ни в одной временной точке наблюдения (данные не показаны).
При изучении динамики экспрессии гена BMAL1 в буккальном эпителии пациентов с диагнозом ЭАГ с разными генотипами по исследуемым полиморфным маркерам, как и в случае доноров контрольной группы, для носителей всех генотипов выявлена общая тенденция снижения концентрации транскриптов этого гена в период с 9 до 17 часов.
Достоверные различия уровней транскриптов гена BMAL1 у носителей разных генотипов выявлены только по полиморфному маркеру 257TG промоторной области гена CLOCK (Рисунок 23). У носителей GG генотипа по данному маркеру регистрируется наименьший уровень экспрессии гена BMAL1, по сравнению с носителями других генотипов, во всех временных точках; при этом уровни транскриптов гена BMAL1 у носителей генотипов ТТ и TG достоверно не различаются в 9 и 13 часов, но в 17 часов гетерозиготы имеют более высокий уровень экспрессии гена BMAL1. Условные обозначения: достоверные отличия: - по сравнению с гетерозиготами в той же временной точке, 0 - по сравнению с носителями ТТ генотипа в той же временной точке, # - по сравнению с уровнем экспрессии в 9 ч. у носителей одного генотипа, Д - по сравнению с уровнем экспрессии в 13 ч. у носителей одного генотипа. За 100% принят уровень экспрессии в 9 ч. у носителей ТТ генотипа.
В результате анализа динамики экспрессии гена BMAL1 в группе больных ЭАГ в зависимости от генотипа по полиморфным маркерам 3111ТС, 862ТС, 2121GA гена CLOCK и 56445ТС гена BMAL1 достоверных различий уровней транскриптов данного гена у носителей разных генотипов в группе больных ЭАГ не обнаружено ни в одной временной точке наблюдения (данные не показаны).
Как и в контрольной группе, в группе больных ЭАГ выявлено постепенное повышение экспрессии гена PER1 в период с 9 до 17 часов у носителей разных генотипов по исследуемым маркерам. В результате анализа динамики экспрессии гена PER] у носителей разных генотипов по полиморфным маркерам 3111ТС и 257TG регуляторных областей гена CLOCK, получены схожие данные (Рисунки 24, 25).
У гомозигот по аллелям С маркера 3111ТС и G маркера 257TG гена CLOCK регистрировался более низкий уровень экспрессии PER1 в 9, 13 и 17 часов, по сравнению с носителями других генотипов. Достоверные различия уровней экспрессии гена PER1 между носителями ТТ генотипа и гетерозиготами обнаружены только по маркеру 3111ТС в 13 часов.
Достоверных различий уровней транскриптов гена PER1 у носителей разных генотипов по полиморфным маркерам 862ТС, 2121GA гена CLOCK и 56445ТС гена BMAL1 в группе пациентов с диагнозом ЭАГ не обнаружено ни в одной временной точке наблюдения (данные не показаны). п генотип ТТ
Условные обозначения: достоверные отличия: - по сравнению с гетерозиготами в той же временной точке, 0 - по сравнению с носителями ТТ генотипа в той же временной точке, # - по сравнению с уровнем экспрессии в 9 ч. у носителей одного генотипа, Д - по сравнению с уровнем экспрессии в 13 ч. у носителей одного генотипа. За 100% принят уровень экспрессии в 9 ч. у носителей ТТ генотипа.
Условные обозначения: достоверные отличия: - по сравнению с гетерозиготами в той же временной точке, 0 - по сравнению с носителями ТТ генотипа в той же временной точке, # - по сравнению с уровнем экспрессии в 9 ч. у носителей одного генотипа, Д - по сравнению с уровнем экспрессии в 13 ч. у носителей одного генотипа. За 100% принят уровень экспрессии в 9 ч. у носителей ТТ генотипа. Рисунок 25 - Динамика уровня экспрессии гена PER1 в клетках буккального эпителия носителей разных генотипов по полиморфному маркеру 257TG гена CLOCK в группе доноров с диагнозом ЭАГ. Таким образом, уровни экспрессии изучаемых генов в клетках буккального эпителия пациентов с диагнозом ЭАГ различаются у носителей разных генотипов по полиморфным маркерам 3111ТС и 257TG регуляторных областей гена CLOCK.
В параграфах 3-10 настоящей Главы представлены данные по содержанию мелатонина, АКТГ, кортизола, альдостерона, АПФ, тестостерона, PAI-1 и липидов в плазме крови носителей разных генотипов по изучаемым полиморфным маркерам в группе больных ЭАГ и в контрольной группе. В группе пациентов с диагнозом ИБС (ОИМ) определяли содержание основных фракций липидов плазмы крови.
Содержание мелатонина в плазме крови доноров контрольной группы различалось у носителей разных генотипов по маркеру 3111ТС гена CLOCK, при этом максимальное содержание гормона показано у носителей генотипа ТТ, минимальное - у носителей генотипа СС. При анализе концентраций мелатонина в плазме крови больных ЭАГ с разными генотипами по маркеру 3111ТС, выявлено, что уровни мелатонина достоверно отличаются у гомозигот по аллелям С и Т. Таблица 22 - Содержание мелатонина в плазме крови носителей разных генотипов по полиморфным маркерам генов CLOCK и BMAL1 в группах здоровых и больных ЭАГ людей.
