Введение к работе
Актуальность проблемы. Хроническая сердечная недостаточность (ХСН) в подавляющем большинстве случаев, возникающая в результате перенесенного инфаркта миокарда (ИМ), представляет собой важную медицинскую, социальную и экономическую проблему. Около 1% взрослого населения развитых стран страдает сердечной недостаточностью, а у людей старше 70 лет частота ХСН на порядок выше (около 10%). При этом, в российской популяции частота ХСН выше, чем в развитых странах и достигает 6% [Агеев и соавт., 2010]. Несмотря на то, что эффективность лечения ХСН возросла за последние двадцать лет, возможности современных методов восстановления функции сердца остаются весьма ограниченными. Это обусловлено в значительной степени отсутствием эффективных средств, позволяющих восстановить необратимо утраченный миокард. В последние годы большие надежды на решение этой проблемы связывают с развитием методов клеточной терапии [Агеев и соавт., 2010], в частности, с использованием мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, для которых была продемонстрирована возможность кардиомиоцитарной дифференцировки как in vitro, так и in vivo [Povsic et al., 2010; Fukuda et al., 2001; Kajstura et al., 2005; Kawada et al., 2004]. Однако проведенные экспериментальные и клинические исследования не показали достаточно высокой эффективности клеточной терапии ХСН и не подтвердили возможность замещения утраченного миокарда за счет дифференцировки трансплантированных клеток [Lipinski et al., 2007; Rubart et al., 2008; Murry et al., 2005]. Те эффекты, которые наблюдались при трансплантации клеток костного мозга были обусловлены, в основном, их паракринной активностью, подавляющей апоптоз кардиомиоцитов и стимулирующей ангиогенез и активность собственных резидентных клеток сердца [Satija et al., 2009; Hatzistergos et al., 2010]. На сегодняшний день ученые заняты поиском новых источников прогениторных клеток для терапии ХСН. В этом аспекте большой интерес вызывают недавно открытые резидентные стволовые клетки сердца (СКС) [Beltrami et al., 2003; Matsuura et al., 2004; Hierlihy et al., 2002; Messina et al., 2004; Laugwitz et al., 2005]. Термином «резидентная СКС» обозначается неоднородная популяция незрелых клеток, обнаруживаемых в миокарде, способных к самообновлению и дифференцировке в клетки сердца (кардиомиоциты, эндотелиальные и гладко мышечные клетки сосудов). Описано несколько популяций СКС, различающихся методами выделения и набором поверхностных антигенов (с-kit, sca-1, MDR-1). Общим для большинства из описанных популяций является экспрессия на поверхности клеток рецептора с—kit к фактору стволовых клеток. Получены данные, указывающие на участие СКС в процессах регенерации и обновления миокарда [Urbanek et al., 2005]. Показана возможность получения и экспансии в культуре ex vivo аутологичных СКС из биоптатов миокарда человека [Dawn et al., 2005], аневризмы левого желудочка (ЛЖ) [Рубина, Акчурин, Парфенова, 2009; Дергилев и соавторы, 2010], ушка правого предсердия (ПП) сердца [van Vliet et al., 2008; Dergilev et al., 2010]. На моделях ИМ у иммунодефицитных животных продемонстрировано эффективное восстановление сократительной функции сердца при трансплантации СКС человека [Beltrami et al., 2003; Dawn et al., 2005; Bearzi et al., 2007]. Существование резидентных СКС, участвующих в репаративных процессах, делает особенно актуальной разработку подходов к активации эндогенного механизма регенерации сердца. Помимо этого, применение собственных прогениторных клеток сердца для лечения сердечно-сосудистых заболеваний
представляется перспективным, так как не требует проведения иммуносупрессивной терапии и исключает возможность переноса инфекционных агентов от донора. Однако для разработки клинически приемлемой технологии как стимуляции, так и использования аутологичных резидентных СКС для клеточной кардиомиопластики, необходимо детальное изучение свойств этих клеток, в том числе, и у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. Для этого необходимо выбрать оптимальные источники получения СКС из сердца человека, разработать методы их культивирования и направленной дифференцировки, изучить функциональные характеристики этих клеток, что требует проведения дополнительных исследований.
Цель данной работы: охарактеризовать с—kit позитивные резидентные СКС в миокарде больных ишемической болезнью сердца (ИБС), отработать методику их выделения и культивирования, оценить способность к направленной дифференпировке в клетки сердца.
Для достижения этой цели необходимо решить следующие экспериментальные задачи:
Изучить характер распределения, иммунофенотип и пролиферативный статус c-kit+ клеток в миокарде больных ИБС (ушко правого предсердия, аневризма левого желудочка) и неповрежденном миокарде (аутопсийный материал).
Исследовать влияние возраста, пола, факторов риска ИБС, выраженности атеросклероза коронарных артерий, наличия сердечной недостаточности на количество c-kit+ клеток в образцах миокарда больных ИБС.
Отработать методики выделения и экспансии в культуре популяции c-kit+ клеток сердца.
Оценить пролиферативный и клоногенный потенциал, экспрессию генов плюрипотентности в культуре c-kit+ клеток миокарда человека.
Оценить способность c-kit+ клеток миокарда человека секретировать ангиогенные факторы роста.
Изучить способность культивируемых c-kit+ клеток сердца к дифференцировке в кардиомиоцитарном, эндотелиальном и гладкомышечном направлениях. Научная новизна. В представленной работе впервые выполнена комплексная
оценка свойств c-kit+ СКС с использованием методов флуоресцентной микроскопии, проточной цитофлуориметрии и эксплантной культуры на уникальном операционном материале (ушко ПП, аневризма сердца), полученном от больных ИБС. Охарактеризована локализация, иммунофенотип, пролиферативный статус, наличие клеток-предшественников разных направлений дифференцировки в миокарде ушка ПП и аневризмы ЛЖ пациентов с ИБС. Впервые установлено, что ткань аневризмы ЛЖ содержит СКС. Выполнено сопоставление количества c-kit+ клеток в миокарде больных ИБС с факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний, выраженностью коронарного атеросклероза и показателями сократительной функции сердца и обнаружена связь между количеством СКС и полом, возрастом пациентов, выраженностью коронарного атеросклероза и размером левого предсердия. Впервые показано, что СКС, полученные из разных источников (ушко ПП и аневризма ЛЖ) отличаются по пролиферативным и дифференцировочным свойствам. Получены данные об экспрессии генов плюрипотентности в СКС больных ИБС.
Практическая значимость работы. Разработана методика получения c-kit+ СКС из ткани ушка ПП и аневризмы ЛЖ. Это обеспечивает возможность углубленного изучения свойств этих клеток у больных ИБС, что необходимо для разработки методов стимуляции эндогенных механизмов регенерации миокарда.
Результаты диссертации могут служить основой для создания клинически пригодного метода получения СКС из фрагментов ткани ушка ПП, отсекаемых при постановке шунтов во время операции АКШ. Эти методики важны для дальнейшей разработки протоколов для клеточной терапии или создания банка стволовых клеток.
Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу факультета фундаментальной медицины МГУ имени М. В. Ломоносова и ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития РФ и используются в педагогической деятельности факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова.
Работа выполнена при поддержке Государственного контракта № 16.512.11.2084 в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2013 годы»
Апробация диссертации состоялась 31 мая 2011 года на совместном заседании кафедры биохимии и молекулярной медицины, научно-исследовательской лаборатории генных и клеточных технологий факультета фундаментальной медицины МГУ имени М. В. Ломоносова и лаборатории ангиогенеза Института экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК МЗ СР РФ, а также на заседании кафедры биохимии медицинского факультета РУДН (2 июня 2011 года). Результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях: ISSCR 7th Annual Meeting (Barcelona, Spain, 2009), 5th Stem Cell Research & Therapeutics (Boston, USA, 2009), World conference on regenerative medicine (Leipzig, Germany, 2009).
Публикации. Результаты работы представлены в 4 статьях и 10 тезисах докладов.
Структура работы. Диссертация представлена на 205 страницах и состоит из введения, обзора литературных данных, описания методов и материалов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, клинических примеров и списка цитируемой литературы. Работа содержит 47 рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает 348 источников.
