Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
1. Участие БИПГ в метаболических процессах в клетке растения и в устойчивости к болезням 8
2. Условия выделения и свойства БИПГ 11
3. Действие БИПГ на препараты ПГ фитопатогенных микроорганизмов in vitro 16
4. Локализация БИПГ в тканях и органах растений 22
5. Изменение содержания БИПГ в тканях растений при внешних воздействиях 27
6. Влияние присутствия БИПГ в тканях растений на устойчивость к внедрению фитопатогенных микроорганизмов 32
7. Устойчивость к болезням трансгенных растений, экспрессирующих БИПГ 33
8. Геномная организация БИПГ 34
9. Структура молекулы БИПГ 37
10.Взаимодействие БИПГ, ПГ и пектина 43
Экспериментальная часть материалы и методы исследования
1. Получение препаратов белкового ингибитора полигалактуроназы
1.1. Биологический материал, используемый для получения белкового ингибитора полигалактуроназы 48
1.2. Метод выделения белкового ингибитора полигалактуроназы 49
2. Получение препаратов полигалактуроназы
2.1. Культивирование грибов и бактерий и состав используемых сред 49
2.2. Приготовление культуральных фильтратов и получение ферментных препаратов 50
2.3. Метод выделения полигалактуроназы из растительных источников 51
3. Определение активности полигалактуроназы и белкового ингибитора полигалактуроназы
3.1. Определение активности ПГ и БИПГ методом "cup-plate" 51
3.2. Определение активности ПГ и БИПГ методом редуцирующих групп 53
4. Определение белка по методу Бредфорд 53
5. Определение интенсивности выделения этилена 54
6. Оценка интенсивности поражения растительных тканей фитопатогенными грибами 54
7. Методы, используемые при очистке белкового ингибитора полигалактуроназы и изучении его свойств
7.1. Гель-фильтрация 55
7.2. Ионнообменная хроматография 55
7.3. Аналитическое изоэлектрофокусирование 55
7.4. Препаративное изоэлектрофокусирование 55
7.5. Электрофорез в ПААГ 56
Результаты и их обсуждение
1. Белковый ингибитор полигалактуроназы в растении картофеля {Solatium tuberosum L.)
1.1. Выделение и очистка БИПГ из клубней картофеля 57
1.2. Содержание БИПГ в листьях картофеля сорта Невский на разных стадиях развития растения 65
1.3. Содержание БИПГ в клубнях картофеля процессе хранения при разных условиях 67
2. Белковый ингибитора полигалактуроназы в клубнях топинамбура (Helianthus tuberosus L.) 70
3. Белковый ингибитор полигалактуроназы в плодах яблони {Malm domestica Borkh)
3.1. Содержание БИПГ в плодах яблони разных сортов в процессе роста и развития 71
3.2. Интенсивность поражения плодов яблони возбудителем
плодовой гнили Monilia fructigena в процессе роста и созревания 79
4. Белковый ингибитор полигалактуроназы в плодах банана (Musa acuminata L.) 91
5. Действие БИПГ на ПГ ризосферных бактерий рода Pseudomonas 95
Заключение 97
Выводы 101
Список литературы 102
- Условия выделения и свойства БИПГ
- Структура молекулы БИПГ
- Выделение и очистка БИПГ из клубней картофеля
- Содержание БИПГ в плодах яблони разных сортов в процессе роста и развития
Введение к работе
В устойчивости растений к болезням важную роль играет клеточная
стенка, которая препятствует внедрению фитопатогенных
микроорганизмов. Поэтому изучение биохимических процессов, развивающихся в клеточной стенке весьма актуально для изучения механизмов устойчивости и разработки способов ее повышения.
Как известно, растительная клеточная стенка представляет собой сложный комплекс, состоящий из микрофибрилл целлюлозы, погруженных в матрикс из пектиновых веществ, гемицеллюлоз, гликопротеинов, белков, низкомолекулярных веществ (Showalter, 1993). Пектиновые вещества, представленные полисахаридами, обогащенными галактуроновой кислотой, являются наиболее массивным классом макромолекул в матриксе первичной клеточной стенки. Пектин составляет около 30-35% клеточной стенки (Crookes, Grierson, 1983; Bird et al., 1988; Fry, 1988). Его основным компонентом является гомогалактуронан, который состоит из остатков cc-D-галактуроновой кислоты, связанных между собой а-1,4 гликозидными связями. Карбоксильные группы остатков галактуроновой кислоты могут образовывать сложные эфиры с метальными группами (Doond et al., 1995), степень эстерификации которых зависит от степени дифференциации клетки. Иногда карбоксильные группы, так же как и гидроксильные, могут быть ацетилированы или образовывать связи с другими сахарами, например, с ксилозой (Willats et al., 2001). К основной цепи гомогалактуронана присоединяются ответвления, состоящие из рамнозы, арабинозы и арабиногалактанов, соединенных в цепочки (Lang et al., 2000).
Многочисленные фитопатогенные грибы различаются по приуроченности к разным растениям: некоторые плесени поражают практически любой органический субстрат, другие грибы более специализированы, а некоторые поражают только определенные сорта одного вида растения и не поражают другие. Фитопатогенные грибы сильно различаются по воздействию на ткани растения. Некоторые из них
вызывают размягчение и гнили тканей, внедрение других приводит к локальному повреждению и образованию разнообразных пятнистостей, третьи распространяются в растении, не вызывая развития видимых симптомов, но приводя к снижению урожая. Для разработки методов борьбы с болезнями необходим анализ биохимических процессов, которые развиваются в растении при том или ином заболевании.
Фитопатогенные микроорганизмы продуцируют комплекс пектиназ, которые разрушают пектин срединной пластинки и первичной клеточной стенки растения-хозяина и обеспечивают внедрение патогена в ткани растения (Uritani, Stahmann, 1961; Albersheim, Anderson, 1971; Васильева и др., 1984; Collmer, Keen, 1986; Alghisi, Favaron, 1995; Bateman, 1966; Jones, 1972; Karr, 1970). Пектинметилэстеразы отщепляют метокси-группы (Giovane et al., 2004), пектин- и пектатлиазы разрушают гликозидные связи в высоко эстерифицированном пектине (Herron et al., 2000), недавно обнаруженные рамногалактуроназы специфически отщепляют рамнозу (Jan et al., 1985).
При начале роста гриба на препаратах растительных клеточных стенок первым секретируемым ферментоми является ПГ (поли-[1,4-сс-0-галактуронид] гликаногидролаза; КФ 3.2.1.15) (Albersheim, Anderson, 1971). Она катализирует гидролиз гликозидной связи а-1,4 в полигалактуроновой цепи деметоксилированного пектина клеточной стенки растения. Известны две формы ПГ: экзо-ПГ отщепляют мономеры только на концах молекулы пектина, тогда как эндо-ПГ способны разрушать а-1,4 D-гликозидную связь между двумя неметилированными остатками D-галактуроновой кислоты в середине молекулы (Lang et al., 2000). Наибольшее внимание исследователей привлекают эндо-ПГ, которым отводится основная роль в разрушении молекул пектина. Изменения в молекуле пектина, вызванные действием ПГ, существенно влияют на структуру и свойства растительных тканей. ПГ присутствуют в интактных растительных тканях, обеспечивая превращения пектиновых веществ при растяжении клеток в растущих
побегах и подземных органах (Branka et al., 1988; Bellincampi et al., 1993), при сбрасывании листьев, размягчении созревающих плодов (Fielding, 1981; Abu-Goukh et al., 1983a; Fisher, Bennett, 1991; Colin et al., 1994), прорастании пыльцы (Brown, Crouch, 1990), а также при цветении (Marfa et al., 1991; Родионова и др., 1999) и других процессах.
Эндо-ПГ, секретируемые различными патогенами, могут быть представлены изоформами, которые различаются по стабильности, специфичности, оптимальным рН, субстратной специфичности и характеру образующихся олигосахаридных остатков. Различные изоформы полигалактуроназ обеспечивают способность патогена поражать достаточно широкий спектр растений (Walton, 1994; De Lorenzo et al., 1997; Herron et al., 2000). Часто даже расы и изоляты одного и того же фитопатогенного микроорганизма могут содержать разные наборы ПГ, эффективно расщепляющие различающиеся по своим свойствам пектиновые вещества разных видов растений.
Участие ПГ выявлено практически во всех случаях внедрения микроорганизмов в ткани растения (Cervone, 1986; Byrde, 1977). Хотя наиболее высокая их активность отмечена у патогенов, вызывающих мягкие гнили, обусловленные интенсивной мацерацией тканей, эти ферменты участвуют также при проникновении в растение микроорганизмов, мало нарушающих структуру тканей, в том числе образующих микоризу (Peretto et al., 1995) и клубеньки бобовых растений (Munoz et al., 1998). У растений-паразитов, например, представителей рода Orobanche, также описаны, как минимум, три формы ПГ (Ben-Hod et al., 1997).
БИПГ локализуется в апопласте растительных тканей. Он был выявлен по ингибирующему действию на ПГ, выделяемую фитопатогенными микроорганизмами, и считается одним из важных факторов устойчивости растений к болезням (Albersheim 1971; Anderson, 1972;Powel, 1995). '
В связи с этим целью настоящей работы было изучение изменения содержания БИПГ в тканях растений на разных стадиях роста и развития, и влияние его на устойчивость к поражению фитопатогенными микроорганизмами.
Получение высокоочищенного препарата БИПГ из клубней картофеля, а также выявление его в клубнях топинамбура позволяет охарактеризовать органы и ткани, в которых БИПГ мало изучен.
Использование набора фитопатогенных грибов для получения препаратов ПГ дает возможность определить специфичность и спектр действия препаратов БИПГ из разных источников.
Действие БИПГ на ПГ из растительных тканей практически не изучено. Известны только одиночные попытки в этом направлении. Потому выбор материала (плоды банана, ростки картофеля), получение препаратов ПГ и выявление действия на них БИПГ существенно дополняет информацию о роли БИПГ в растении.
Анализ изменения в процессе роста содержания БИПГ в плодах яблони сортов, различающихся по срокам созревания в связи с интенсивностью поражения их фитопатогенными грибами позволяет получить новые сведения об участии БИПГ в устойчивости плодов к одному из основных заболеваний, вызываемому М. fructigena.
Условия выделения и свойства БИПГ
В устойчивости растений к болезням важную роль играет клеточная стенка, которая препятствует внедрению фитопатогенных микроорганизмов. Поэтому изучение биохимических процессов, развивающихся в клеточной стенке весьма актуально для изучения механизмов устойчивости и разработки способов ее повышения. Как известно, растительная клеточная стенка представляет собой сложный комплекс, состоящий из микрофибрилл целлюлозы, погруженных в матрикс из пектиновых веществ, гемицеллюлоз, гликопротеинов, белков, низкомолекулярных веществ (Showalter, 1993). Пектиновые вещества, представленные полисахаридами, обогащенными галактуроновой кислотой, являются наиболее массивным классом макромолекул в матриксе первичной клеточной стенки. Пектин составляет около 30-35% клеточной стенки (Crookes, Grierson, 1983; Bird et al., 1988; Fry, 1988). Его основным компонентом является гомогалактуронан, который состоит из остатков cc-D-галактуроновой кислоты, связанных между собой а-1,4 гликозидными связями. Карбоксильные группы остатков галактуроновой кислоты могут образовывать сложные эфиры с метальными группами (Doond et al., 1995), степень эстерификации которых зависит от степени дифференциации клетки. Иногда карбоксильные группы, так же как и гидроксильные, могут быть ацетилированы или образовывать связи с другими сахарами, например, с ксилозой (Willats et al., 2001). К основной цепи гомогалактуронана присоединяются ответвления, состоящие из рамнозы, арабинозы и арабиногалактанов, соединенных в цепочки (Lang et al., 2000).
Многочисленные фитопатогенные грибы различаются по приуроченности к разным растениям: некоторые плесени поражают практически любой органический субстрат, другие грибы более специализированы, а некоторые поражают только определенные сорта одного вида растения и не поражают другие. Фитопатогенные грибы сильно различаются по воздействию на ткани растения. Некоторые из них вызывают размягчение и гнили тканей, внедрение других приводит к локальному повреждению и образованию разнообразных пятнистостей, третьи распространяются в растении, не вызывая развития видимых симптомов, но приводя к снижению урожая. Для разработки методов борьбы с болезнями необходим анализ биохимических процессов, которые развиваются в растении при том или ином заболевании.
Фитопатогенные микроорганизмы продуцируют комплекс пектиназ, которые разрушают пектин срединной пластинки и первичной клеточной стенки растения-хозяина и обеспечивают внедрение патогена в ткани растения (Uritani, Stahmann, 1961; Albersheim, Anderson, 1971; Васильева и др., 1984; Collmer, Keen, 1986; Alghisi, Favaron, 1995; Bateman, 1966; Jones, 1972; Karr, 1970). Пектинметилэстеразы отщепляют метокси-группы (Giovane et al., 2004), пектин- и пектатлиазы разрушают гликозидные связи в высоко эстерифицированном пектине (Herron et al., 2000), недавно обнаруженные рамногалактуроназы специфически отщепляют рамнозу (Jan et al., 1985).
При начале роста гриба на препаратах растительных клеточных стенок первым секретируемым ферментоми является ПГ (поли-[1,4-сс-0-галактуронид] гликаногидролаза; КФ 3.2.1.15) (Albersheim, Anderson, 1971). Она катализирует гидролиз гликозидной связи а-1,4 в полигалактуроновой цепи деметоксилированного пектина клеточной стенки растения. Известны две формы ПГ: экзо-ПГ отщепляют мономеры только на концах молекулы пектина, тогда как эндо-ПГ способны разрушать а-1,4 D-гликозидную связь между двумя неметилированными остатками D-галактуроновой кислоты в середине молекулы (Lang et al., 2000). Наибольшее внимание исследователей привлекают эндо-ПГ, которым отводится основная роль в разрушении молекул пектина. Изменения в молекуле пектина, вызванные действием ПГ, существенно влияют на структуру и свойства растительных тканей. ПГ присутствуют в интактных растительных тканях, обеспечивая превращения пектиновых веществ при растяжении клеток в растущих
побегах и подземных органах (Branka et al., 1988; Bellincampi et al., 1993), при сбрасывании листьев, размягчении созревающих плодов (Fielding, 1981; Abu-Goukh et al., 1983a; Fisher, Bennett, 1991; Colin et al., 1994), прорастании пыльцы (Brown, Crouch, 1990), а также при цветении (Marfa et al., 1991; Родионова и др., 1999) и других процессах.
Эндо-ПГ, секретируемые различными патогенами, могут быть представлены изоформами, которые различаются по стабильности, специфичности, оптимальным рН, субстратной специфичности и характеру образующихся олигосахаридных остатков. Различные изоформы полигалактуроназ обеспечивают способность патогена поражать достаточно широкий спектр растений (Walton, 1994; De Lorenzo et al., 1997; Herron et al., 2000). Часто даже расы и изоляты одного и того же фитопатогенного микроорганизма могут содержать разные наборы ПГ, эффективно расщепляющие различающиеся по своим свойствам пектиновые вещества разных видов растений.
Участие ПГ выявлено практически во всех случаях внедрения микроорганизмов в ткани растения (Cervone, 1986; Byrde, 1977). Хотя наиболее высокая их активность отмечена у патогенов, вызывающих мягкие гнили, обусловленные интенсивной мацерацией тканей, эти ферменты участвуют также при проникновении в растение микроорганизмов, мало нарушающих структуру тканей, в том числе образующих микоризу (Peretto et al., 1995) и клубеньки бобовых растений (Munoz et al., 1998). У растений-паразитов, например, представителей рода Orobanche, также описаны, как минимум, три формы ПГ (Ben-Hod et al., 1997).
БИПГ локализуется в апопласте растительных тканей. Он был выявлен по ингибирующему действию на ПГ, выделяемую фитопатогенными микроорганизмами, и считается одним из важных факторов устойчивости растений к болезням (Albersheim 1971; Anderson, 1972;Powel, 1995).
Структура молекулы БИПГ
БИПГ обнаружены практически во всех тканях и органах всех исследованных растений (De Lorenzo et al., 2001). Кроме того, БИПГ выделены так же из культуры растительных клеток (Albersheim, Anderson, 1971; Salvi et al., 1990; Stotz et al., 1994) и каллуса (Degra et al., 1988). Белки БИПГ локализуются, в основном, в апопласте (Salvi et al., 1990). Считается, что они достаточно прочно связаны с клеточной стенкой растений (Abu-Goukh et al., 1983; Johnston et al., 1993; Jones, Jones, 1997). Тем не менее отдельным исследователям удается выявить свободную форму БИПГ в некоторых растениях. Например, в клеточном соке плодов груши был обнаружен БИПГ. При этом, его активность была несколько ниже той, что была получена из клеточных стенок при помощи экстракции солевым раствором. При созревании плодов, которое сопровождается их размягчением, концентрация БИПГ в клеточном соке увеличивалась (Abu-Goukh et al., 1983b). Наличие растворимой формы БИПГ было показано и в тканях лука порея (А. роггит), причем его активность была так же несколько ниже, чем у белков, связанных с пектином клеточной стенки (Favaron et al., 1997).
Большинство исследователей обращают преимущественное внимание на БИПГ, прочно связанные с клеточной стенкой.
БИПГ в сочных плодах растений изучают достаточно давно (Abu-Goukh et al., 1983 а). Его присутствие связывают с поддержанием консистенции незрелых плодов, а также с их повышенной (по сравнению со зрелыми плодами) устойчивостью к поражению некоторыми фитопатогенными грибами.
Изменение содержания БИПГ в процессе созревания выявлено в плодах груши, томата, малины. Достаточно высокая концентрация БИПГ обнаруживается в незрелых зеленых плодах томата (диаметр плодов не более 1.5 - 2.5 см.) (Powell et al., 2000). При созревании плодов содержание БИПГ сильно уменьшается, практически до полного его исчезновения в плодах переходного состояния между зеленым и красным цветом. В слабо розовых и розовых плодах наблюдается небольшое повышение концентрации БИПГ, а при полном созревании томатов он опять исчезает. Подобная закономерность наблюдалась и при исследовании удельной активности БИПГ в плодах груши (Abu-Goukh et al., 1983b), малины (Johnston et al., 1993) и некоторых других растений. При этом, по мере созревания плодов увеличивалась активность ПГ, которую определяли в этих же плодах.
В плодах яблони сорта «Golden Delicious» проследили изменение концентрации мРНК БИПГ. Минимальная концентрация транскриптов наблюдалась в практически зрелых плодах, которые собирали за 2 недели до сбора урожая. При хранении в течении месяца при 0 С уровень БИПГ увеличился в 2 раза. Удельная активность БИПГ в плодах, при этом была намного выше, чем в листьях и цветках (Stotz et al. 1993).
Детально изучено содержание БИПГ в разных тканях плода канталупской дыни (Cucumis melo var. cantalupensis) в процессе их роста и созревания от 5 до 35 дней после опыления (Fish, 2005). Содержание БИПГ было высоким в цветках и тканях плода дыни в течение первой недели и значительно снижалось между 5 и 10 днями после опыления, оставаясь высоким в семенной камере и очень низким в семенах. При этом содержание БИПГ в экзокарпе, внешнем, среднем и внутреннем слоях мезокарпа было невысоким и снижалось по мере созревания плодов.
В общем, исследовано небольшое число видов растений, имеющих сочные плоды. При этом наиболее высокое содержание БИПГ отмечено в завязях вскоре после опыления и в незрелых плодах. На более поздних стадиях созревания содержание БИПГ уменьшается, а в полностью созревших его не удается обнаружить.
В вегетирующих растениях гороха (Pisum sativum) наиболее высокие концентрации БИПГ обнаружены в листьях и прилистниках, кроме того, он обнаружен в стеблях и перикарпе. В семенах гороха содержание БИПГ было низким (Hoffman, Turner, 1984).
В сеянцах фасоли наиболее высокое содержание транскриптов pgip (англ. абревиатура БИПГ) найдено в зоне между удлинняющимися и зрелыми участками гипокотиля и в базальной части стебля взрослых растений, выращенных на свету (Devoto et al., 1997). В этиолированных гипокотилях уровень mRNA pgip в 5-6 раз выше, чем в выросших на свету. Концентрация БИПГ в стручках фасоли {Phaseolus vulgaris L.) оказалась в 14 раз выше, чем в этиолированных гипокотилях (Pressey, 1996). В процессе вегетации в листьях этих растений среднее содержание БИПГ не изменялось, а в стеблях увеличивалось почти на порядок. Высокое содержание БИПГ наблюдали так же в тычинках и пестиках. (Salvi et al., 1990). В проростках сои наиболее высокое его содержание найдено в семядолях, в листьях оно было приблизительно в 2 раза меньше, очень низкое содержание БИПГ обнаружено в корнях (Favaron et al. 1994).
При использовании иммуногистохимических методов высокий уровень БИПГ был обнаружен в гипокотиле и первых листьях растений хлопка (James, Dubery, 2001). Очень высокий уровень активности БИПГ наблюдали в апексах, а так же в зародышах и семядолях.
В каллусах люцерны содержание БИПГ намного выше, чем в гипокотилях и листьях (Degra et al., 1988). Гликопротеин, обладающий ингибирующей активностью против ПГ из A. nigrum, был обнаружен в различных зонах корня лупина (Costa et al., 1998).
Высокий уровень БИПГ наблюдали в семядолях, первичных корешках и 4-недельных стеблях пекинской капусты {Brassica campestris var. pekinensis), в остальных тканях и органах этого растения экспрессия БИПГ не выявлена (Ahsan et al., 2005).
Транскрипты генов рапса {Brassica napus) Bnpgipl и Bnpgip2 были обнаружены в бутонах, раскрытых цветках и корнях, в небольшом количестве - в стеблях. В листьях обнаружен только невысокий уровень мРНК теш Bnpgipl (Li et al., 2003).
Выделение и очистка БИПГ из клубней картофеля
Тип ингибирования зависит от конкретных молекул фермента и его ингибитора. Ингибирование может быть как конкурентным (Barmore and Nguyen, 1985), так и неконкурентным (Lafitte et al., 1984). Неконкурентное ингибирование показано для БИПГ из томата в отношении ПГ из A. niger (К;= 0.06 mg/ml), а так же для ингибиторов из фасоли и малины (Stotz et al., 2000). Конкурентное ингибирование наблюдается при взаимодействии БИПГ из груши и апельсина с ПГ. Смешанное или неконкурентное ингибирование было показано для БИПГ хлопка и ПГ A. niger (Km=3.3 mg/ml, V max = 1.07 mkM/ml min, Kj=15 nM). Для пары БИПГ хлопка - ПГ К dahliae показано, что при увеличении концентрации ингибитора в системе активность фермента падает (James, Dubery, 2001).
Специфичность действия БИПГ связывают с определенными аминокислотными остатками, расположенными в LRR повторах. Аминокислоты в молекуле БИПГ, которые определяют специфичность и сродство к грибным ПГ, находятся внутри консервативного участка xxLxLxx, который образует структуру Р-слой/р-петля, обращенную к растворителю (Leckie et al., 1999). Белки PvPGIPl и PvPGIP2 из Phaseolus vulgaris отличаются только 8 остатками аминокислот, расположенными внутри или вблизи этого участка. Первый из них не способен взаимодействовать с ПГ F. moniliforme и взаимодействует с ПГ A. niger; второй - взаимодействует с этими двумя ПГ. Одиночные мутации остатков аминокислот из PvPGIP2 в соответствующие остатки PvPGIPl вызывают потерю сродства к ПГ F. moniliforme. С другой стороны, одиночной мутации лизина в положении 253 из PvPGIPl в соответствующую аминокислоту из PvPGIP2 - глютамин достаточно чтобы придать белку способность взаимодействовать с ПГ из F. moniliforme. Следовательно, вариабельность последовательности в структуре Р-слой/р-изгиб влияет на связывание лиганда и имеет в молекуле БИПГ функциональное значение, определяя избирательность узнавания ПГ. Информация о структурных особенностях, которые придают белкам с LRR способность специфически взаимодействовать с лигандами, позволит манипулировать функциями клетки, контролируемыми этими белками.
Молекула ПГ образует множественные контакты с БИПГ (Mahalingam, 1999). В ПГ F. moniliforme Lys 269 и Arg 267, расположенные внутри активного сайта, связывающего субстрат, а также His 188 на краю активного сайта, непосредственно участвовали в образовании комплекса с БИПГ из фасоли PvPGIP2 (Leckie et al., 1999). Мутации, приводящие к замене этих аминокислот, приводили к потере ферментативной активности, но не препятствовали связыванию с PvPGIP2. Следовательно, БИПГ может ингибировать активность ПГ, предотвращая связывание субстрата и одновременно закрывая активный сайт. Участие во взаимодействии связывающих субстрат аминокислотных остатков, мутация которых нарушила бы ферментативную активность, минимизирует возможность того, что ПГ гриба не подвергнется узнаванию. Такой же механизм возможно обеспечивает отсуствие ингибирования растительных ПГ эндогенными БИПГ.
При исследовании молекул ПГ было показано, что практически для всех известных ПГ консервативными аминокислотными остатками являются только Asp-191, Asp-212, Asp-213, Arg-267 и Lys-269, которые при анализе третичной структуры оказываются расположенными в углублении и могут формировать активный центр молекулы. При анализе нормальных и мутантных молекул ПГ таких фитопатогенов, как A. niger и F. moniliforme было показано, что мутации по этим аминокислотам вели к полной потере активности фермента. Так же было показано, что последние два аминокислотных остатка участвуют в связывании фермента с субстратом.
При исследовании образования комплекса ингибитор-фермент оказалось, что изменения по первым трем аминокислотам не влияли на изменение активности фермента, тогда как мутации Arg-267-Ala и Lys-269-Glu ведут к уменьшению возможности образования комплекса между FmPG и PGIP2 из P. vulgaris (Frederici et al., 2001). Кроме выше указанных аминокислотных остатков для всех известных ПГ из фитопатогенных грибов характерно наличие His 188. На этой позиции у ПГ, выделенных из тканей растений находится пролин. Замена Hisl88Pro в FmPG уменьшает аффинность связывания белка ПГ с БИПГ фасоли. А введение триптофана сразу после 270-й аминокислоты приводит к полному исчезновению способности фермента связываться с ингибитором (Frederici et al., 2001)
На свойства фермента, скорее всего, может влиять и степень гликозилирования молекулы. БИ1И фасоли, который экспрессировался в растениях томата, утрачивал способность ингибировать ПГ из F. moniliforme (Deziderio et al., 1997). С другой стороны, БИПГ лимона, полученный в Е. coli, не проходит пострансяционной модификации, связанной с гликозилированием, но при этом его ингибирующая активность не пропадает. В присутствии БИПГ, полученного таким образом, активность ПГ A. niger уменьшается почти на 60% (Nalumpang et al., 2002).
Кроме ингибирующего действия БИПГ при некоторых условиях может активировать активность ПГ. Для эффективной работы каждого типа молекулы ПГ необходимо оптимальное значение рН. Например, для ПГ-А и ПГ-С из A. niger оптимумом является рН=4.2, для ПГ I и ПГ II - рН=4.75, а для ПГ-В- рН=5.5. При повышении значения рН до 5.0 в системе БИПГ-2 (фасоли)- ПГ-А и ПГ-С наблюдалось активирование ферментов на 19%, тогда как при рН=4.2 отмечено ингибирование действия этих же ферментов на 85% (Kemp et al., 2004).
В стенке растения БИПГ специфически связан с пектином, при этом большое значение для связывания имеет степень ацетилирования полигалактуроновой кислоты в составе пектина (Sakamoto et al., 2003). При исследовании взаимодействия БИПГ из гороха {Pisum sativum L.) с пектином было показано, что гидроксильные группы галактуроновой кислоты пектина не участвуют в связывании БИПГ, в отличие от карбоксильных групп. Ингибитор способен связываться специфически с участком гомогалактуронана в соответствии со степенью метилирования. Опыты по связыванию с разными препаратами пектина показали, что взаимодействие с БИПГ происходит преимущественно в участках деметилирования пектина, образующихся при действии растительной пектинметилэстеразы. Участок пектина с такими свойствами может быть различной степени протяженности. Как известно, ПГ расщепляет молекулу пектина также в местах деметилирования.
БИПГ взаимодействует с ПГ с использованием, по-видимому, тех же сайтов, которые служат для прикрепления его к клеточной стенке растения. Предполагается, что при внедрении патогена, связанный с пектином БИПГ освобождается в результате образования комплекса с грибной ПГ.
Сравнение параметров связывания БИПГ с поперечно-связанной полигалактуроновой кислотой и поперечно-связанной альгиновой кислотой показало, что конформация полисахарида играет важную роль в связывании ингибитора.
Содержание БИПГ в плодах яблони разных сортов в процессе роста и развития
Рост плодов яблони характеризуется S-образной кривой (Lasko et al., 1995). При этом сразу после опыления начинается деление клеток завязи и темп роста постепенно увеличивается, затем деление прекращается и рост плодов происходит исключительно за счет растяжения клеток и мацерации тканей с образованием межклетников. Скорость роста плода в это время остается постоянной в течение 40-50 дней. Участок S-образной кривой, относящийся к этому периоду, носит линейный характер. Этот процесс замедляется по мере созревания и прекращается ко времени технической зрелости плодов. Изменение размера плодов сопровождается комплексом биохимических процессов, связанных, в частности, с изменениями в клеточной стенке, особенно с превращениями пектиновых веществ (Yoshioka, 1989; Террег 1990, Voragen, 1989). Для плодов яблони, как и некоторых других, характерно наличие климактерического периода в процессе созревания, который сопровождается интенсификацией биосинтеза этилена и изменением ряда биохимических процессов (Салькова, 1990).
В процессе роста и созревания плодов яблони варьируют содержание и состав пектиновых веществ, что связано с растяжением клеток, мацерацией и образованием обширных межклетников (Сапожникова, 1965). Изменяется количественное соотношение протопектина и водорастворимого пектина, число и длина боковых ответвлений молекулы пектина, а также степень этерификации (Hobson, 1981). На основании обнаружения активности и экспрессии мРНК ПГ удалось выявить присутствие ПГ в яблоках и показать ее накопление в процессе роста плодов, которое достигало максимума во время климактерического периода. Поэтому участие БИПГ в регуляции активности ПГ, очевидно, играет важную роль в процессе роста и созревания яблок.
БИПГ был ранее обнаружен в плодах яблони. Его количество, оцененное по присутствию транскрипта мРНК БИПГ, изменялось в зависимости от степени зрелости плодов (Brown, 1984). За 2 недели до уборки оно было меньше, чем после 1 мес. хранения. Обработка плодов ингибиторами биосинтеза этилена также влияла на содержание в них БИПГ (Yao et al., 1999; Davis 1986; Буланцева, 2001). Динамика содержания БИПГ в процессе роста плодов яблони ранее не изучалась.
В период технической зрелости (ко времени съема плодов с дерева) происходило снижение содержания БИПГ, которая затем сильно возрастала. Следует отметить, что эти изменения происходили независимо от момента фактического отделения плодов от дерева. У сортов Антоновка (рис. 13) и Московское зеленое (рис. 14) кривая изменения содержания БИПГ имела несколько пиков, но сохранялась общая закономерность снижения активности ко времени технической зрелости и значительного ее повышения в период дозревания.
Использованные в работе сорта яблок существенно различались по активности БИПГ, и содержанию белка, что, по-видимому, связано с разными темпами роста и развития плодов и сортовой специфичностью. Максимальное значение содержания БИПГ, достигаемое за все время эксперимента, у летних сортов Коричное полосатое (рис. 15) и Памяти Тихомирова (рис. 16) было существенно ниже, чем у ранне-зимнего Антоновка обыкновенная и поздне-зимних сортов Студенческое (рис. 17) и Московское позднее (рис. 18). Исключение составлял поздне-зимний сорт Московское зеленое, в плодах которого максимальное содержание БИПГ была такой же, как у летнего сорта Коричное полосатое. При этом у Московского зеленого высокое содержание БИПГ, так же, как и потребительские качества плодов, сохранялись в течение длительного времени (до ноября при хранении без охлаждения).
В процессе роста на дереве и затем после съема содержание БИПГ изменялась по-разному в плодах яблони разных сортов, однако выявлены некоторые общие закономерности. Отмечены два основных пика увеличения содержания БИПГ. Один, меньший, - вскоре после начала наблюдения или несколько позднее, но до наступления технической зрелости. Второй, значительно больший, проявлялся в период дозревания после съема плодов.
В плодах двух других исследованных видов рода Malus динамика содержания БИПГ сохраняла те же закономерности, что и в плодах сортов М. domestica. В плодах М. platycarpa (рис. 19), имеющих очень плотную консистенцию, максимальное содержание БИПГ было выше, чем в других плодах. Плоды более скороспелого М. caerulescens (рис. 19) размягчались к концу периода созревания и содержание БИПГ в них было более низким. Эти данные могут служить подтверждением участия БИПГ в формировании структуры тканей.
Показано, что кривая, характеризующая содержание растворимого пектина в процессе роста и созревания яблок, имеет два пика (Hobson, 1981). Один из них приходится на период роста плодов, второй - после наступления технической зрелости (Сапожникова, 1965). Выявленные нами два периода повышения активности БИПГ, по-видимому, связаны с динамикой превращения пектиновых веществ в плодах.
Содержание белка в процессе роста плодов варьировало по-разному у разных сортов, но у всех существенно возрастало после достижения технической зрелости.
При этом повышение содержания БИПГ во многих случаях совпадало с пиками содержания белка особенно в период хранения плодов.
