Введение к работе
Актуальность темы. Протеолитические ферменты (протеиназы, протеазы или пептидазы) - это группа ферментов, которые катализируют гидролиз пептидных связей в белках и пептидах. Регулирование активности протеиназ имеет решающее значение в обмене веществ животных и растений. Один из путей регуляции протеолитических ферментов включает присутствие в клетках животных, растений и микроорганизмов специфических молекул, подавляющих их активность, в том числе и белковой природы. Белки-ингибиторы протеиназ представлены во всех типах живых организмов, число видов которых составляет около двух тысяч [Rawlingsetal., 2004].
Белковые ингибиторы протеиназ представляют собой большую и разнообразную в структурном отношении группу белков, способных образовывать стехиометрические комплексы с протеолитическими ферментами, в результате чего последние утрачивают ферментативную активность. Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что структуры молекул белковых ингибиторов протеиназ, механизм ингибирования и природа их комплексов с ферментами крайне разнообразна [Валуева, Мосолов, 1999; Otlewski et al., 2005]. В связи с этим, изучение новых белковых ингибиторов представляет особый интерес.
В настоящее время известно несколько тысяч аминокислотных последовательностей белков, обладающих способностью ингибировать протеиназы [Rawlings et al., 2004]. Несмотря на то, что установлена структура большого числа ингибиторов и механизмы их взаимодействия с протеиназами, для большинства из них точная физиологическая функция не установлена или является малоизученной. Белковые ингибиторы протеиназ принимают непосредственное участие в регуляции многих биохимических процессов [Wei et al., 2009]. Так, в растениях они могут обладать несколькими функциями: выступать в роли запасных белков, контролировать активность эндогенных протеиназ, а также участвовать в защитных реакциях растений. Показано, что белки-ингибиторы растений способны in vivo подавлять активность экстрацеллюлярных протеиназ патогенных микроорганизмов и протеиназы желудочно-кишечного тракта насекомых-вредителей [Lawrence, Koundal, 2002; Мосолов, Валуева, 2005]. В связи с развитием современных методов молекулярной биологии и генной инженерии по созданию растений, устойчивых к действию патогенов,
изучение белков-ингибиторов имеет важное не только теоретическое, но и практическое значение для сельского хозяйства.
К настоящему времени проведено много исследований и накоплено достаточное количество данных о белках-ингибиторах, представленных в картофеле (Solarium tuberosum L), который является одной из важнейших мировых сельскохозяйственных культур [Bauw et al., 2006]. Часть этих белков объединяют в отдельное подсемейство и обозначают PKPI (potato Kunitz-type proteinase inhibitors). Установлено, что белки PKPI представлены многочисленными изоформами, среди которых на основании сходства N- и С-концевых аминокислотных последовательностей выделяют, по крайней мере, пять различных структурных групп, три из которых - PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C - относительно хорошо изучены [Ishikawa et al., 1994; Heibges et al., 2003; Bauw et al., 2006]. Однако структурные особенности белков PKPI, определяющие специфичность их взаимодействия с различными ферментами остаются малоизученными. Несмотря на то, что накоплено достаточное количество данных о свойствах белков PKPI, выделенных из клубней различных сортов картофеля, их первичная структура, как правило, неизвестна. С другой стороны, значительное количество полных аминокислотных последовательностей белков PKPI восстановлено по кодирующим их нуклеотидным последовательностям, но практически отсутствуют данные об их свойствах. Таким образом, исследование взаимосвязи структуры и свойств новых белков PKPI является актуальной задачей современной биохимии. Кроме того, информация о структуре и функциях ранее не изученных белков, принадлежащих к данному семейству, а также генов, кодирующих их, позволит судить о процессах их формирования и образования новых форм in vivo.
Цели и задачи работы. Целью работы являлось выделение из клубней картофеля сорта Юбилей Жукова и характеристика новых белков, действующих как высокоэффективные ингибиторы сериновых протеиназ, и кодирующих их генов, а также исследование взаимосвязи структуры и специфичности действия продуктов клонированных генов. Были сформулированы следующие экспериментальные задачи.
1. Провести скрининг белков, обладающих способностью ингибировать сериновые протеиназы, в клубнях картофеля нового сорта Юбилей Жукова, созданного российскими селекционерами. Исходя из
полученных данных, идентифицировать белки, относящиеся к подсемейству PKPI.
Выделить высокоэффективный ингибитор сериновых протеиназ подсемейства PKPI и охарактеризовать специфичность его действия на протеолитические ферменты: а-химотрипсин, трипсин, субтилизин и папаин. Установить N-концевую последовательность нового белка, изучить его физико-химические свойства и возможное участие в защитной системе картофеля.
Выделить и охарактеризовать кДНК, кодирующую новый белок, выделенный из клубней картофеля. Для этого синтезировать олигонуклеотидные праимеры для амплификации кДНК из генома картофеля.
4. Разработать метод ускоренной гетерологичной экспрессии
выделенной кДНК в Escherichia coli. Получить рекомбинантныи белок,
кодируемый новой, ранее неизвестной кДНК, и охарактеризовать
специфичность его действия на протеиназы.
Научная новизна и практическая значимость работы: Из картофеля сорта Юбилей Жукова впервые был выделен и охарактеризован белок, обозначенный PKCI (potato Kunitz-type chymotrypsin inhibitor), который одинаково эффективно действовал на а-химотрипсин и трипсин и обладал способностью одновременно связывать оба фермента, образуя с ними тройные комплексы. Таким образом, выделенный белок PKCI, является «двуглавым» ингибитором трипсина и химотрипсина, который содержит два независимых и одновременно действующих реактивных центра.
Установлена N-концевая последовательность белка PKCI, что позволило отнести его к структурной группе PKPI-B. Исследованы физико-химические свойства белка PKCI и показано, что он обладает высокой термо- и рН-стабильностью. Показано, что ингибитор угнетает рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов F. culmorum и P. infestans (Mont.) de Вагу, поражающих растения картофеля. Это свидетельствует о возможном его участии в защитной системе растения.
Определена нуклеотидная последовательность кДНК, обозначенной как PKPIJ-B. Разработан метод экспрессии этой кДНК в Е. coli и очистки рекомбинантных продуктов. Выделен, очищен и охарактеризован рекомбинантныи белок PKPIJ-B. Показано, что рекомбинантныи белок одинаково эффективно подавляет активность а-химотрипсина и трипсина и
так же, как и белок PKCI, обладает способностью образовывать с этими ферментами тройные комплексы. Сделано заключение, белок PKPIJ-B идентичен белку PKCI, который кодируется в геноме картофеля кДНК PKPIJ-B. Сравнительный анализ восстановленных аминокислотных последовательностей белка PKCI с последовательностями белков группы PKPI-B, присутствующих в клубнях различных сортов картофеля и действующих как ингибиторы протеиназ, показал, что наиболее вариабельным является С-концевой участок их молекул, расположенный между остатками Cysl47 и Cysl64, в котором локализован реактивный центр, ответственный за связывание а-химотрипсина.
Сделано заключение, что в состав реактивного центра, ответственного за связывание трипсина, входят остатки Arg68-Phe69, а в центре, ответственном за связывание химотрипсина, находятся остатки Metl53-Serl54. Полученные данные позволяют сделать заключение, что отсутствие или присутствие определенных аминокислотных остатков в первичной структуре ингибиторов PKPI определяет специфичность их действия.
Апробация работы и публикации: Основные результаты работы были представлены на Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, приуроченной к 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009); XXII и XXIII Зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». (Москва, 2010, 2011); Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2010" (Москва, 2010); Всероссийской молодежной научной конференции с международным участием "Биология будущего: традиции и инновации" (г. Екатеринбург, 2010); I Всероссийской виртуальной интернет - конференции "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии" (г. Казань, 2010); V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (г. Петрозаводск, 2011); Научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова" (Москва, 2011).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК, 8 тезисов в материалах конференций.
Структура и объем работы: Диссертация изложена на 135 страницах; содержит 22 рисунка и 6 таблиц; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 232 наименований.
