Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 10
1.1. Структура и функции минисателлитных последовательностей ДНК 10
1.1.1. Общая характеристика минисателлитов 10
1.1.2. Тандемные повторы как факторы модуляции экспрессии генов 12
1.1.3. Минисателлиты как факторы модуляции экспрессии генов 13
1.1.4. Минисателлитные ДНК и болезни человека 15
1.1.5. Методы изучения роли минисателлитных последовательностей ДНК в регуляции экспрессии генов 18
1.2. Характеристика гена ACAP3 (CENTB5) 20
1.3. Характеристика минисателлита UPS29 24
1.4. Метилирование минисателлитных ДНК 26
1.4.1. Метилирование ДНК как эпигенетическая модификация нуклеиновых кислот 26
1.4.2. Метилирование ДНК и нестабильность повторяющихся последовательностей 28
1.4.3. Метилирование тандемных повторов ДНК при различных болезнях человека 29
1.5. Генетические и эпигенетические факторы эпилепсии 31
1.5.1. Гены, вовлеченные в патогенез эпилепсии 31
1.5.2. Роль минисателлитных последовательностей в патогенезе эпилепсии 35
1.5.3. Изучение экспрессии генов в клетках крови при эпилепсии 35
1.5.4. Эпигенетические факторы эпилепсии 40
1.6. Генетические и эпигенетические факторы болезни Паркинсона 42
1.6.1. Гены и локусы, вовлеченные в патогенез болезни Паркинсона 42
1.6.2. Роль минисателлитных последовательностей в патогенезе болезни Паркинсона 45
1.6.3. Изучение экспрессии генов в клетках крови при болезни Паркинсона 46
1.6.4. Эпигенетические факторы болезни Паркинсона 52
Заключение по обзору литературы 54
ГЛАВА II. Материалы и методы 55
2.1. Материал исследования 55
2.1.1. Пациенты и группы контроля 55
2.1.2. Клеточные линии: эмбриональная тератокарцинома мыши F9, HeLa человека, первичные астроциты крысы 56
2.1.3. Плазмидные конструкции pR26-EGFP, pR26-EGFP-UPS29 56
2.2. Методы исследования 58
2.2.1. Выделение геномной ДНК 58
2.2.2. Определение аллельных вариантов минисателлита UPS29 с помощью ПЦР 58
2.2.3. Ферментативный гидролиз геномной ДНК метил-чувствительными эндонуклеазами 59
2.2.4. Электрофорез в агарозном геле и полиакриламидном геле 60
2.2.5. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса 60
2.2.6. Культивирование эукариотических клеток линий HeLa, F9, астроцитов крысы 61
2.2.7. Временная трансфекция клеток линий HeLa, F9 и астроцитов крысы 61
2.2.8. Стабильная трансфекция клеток эмбриональной тератокарциномы мыши линии F9 61
2.2.9. Оценка флуоресценции белка EGFP в культуре трансфицированных клеток 62
2.2.10. Выявление встроенных плазмидных конструкций методом ПЦР 62
2.2.11. Выделение тотальной РНК 63
2.2.12. ДНКазная обработка 63
2.2.13. Обратная транскрипция 64
2.2.14. Определение нормализованного уровня экспрессии генов ACAP3 и CSTB в лейкоцитах периферической крови у здоровых людей, пациентов с эпилепсией и пациентов с болезнью Паркинсона 64
2.2.15. Определение числа копий гена ACAP3 у здоровых людей, пациентов с эпилепсией и пациентов с болезнью Паркинсона 65
2.2.16. Статистическая обработка данных 66
ГЛАВА III. Результаты исследования 67
3.1. Анализ ассоциаций минисателлита UPS29 с эпилепсией и болезнью Паркинсона 67
3.2. Анализ метилирования минисателлитного повтора UPS29 при эпилепсии и болезни Паркинсона 69
3.3. Оценка уровня экспрессии генов ACAP3, CSTB в лейкоцитах периферической крови при эпилепсии и болезни Паркинсона 72
3.4. Изучение влияния различных аллелей UPS29 на экспрессию репортерного гена EGFP в модельных экспериментах по временной и стабильной трансфекции клеточных культур плазмидными конструкциями pR26-EGFP-UPS400, pR26-EGFP-UPS900, pR26-EGFP-UPS1500 75 3.4.1. Оценка флуоресценции белка EGFP при временной трансфекции клеток HeLa,
F9 и астроцитов крысы 76
3.4.2. Оценка интенсивности флуоресценции белка EGFP при стабильной трансфекции в клетках F9 78
ГЛАВА IV Обсуждение результатов 79
4.1. Короткие аллели минисателлита UPS29 у женщин как фактор риска развития симптоматической эпилепсии и болезни Паркинсона 79
4.2. Изменение статуса метилирования ДНК минисателлитного повтора UPS29 при эпилепсии у женщин 83
4.3. Изменение уровня экспрессии генов ACAP3 и CSTB в лейкоцитах периферической крови при эпилепсии и болезни Паркинсона 85
4.3.1. Изменение уровня экспрессии гена ACAP3 при эпилепсии и болезни Паркинсона 85
4.3.2. Изменение уровня экспрессии гена CSTB при эпилепсии и болезни Паркинсона 88
4.4. Энхансерный эффект минисателлита UPS29 на экспрессию репортерного гена EGFP в модельных экспериментах по временной трансфекции клеток нейронального и глиального происхождения 93
4.5. Супрессорное влияние минисателлитного повтора UPS29 на экспрессию репортерного гена EGFP в модельных экспериментах по стабильной трансфекции клеток линии F9 95
Заключение 97
Выводы 99
Список сокращений 100
Список литературы 101
Благодарности 124
- Методы изучения роли минисателлитных последовательностей ДНК в регуляции экспрессии генов
- Клеточные линии: эмбриональная тератокарцинома мыши F9, HeLa человека, первичные астроциты крысы
- Анализ метилирования минисателлитного повтора UPS29 при эпилепсии и болезни Паркинсона
- Изменение статуса метилирования ДНК минисателлитного повтора UPS29 при эпилепсии у женщин
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время скорость накопления новых данных о нуклеотидных последовательностях геномов возрастает с каждым годом. Несмотря на достигнутый прогресс в этой области, структурная организация геномов, а также функциональная значимость многих элементов генома до сих пор остаются малоизученными. В частности, является актуальным изучение роли сателлитных ДНК, которые представляют собой кластеры тандемно повторяющихся последовательностей ДНК различного размера (Хемлебен и др., 2003). Среди сателлитных ДНК выделяют микросателлиты, минисателлиты и макросателлиты, также называемые собственно сателлитной ДНК. Минисателлиты – это повторяющиеся последовательности ДНК, состоящие из тандемных повторов от 5 п.н. (пар нуклеотидов) до 100 п.н., при общем размере кластера от 500 п.н. до 100 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов) (Buard, Jeffreys, 1997). Большой интерес к изучению минисателлитных последовательностей ДНК в основном связан с ролью этих повторов в развитии заболеваний человека. В настоящее время для многих минисателлитов установлены ассоциации с онкологическими (Kiaris et al., 1995; Santos-Silva et al., 2005; Yoon et al., 2011), неврологическими (Lalioti et al., 1997a; Сучкова и др., 2009), нейродегенеративными (Kelada et al., 2006), психическими (Haddley et al., 2008; Hranilovic et al., 2000; Reif et al., 2012), сердечно-сосудистыми (Iwai et al., 1999; Lievers et al., 2001) и другими заболеваниями человека. Роль минисателлитных локусов в развитии заболеваний связывают с участием этих последовательностей ДНК в модуляции экспрессии генов посредством взаимодействия минисателлитных последовательностей с транскрипционными факторами, регуляции альтернативного сплайсинга, изменения уровня метилирования CpG-динуклеотидов (Vergnaud, Denoeud, 2000; van IJzendoorn et al., 2010). Кроме того, за последние годы стала очевидной взаимосвязь между статусом метилирования сателлитной ДНК, нестабильностью повторов и возникновением патологических изменений в организме (Robertson, Wolffe, 2000).
Несмотря на полученные данные о регуляторных свойствах минисателлитных последовательностей, вопрос о функциях этих элементов генома, и в частности механизмах участия в развитии различных патологий, до сих пор остается открытым. В связи с этим поиск и изучение новых минисателлитных последовательностей в геноме человека крайне актуальны. Одним из таких минисателлитных локусов является UPS29 (University Paris South), локализованный в интроне 14-15 гена ACAP3 (ArfGAP, Coiled coil, Ankyrin repeat, PH domain) (CENTB5, KIAA1716) (GeneID: 116983). В Лаборатории молекулярной цитогенетики развития млекопитающих Отдела молекулярной генетики
Института экспериментальной медицины на протяжении многих лет ведется изучение
минисателлитного повтора UPS29. Ранее было выявлено 7 аллелей минисателлита
UPS29, содержащих 6, 8, 9, 10, 14, 17 и 24 повторов (Сучкова и др., 2007). При этом
установлено, что короткие аллели минисателлита UPS29 ассоциированы с ранним и
поздним дебютом болезни Паркинсона у женщин (Сучкова и др., 2009). Несмотря на то,
что механизм выявленной ассоциации не ясен, данные анализа in silico нуклеотидной
последовательности UPS29, указывающие на возможность участия минисателлита
UPS29 в альтернативном сплайсинге транскриптов гена ACAP3, а также взаимодействие
с рядом транскрипционных факторов (Шубина и др., 2009), позволяют предполагать
возможное модулирующее влияние этого минисателлитного повтора на экспрессию гена
ACAP3 и/или близлежащих генов. Следует отметить, что ген ACAP3, кодирующий белок
центаурин бета 5, локализован в субтеломерной области короткого плеча первой
хромосомы (1р36.33) и входит в одну группу сцепления с генами, вовлеченными в
развитие неврологических заболеваний и синдромов, в том числе различных форм
болезни Паркинсона и эпилепсии (Сучкова и др., 2009). Кроме того, известно, что
центауриновые белки в наибольшей степени экспрессируются в мозге (Nagase et al.,
2000) и связаны с развитием нейродегенеративных и психических заболеваний (Reiser,
Bernstein, 2004;
Wassink et al., 2005). Несмотря на эти данные, вопрос о возможном участии минисателлита UPS29 в патогенезе различных форм эпилепсии до сих пор не разрешен.
Эпилепсия и болезнь Паркинсона – широко распространенные заболевания неврологического профиля. По оценке Всемирной организации здравоохранения во всем мире эпилепсией страдают около 50 миллионов человек. На сегодняшний день в развитых странах доля людей, страдающих эпилепсией в активной форме, составляет от 4 до 10 человек на 1000 человек. Частота встречаемости болезни Паркинсона среди лиц старше 65 лет составляет 0,1 – 0,2%, в то время как среди лиц старше 85 лет этот показатель достигает 4%, при этом ожидается, что к 2030 году заболеваемость болезнью Паркинсона возрастет вдвое (Karlsson et al., 2013).
Эпилепсия и болезнь Паркинсона относятся к группе мультифакториальных заболеваний, развитие которых определяется сложным комплексом механизмов, контролируемых различными генетическими факторами (Engel, 2001; Иллариошкин и др., 2006). На сегодняшний день получены важные сведения лишь о некоторых механизмах этих заболеваний. Так, в отношении болезни Паркинсона выявлено 18 локусов PARK (Bekris et al., 2010), а в случае эпилепсии описаны гены белков ионных
каналов и нейромедиаторов, связанные с развитием этой патологии (Иллариошкин и др., 2002).
Следует подчеркнуть, что в настоящее время имеются данные, указывающие на
сочетанность эпилепсии и болезни Паркинсона (Bodenmann et al., 2001; Gaitatzis et al.,
2004; Feddersen et al., 2013). Однако общие патогенетические факторы этого явления до
сих пор точно не установлены. Среди предполагаемых общих причин этих заболеваний
рассматривают нарушение норадренергической системы, нейропатологические
изменения гиппокампа и его иннервации от голубого пятна (Szot, 2012), подавление автофагии (Polajnar, Zerovnik, 2011; Mizushima, Komatsu, 2011; McMahon et al., 2012). Кроме того, известно, что при некоторых эпилептических синдромах регистрируются изменения компонентов дофаминергической системы (Feddersen et al., 2013). В то же время при болезни Паркинсона некоторые антиэпилептические препараты оказывают нейропротективное воздействие на дофаминергические нейроны (Kidd, Schneider, 2011; Xiong et al., 2011). Одним из генов, изменение в котором связано с развитием эпилепсии, а также предполагаемым участием в процессе нейродегенерации, является ген цистатина B, CSTB (GeneID: 1476, 21q22.3), белковый продукт которого функционирует как ингибитор цистеиновых протеиназ (Turk et al., 2008). Особый интерес вызывает тот факт, что ген CSTB содержит минисателлит, экспансия которого приводит к снижению уровня мРНК цистатина B (Joensuu et al., 2007) и развитию миоклонус-эпилепсии Унферрихта-Лундборга (Lalioti et al., 1997a; Joensuu et al., 2007). Несмотря на имеющиеся данные о возможном участии белка цистатина В в развитии не только различных форм эпилепсии, но и ряда нейродегенеративных заболеваний, в литературе отсутствуют сведения об изучении изменения уровня мРНК этого гена при этих патологиях.
Следует отметить, что несмотря на достигнутый прогресс и большой интерес к молекулярно-генетической составляющей эпилепсии и болезни Паркинсона, полученные данные о патогенезе этих заболеваний до сих пор не позволяют сформировать полное представление о механизмах развития этих патологий. Очевидно, что некоторые участники патогенеза до сих пор не выявлены. В этой связи поиск новых молекулярных факторов, в том числе минисателлитных ДНК повторов, вовлеченных в развитие этих патологических состояний организма, является весьма актуальным.
Цель работы – оценить влияние минисателлитного повтора UPS29 на экспрессию гена ACAP3 при эпилепсии и болезни Паркинсона в сравнении с модельными экспериментами на культуре клеток.
Задачи исследования включали:
-
сравнить аллельные и генотипические частоты минисателлита UPS29 у пациентов с эпилепсией, болезнью Паркинсона и у здоровых людей;
-
провести сравнительный анализ статуса метилирования ДНК UPS29 у пациентов с эпилепсией, болезнью Паркинсона и у здоровых людей;
-
оценить уровень мРНК гена ACAP3 в лейкоцитах периферической крови у пациентов с эпилепсией, болезнью Паркинсона, здоровых людей;
-
оценить уровень мРНК гена CSTB в лейкоцитах периферической крови у пациентов с эпилепсией, болезнью Паркинсона, здоровых людей;
-
оценить влияние различных аллелей UPS29 на экспрессию репортерного гена EGFP в модельных экспериментах по временной трансфекции клеточных культур различного типа (HeLa, F9, астроциты крысы);
-
сравнить модулирующий эффект различных аллелей минисателлита UPS29 на уровень экспрессии репортерного гена EGFP в клетках мышиной эмбриональной тератокарциномы линии F9 в экспериментах по стабильной трансфекции.
Научная новизна диссертационной работы. В результате данного диссертационного
исследования впервые было установлено повышение частоты коротких аллелей
минисателлита UPS29 среди женщин с симптоматической эпилепсией. Впервые
выявлено снижение частоты метилированных форм UPS29 в лейкоцитах
периферической крови у женщин с эпилепсией и отсутствие связи между статусом метилирования UPS29 и болезнью Паркинсона. Впервые показано, что при симптоматической эпилепсии и болезни Паркинсона наблюдается повышение уровня мРНК гена ACAP3 в лейкоцитах периферической крови по сравнению с контролем. Впервые изучен уровень мРНК гена CSTB при симптоматической эпилепсии и болезни Паркинсона и показано, что при этих заболеваниях уровень мРНК CSTB значительно снижается по сравнению с контролем. Впервые, в модельных экспериментах обнаружено, что короткий аллель минисателлита UPS29 обладает супрессорными свойствами в отношении экспрессии репортерного гена EGFP в клеточной линии F9. Теоретическая и практическая значимость результатов. В данном диссертационном исследовании были выявлены новые молекулярно-генетические факторы патогенеза симптоматической эпилепсии и болезни Паркинсона. Полученные сведения вносят вклад в понимание механизмов патогенеза симптоматической эпилепсии и болезни Паркинсона и позволяют получить дополнительную информацию о возможных общих биохимических механизмах сочетанности этих заболеваний.
Помимо новых сведений для понимания молекулярных основ патогенеза эпилепсии и болезни Паркинсона, результаты данного исследования могут представлять интерес и для клинической практики. Молекулярно-генетический анализ минисателлита UPS29 у пациентов с различными формами эпилепсии и болезни Паркинсона может быть использован как дополнительный прогностический критерий риска развития этих заболеваний, для определения которого используется доступный биологический материал, а именно лейкоциты периферической крови. Кроме того, полученные данные об изменении уровня экспрессии гена АСАРЗ в клетках периферической крови у пациентов с эпилепсией и болезнью Паркинсона, могут быть полезными при создании тест-систем на основе комплексных биомаркеров для диагностики этих заболеваний, подборе персонализированного курса терапии, в том числе с учетом генотипа по минисателлиту UPS29. Полученные данные об изменении уровня экспрессии гена АСАРЗ могут найти применение при поиске и проверке новых фармакологических препаратов, разрабатываемых для лечения эпилепсии и болезни Паркинсона. Кроме того, установленное различие в статусе метилирования UPS29 у пациентов с эпилепсией может оказаться важным для предсказания эффекта антиэпилептических препаратов, обладающих влиянием на процесс метилирования ДНК.
Положения, выносимые на защиту.
Короткие аллели минисателлита UPS29 у женщин являются фактором риска развития симптоматической эпилепсии и болезни Паркинсона с поздним дебютом заболевания. Наличие коротких аллелей UPS29 может служить дополнительным критерием риска развития этих заболеваний.
Статус метилирования минисателлита UPS29 оказывает влияние на развитие симптоматической эпилепсии у женщин.
Ген АСАРЗ вовлечен в патогенез симптоматической эпилепсии и болезни Паркинсона.
Ген CSTB вовлечен в патогенез симптоматической эпилепсии и болезни Паркинсона.
Минисателлит UPS29 обладает супрессорными свойствами в отношении экспрессии репортерного гена EGFP в клетках мышиной эмбриональной тератокарциномы линии F9.
Степень достоверности и апробация результатов.
Экспериментальные данные получены с применением современных биохимических и молекулярно-биологических методов, лично обработаны и проанализированы. Выносимые на защиту научные положения и вытекающие из них выводы подтверждены экспериментальными данными, полностью обоснованы и
соответствуют представленным результатам. Достоверность выводов подтверждается
большим фактическим материалом, корректной обработкой данных на основе методов статистического анализа.
Материалы диссертации были представлены на: IV Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010); XVI Всероссийском симпозиуме «Структура и функция клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2010); Всероссийской научно-практической Конференции с международным участием "Молекулярная диагностика - 2010" (Москва, 2010); 22-ой Европейской студенческой конференции «Perspectives and Challenges in Regenerative Medicine» (Берлин, 2011); Международном молодежном научном форуме “Ломоносов - 2011” (Москва, 2011); VIII Международной конференции молодых ученых «Биология: от молекулы до биосферы» (Харьков, 2013); XX Международном Конгрессе по болезни Паркинсона и сопутствующим заболеваниям «Integration by Translation» (Женева, 2013); VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014» (Москва, 2014); VI съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) (Ростов-на-Дону, 2014).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе статья в отечественном журнале, статья в международном рецензируемом журнале, 10 тезисов отечественных и международных конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками и 17 таблицами; состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, и списка цитируемой литературы (277 источников, в том числе 256 на иностранных языках).
Методы изучения роли минисателлитных последовательностей ДНК в регуляции экспрессии генов
Наиболее широко распространенным методическим подходом в изучении регуляторной функции минисателлитных последовательностей ДНК в экспрессии генов является использование эукариотических экспрессионных векторов, несущих исследуемый минисателлит и репортерный ген.
Экспрессионные конструкции чаще всего создают на основе плазмидных векторов. Однако в случае изучения регуляторных свойств минисателлитов, находящихся на значительном расстоянии от регулируемого гена (например, 50 т.п.н.), используются искусственные хромосомы на основе ДНК дрожжей (YACs), бактериофагов (PACs), бактерий (BACs), позволяющих встраивать последовательности протяженностью 250 – 1000 т.п.н. В качестве репортерных генов наиболее часто используют CAT, GFP (EGFP), LacZ, люциферазу (MacKenzie, Quinn, 2004). Обычно в состав конструкций включают варианты минисателлитов, различающиеся по числу повторов. В таком случае этот метод позволяет оценивать не только влияние минисателлита как такового на экспрессию репортерного гена, но и сравнивать степень влияния разных аллелей этого минисателлита на экспрессию. К тому же экспрессия репортерного гена происходит с участием естественного транскрипционного аппарата клетки, включая энхансеры и сайленсеры (Knight, 2003). Полученные рекомбинантные конструкции используют для трансфекции культуры клеток. Выбор клеточной линии имеет особое значение в случае изучения тканеспецифичного влияния изучаемых минисателлитов на экспрессию генов (MacKenzie, Quinn, 2004). На сегодняшний день разработано несколько методов трансфекции клеток, основанных на использовании микрочастиц (кальций-фосфатный метод), катионных полимеров (полиэтиленимин) и липосом (Knight, 2003). Различают два вида трансфекции – временную, при которой рекомбинантная конструкция не встраивается в геном трансфектных клеток, и стабильную, когда экзогенный материал становится частью генома трансфектных клеток. Несмотря на то, что в условиях временной трансфекции экспрессия репортерного гена происходит без влияния геномного окружения, этот подход очень широко используется для такого рода исследований. Эксперименты по стабильной трансфекции требуют большего времени, однако позволяют оценивать экспрессию репортерного гена в условиях геномного окружения, которые в большей степени приближены к естественным условиям, в которых происходит экспрессия генов (Knight, 2003).
Использование рекомбинатных конструкций в экспериментах по трансфекции позволило получить сведения об участии в модуляции экспрессии генов таких минисателлитов, как STin2 (Klenova et al., 2004), B2-VNTR (Zamorano et al., 2005), SEC14L-VNTR (Nakamura et al., 1998), VNTR из хромосомного локуса 11р15 (Iwashita et al., 2001).
Помимо клеточных линий, модельные эксперименты по анализу экспрессии репортерных генов в составе генетических конструкций проводятся также на трансгенных животных. В данном случае введение репортерной конструкции в геном организма–хозяина производят посредством микроинъекции чужеродной ДНК преимущественно в мужской пронуклеус зиготы. Несмотря на то, что этот подход позволяет изучить роль минисателлитов в условиях организма и получить данные, в наибольшей степени отражающие влияние минисателлитных повторов на экспрессию репортерных генов, этот метод используется гораздо реже, что связано со сложностью получения трансгенных животных, дороговизной и большими временными затратами (MacKenzie, Quinn, 2004).
Изучение регуляторных свойств минисателлитов в модуляции экспрессии генов осуществляется также с помощью методов, основанных на анализе способности связывания ДНК минисателлитов с белками, имеющими большое значение для транскрипции, например ТФ, РНК-полимеразами (Knight, 2003). Известно, что минисателлиты могут взаимодействовать с ТФ (Бабушкина, Кучер, 2011), которые в свою очередь характеризуются высокой степенью специфичности связывания с определенными доменами ДНК (Knight, 2003). Для изучения взаимодействия последовательностей минисателлитных повторов ДНК с белками (ТФ, РНК-полимеразы) используют несколько методов, среди которых наиболее распространены EMSA (Electrophoretic Mobility-Shift Assay или изменение электрофоретической подвижности) и метод «DNA footprinting». Метод EMSA является относительно простым и быстрым в исполнении и одновременно достаточно чувствительным способом изучения ДНК-белковых взаимодействий in vitro (Knight, 2003). Использование этого метода позволило изучить взаимодействие ТФ с такими минисателлитами, как DAT-VNTR и STin2 (Michelhaugh et al., 2001), VNTR гена метилтрансферазы TPMT (Zukic et al., 2010). В отличие от EMSA, позволяющего исследовать отдельные сайты связывания с ДНК, метод «DNA footprinting» дает возможность анализировать области ДНК протяженностью до нескольких сотен оснований и детектировать множественные сайты связывания ДНК с белками (Knight, 2003). Этот метод был использован при изучении ряда минисателлитных последовательностей: минисателлит гена mts1 (Prokhortchouk et al., 1998), минисателлит гена ApoB (Levy-Wilson et al., 1991), MsH42 гена Q9ULM1 (Boan et al., 2003).
Следует отметить, что одновременное использование нескольких выше описанных методов позволяет получить наиболее полную информацию о роли минисателлитов в модуляции экспрессии генов. Таким образом, минисателлиты представляют собой тандемно повторяющиеся кластеры ДНК, которые локализованы в различных участках генома. Несмотря на значительный прогресс в изучении этого класса тандемных повторов, а именно выявлении большого числа ассоциаций полиморфизма этих элементов генома с различными заболеваниями человека, участия минисателлитов в экспрессии генов, точная функция минисателлитов, а также механизмы участия в развитии различных патологий до сих пор не установлены. Подобная ситуация наблюдается для минисателлита UPS29, локализованного в гене ACAP3.
Впервые ген ACAP3 был описан в 2000 году под названием KIAA1716, для белкового продукта которого была предсказана функция ГТФаз-активирующего белка (Nagase et al., 2000).
Ген ACAP3 (CENTB5, KIAA1716) (GeneID: 116983) локализован в субтеломерной области короткого плеча первой хромосомы (1р36.33). До недавнего времени этот ген фигурировал под названием CENTB5, центаурин бета 5. Впервые название центаурины было предложено в 1996 году Hammonds-Odie c соавторами, когда при исследовании фракции белков мозга крысы был выделен новый белок, обладающий сродством к InsP4 (инозитол 1,3,4,5-тетракисфостат), названный центаурином альфа. Название белка связано с его химерной природой и сходством с семейством ГТФаз-активирующих белков, напоминающих семейство химеринов. Центаурины подобно химеринам по своей двойственной природе сравниваются с кентавром (centaur), мифическим персонажем с головой человека и телом лошади (Hammonds-Odie et al., 1996). В дальнейшем расширение семейства происходило в результате выделения высоко родственных белков из мозга свиньи, крысы, быка (Venkateswarlu, et al., 1999a; 1999b). Следует отметить, что центаурин бета 5 относится к активаторам Arf-ГТФаз-активирующим белкам (Arf - ADP – ribosylation factor, фактор рибозилирования АДФ). Arf-ГТФазы в свою очередь представляют семейство распространенных и высоко консервативных белков эукариот, регулируют мембранный транспорт и актиновый цитоскелет, напрямую стимулируют фосфолипазу D и фосфатидилинозитол 4-фосфат 5-киназу (Jackson et al., 2000).
Клеточные линии: эмбриональная тератокарцинома мыши F9, HeLa человека, первичные астроциты крысы
Эукариотический экспрессионный плазмидный вектор pR26-EGFP (5,5 т.п.н.) был любезно предоставлен проф. Н.В. Томилиным (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Плазмида pR26-EGFP была получена (Kisseberth et al., 1999) на основе вектора pEGFP-N1 («Clontech», США), содержащего ген усиленного зелного флуоресцирующего белка EGFP под контролем сильного и повсеместно функционирующего промотора ROSA26 мыши (Zambrowicz et al., 1997; Mao et al., 2005; Giel-Moloney et al., 2007).
В Лаборатории молекулярной цитогенетики развития млекопитающих ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН на основе вектора pR26-EGFP были получены три конструкции (pR26-UPS900, pR26-UPS400 и pR26-UPS1500), содержащие минисателлит UPS29 (рисунок 7). По сайтам HindIII и EcoRI между промоторами SV40 и ROSA26 вектора pR26-EGFP были встроены аллели UPS29 из 17 повторов (ПЦР-фрагмент 900 п.н.), 6 повторов (ПЦР-фрагмент 400 п.н.), а также вся последовательность интрона, в котором локализован аллель UPS29 из 17 повторов, и часть фланкирующих его экзонов 14 и 15 гена ACAP3 (ПЦР-фрагмент 1500 п.н.) (рисунок 8). Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови человека, а также клеток эмбриональной тератокарциномы мыши линии F9 методом хлороформ-изоамиловой экстракции.
Забор венозной крови (4 - 5 мл) проводили в пробирки с «K+-EDTA» («Sarstedt», Германия) либо «Lithium-heparin («Sarstedt», Германия). Венозную кровь инкубировали при +370С в течение 1 - 1,5 ч. Отделившуюся плазму переносили в 2 мл пробирки типа эппендорф и центрифугировали при 100g в течение 10 мин. Удаляли надосадочную жидкость и к полученному осадку лейкоцитов добавляли 300 мкл лизирующего буфера для выделения ДНК (50 мМ Tris-HCl, pH 8.0; 10 мМ ЭДТА, pH 8.0; 100 мМ NaCl), 35 мкл 10% SDS, 3 мкл протеиназы К (10 мг/мл). Инкубировали в течение ночи при +550С. Экстракцию ДНК осуществляли смесью хлороформа и изоамилового спирта (24 части хлороформа: 1 части изоамилового спирта). ДНК осаждали добавлением 2,5 объема охлажденного (-200С) перегнанного этилового спирта. Осадок промывали 70% этанолом. Высушенный осадок ДНК растворяли в 50 мкл апирогенной деионизированной воды («Медиана-фильтр», Россия). Количество ДНК определяли спектрофотометрически на приборе Nanodrop 2000с («Thermo Scientific», США). Качество ДНК оценивали с помощью электрофореза в 1,2 % агарозе.
Геномную ДНК из клеток эмбриональной тератокарциномы мыши линии F9 получали из 2-суточной культуры клеток, выращенной согласно пункту 2.2.6. Культуру клеток F9 интенсивно встряхивали в культуральных флаконах, переносили в пластиковые круглодонные пробирки на 10 мл, центрифугировали при 1000 – 2500g 5 мин, надосадочную жидкость удаляли. Очищенные от компонентов среды клетки (107 клеток) помещали в 300 мкл лизирующего буфера для выделения ДНК. Последующие стадии выделения ДНК проводили по протоколу, описанному выше.
Аллельные варианты минисателлита UPS29 человека выявляли с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров clUP3 и clUP4, а также праймеров exUP5 и exUP6 (Сучкова и др., 2007) (рисунок 9, таблица 6). Амплификацию проводили на приборе Терцик («ДНК-технология», Россия) в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 60 мM Tris-HCl (pH 8.5), 25 мM KCl, 10мM 2-меркаптоэтанола, 0.1% Тритон Х-100, 3 мM MgCl2, по 320 мкМоль каждого дНТФ, 1.25 ед. Taq-полимеразы («Медиген», Новосибирск), по 0.4 мкМоль каждого праймера и 10 - 15 нг геномной ДНК. Режим амплификации включал предварительную денатурацию при 970С, 7 мин; 30 циклов, состоящих из денатурации при 960С,1 мин; отжига с праймерами при 570С, 1 мин; элонгации при 720С, 3 мин; заключительный цикл: 570С, 1 мин и 720С, 8 мин. Продукты амплификации разделяли с помощью нейтрального электрофореза в 6% ПААГ и окрашивали в 0.1% AgNO3 (пункт 2.2.4)
Для анализа метилирования UPS29 был использован классический метод, предложенный Singer-Sam (цит. по Saluz, Jost, 1993). Этот метод заключается в ферментативном гидролизе геномной ДНК метил-чувствительными эндонуклеазами с последующей ПЦР. Геномную ДНК обрабатывали эндонуклеазами рестрикции - изошизомерами Mspl и НраІІ («СибЭнзим», Новосибирск), специфически расщепляющими сайт C CGG в зависимости от наличия метилирования внутреннего цитозина. Ферментативный гидролиз геномной ДНК проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Рестрикционная смесь объемом 30 мкл содержала 10 мМ Tris-HCl, рН 7.6; 10 мМ MgCl2; 1 мМ дитиотрейтол, 20 ед. Mspl или 20 ед НраІІ, 50 нг геномной ДНК. Рестрикционную смесь инкубировали при 37С в течение ночи. В качестве контроля эффективности ферментативного гидролиза использовали плазмидную конструкцию pUC19-UPS1500 (1000 нг), содержащую 26 Mspl/Hpall сайтов. После рестрикции 7,5 мкл рестрикционной смеси вносили в ПЦР-смесь (см. пункт 2.2.2.), но без добавления MgCb, т.к. рестрикционная смесь содержит достаточное для амплификации ДНК количество хлорида магния. Продукты амплификации разделяли с помощью нейтрального электрофореза в 6% ПААГ и окрашивали в 0.1% AgNCb. В качестве контроля отсутствия деградации ДНК в рестрикционной смеси и эффективности амплификации в отдельную пробирку с ПЦР-смесью добавляли соответствующий образец геномной ДНК, который не обрабатывали эндонуклеазами рестрикции, но инкубировали в рестрикционной смеси при 370С в течение ночи. На рисунке 10 представлена схема положения сайтов рестрикции MspI и HpaII в аллеле UPS29 из повторяющихся единиц.
Анализ метилирования минисателлитного повтора UPS29 при эпилепсии и болезни Паркинсона
Известно, что статус метилирования минисателлитов может оказывать влияние на характер ассоциаций минисателлитных последовательностей с заболеваниями (van IJzendoorn et al., 2010). В связи с этим был проведен анализ статуса метилирования минисателлитного повтора UPS29 у пациентов с эпилепсией, БП и здоровых людей.
Статус метилирования минисателлита UPS29 определяли с помощью метода метил-чувствительной ПЦР с использованием изошизомеров MspI и HpaII. Выбор этого метода связан с тем, что, согласно in silico анализу нуклеотидной последовательности UPS29, длинный аллель из 17 повторов содержит 12 сайтов узнавания для эндонуклеаз рестрикции MspI и HpaII (5 -CCGG-3 ) (рисунок 10). Следует отметить, что данный метод не позволяет оценить количество и положение метилированных CpG-динуклеотидов в исследуемой последовательности ДНК, но дает возможность достаточно быстро выявлять образцы ДНК (индивиды) с метилированными или неметилированными/гипометилированными аллелями UPS29. Еще одной особенностью этого метода является то, что в случае гомозиготного состояния UPS29 невозможно сделать вывод, один или оба аллеля были метилированы, поэтому в данной работе указывается частота индивидов с метилированными или гипометилированными вариантами UPS29, а не частота метилированных или гипометилированных аллелей UPS29.
По результатам метил-чувствительной ПЦР в выборке здоровых людей и у пациентов с эпилепсией и БП были выявлены индивиды как с гипометилированными, так и с метилированными формами UPS29, как среди гомозигот по длинному аллелю «17» (17 повторов) и коротким аллелям (менее 17 повторов), так и среди гетерозигот (рисунок 12, таблица 12).
При сравнении частоты встречаемости индивидов с метилированными формами UPS29 (без учета полиморфизма по длине аллелей UPS29) было обнаружено статистически значимое понижение частоты индивидов с метилированным вариантом UPS29 по сравнению с контролем только у женщин с эпилепсией [p=0,048; RR=1,65 (95% CI: 1,02 – 2,66); OR=2,32 (95%CI: 1,05 – 5,14); Phi=0,2] (таблица 12). Для мужчин с эпилепсией, а также для пациентов с БП (как мужчин, так и женщин) достоверных различий по встречаемости индивидов с метилированными формами UPS29 не установлено (таблицы 12, 13).
Частота индивидов с метилированными формами UPS29 у пациентов с эпилепсией и здоровых людей
В связи с выявленной ассоциацией коротких аллелей UPS29 с эпилепсией и БП у женщин представлялось важным проведение сравнительного анализа частоты встречаемости индивидов в зависимости от статуса метилирования различных по длине аллелей UPS29, включающих гомозиготы «17-17», гомозиготы «К-К» среди всех изучаемых групп.
Обнаружено понижение частоты индивидов («17-17») с метилированным UPS29 только у женщин с эпилепсией [p=0,026; RR=2,07 (95% CI: 1,08 – 3,96); OR=3,27(95% CI: 1,17 – 9,15); Phi=0,28;]. Для мужчин с эпилепсией и пациентов с БП не выявлено достоверных различий по частоте встречаемости индивидов «17-17» с метилированным UPS29 (таблицы 14, 15). Статистический анализ частот индивидов («К-К»), несущих метилированные короткие аллели UPS29 не проводился из-за низкой встречаемости таких генотипов в исследуемых выборках.
Частота индивидов с генотипом «17-17» с метилированным UPS29 среди пациентов с эпилепсией и здоровых людей
Многие минисателлиты вовлечены в патогенез заболеваний посредством участия в модуляции экспрессии генов, поэтому одной из задач данного исследование была оценка уровня экспрессии гена ACAP3, в котором локализован минисателлит UPS29. Уровень экспрессии был также определен для гена цистатина B – CSTB. Включение гена CSTB в данный эксперимент связано с тем, что в его промоторной области расположен минисателлитный повтор CSTB-VNTR, для которого доказана ассоциация с миоклонус-эпилепсией Унферрихта-Лундборга (Laliotti et al.,1997а; Joensuu et al., 2007), связанная с модулирующим влиянием этого минисателлита на экспрессию гена CSTB (Joensuu et al., 2007; Borel et al., 2012). Кроме того, предполагается, что данный ген может быть вовлечен в процесс нейродегенерации (Polajnar, Zerovnik, 2011).
Уровень экспрессии генов ACAP3 и CSTB в лейкоцитах периферической крови пациентов с эпилепсией (11 мужчин и 11 женщин), БП (9 мужчин и 10 женщин), здоровых людей (11 мужчин и 21 женщина) определяли с помощью ПЦР «в реальном времени». Средние значения нормализованного уровня экспрессии изучаемых генов для всех исследуемых групп представлены на рисунках 13, 14.
При эпилепсии наблюдалось повышение уровня экспрессии ACAP3 почти в 2 раза как у женщин (р=0,01), так и у мужчин (р=0,01) с эпилепсией по сравнению с контролем. При БП статистически значимое повышение уровня мРНК ACAP3 было установлено только для женщин (р=0,01) (рисунок 13).
При анализе экспрессии гена CSTB наблюдалось снижение уровня мРНК как при эпилепсии, так и при болезни Паркинсона. Для женщин с эпилепсией было выявлено понижение экспрессии почти в 3 раза (р=0,05), тогда как у мужчин с эпилепсией эта разница достигала 2 раз (р=0,05). При болезни Паркинсона у женщин уровень экспрессии этого гена снижен практически в 2,4 раза (р=0,01), тогда как у мужчин с БП – в 3 раза (р=0,05) (рисунок 14).
Полученные результаты впервые указывают на участие генов ACAP3 и CSTB в патогенезе симптоматической эпилепсии и болезни Паркинсона. При этом выявленные закономерности в изменении уровня экспрессии этих генов при изучаемых заболеваниях носят гендерный характер.
Поскольку уровень экспрессии может изменяться в зависимости от числа копий гена, то в данном исследовании было определено число копий гена ACAP3 в геноме изучаемых групп пациентов и здоровых людей методом ПЦР «в реальном времени». Как у пациентов с эпилепсией и БП, так и в группе контроля ген ACAP3 представлен в 2 копиях на диплоидный геном.
Изменение статуса метилирования ДНК минисателлитного повтора UPS29 при эпилепсии у женщин
Метилирование ДНК является одним из основных эпигенетических факторов регуляции активности генов (Keshet et al., 1986; Shemer et al., 1996; Jones et al., 1998; Gopalakrishnan et al., 2008) и нестабильности генома (Rodertson, Wolffe, 2000; Dion et al., 2008). При этом тандемные повторы ДНК часто выступают в качестве потенциальных мишеней для такого рода модификации. Различные отклонения от нормы в статусе метилирования ДНК повторяющихся последовательностей могут обуславливать количественные различия в экспрессии генов и в определенных случаях приводить к развитию болезни (Xu et al., 1999; Crossen, Morrison, 1998; Hornstra et al., 1993; Philibert et al., 2007). В связи с этим одна из задач представленной работы заключалась в анализе метилирования минисателлита UPS29 у здоровых людей, пациентов с эпилепсией и пациентов с болезнью Паркинсона.
При сравнении частоты встречаемости индивидов с метилированными формами UPS29 (без учета полиморфизма по длине аллелей UPS29) было обнаружено статистически значимое понижение частоты индивидов с метилированным вариантом UPS29 по сравнению с контролем только у женщин с эпилепсией [p=0,048; RR=1,65 (95% CI: 1,02 – 2,66); OR=2,32 (95%CI: 1,05 – 5,14); Phi=0,2]. Для мужчин с эпилепсией, а также для пациентов с БП (как мужчин, так и женщин) достоверных различий по встречаемости индивидов с метилированными формами UPS29 не установлено.
В связи с выявленной ассоциацией коротких аллелей UPS29 с эпилепсией и БП у женщин представлялось важным проведение сравнительного анализа частоты встречаемости индивидов в зависимости от статуса метилирования различных по длине аллелей UPS29, включающих гомозиготы по длинному аллелю («17-17»), гомозиготы по коротким аллелям среди всех изучаемых групп.
Обнаружено понижение частоты индивидов «17-17» с метилированным UPS29 только у женщин с эпилепсией [p=0,026; RR=2,07 (95% CI: 1,08 – 3,96); OR=3,27(95% CI: 1,17 – 9,15); Phi=0,28;]. Для мужчин с эпилепсией и пациентов с БП не выявлено достоверных различий по частоте встречаемости индивидов «17-17» с метилированным UPS29. Сравнительный анализ частоты индивидов, гомозиготных по коротким аллелям, в зависимости от статуса метилирования UPS29 не проводился из-за низкой встречаемости таких генотипов в исследуемых выборках.
Примеры изучения модулирующего влияния статуса метилирования минисателлитов при различных заболеваниях описаны в литературе. Так, например, для минисателлитного повтора CSTB-VNTR, экспансия которого ассоциирована с миоклонус-эпилепсией, не выявлена связь между статусом его метилирования и патогенезом миоклонус-эпилепсии. Показано, что экспансия повторов CSTB-VNTR не приводила к de novo метилированию промотора гена цистатина В (Weinhaeusel et al., 2003). Как у пациентов с миоклонус-эпилепсией, так и у здоровых людей минисателлит CSTB-VNTR и промоторная область гена цистатина В были не метилированы (Horiuchi et al., 2005). В то же время для минисателлита 5-HTTLPR, локализованного в промоторе гена транспортера серотонина 5-HTT, описана зависимость между генотипом 5-HTTLPR и статусом метилирования промоторной области как в клетках лимфобластов (Philibert et al., 2007), так и в лейкоцитах периферической крови у пациентов с психическими травмами (van IJzendoorn et al., 2010). Так, более высокий уровень метилирования промотора 5-HTT у носителей протективного генотипа 5-HTTLPR был связан с нарушением экспрессии 5-HTT (снижение уровня мРНК) и повышенным риском развития психических нарушений. При этом влияние негативного генотипа этого минисателлита обнаруживалось только в условиях пониженного уровня метилирования промотора 5-HTT (van IJzendoorn et al., 2010).
Следует отметить, что предварительные результаты исследований, проводимых в нашей лаборатории по анализу метилирования ДНК тандемных повторов при сердечно-сосудистых заболеваниях, указывают на возможную роль метилирования ДНК минисателлитных повторов 5-HTTLPR и STin2 гена 5-HTT в патогенезе ишемической болезни сердца (ИБС) и инфаркта миокарда (ИМ). Так, 5-HTTLPR у пациентов с ИБС, ИМ и в группе контроля находился только в неметилированном состоянии, тогда как для минисателлита STin2, локализованного в интроне 2 гена 5-HTT, наблюдалось повышение частоты метилированных аллелей у пациентов с ИБС и ИМ (Yamaltdinova et al., 2011). Также у пациентов с ИБС и инфарктом миокарда было выявлено повышение частоты метилированной формы длинного аллеля минисателлита B2-VNTR гена рецептора В2 брадикинина BDKRB2 (Сучкова и др., 2010). При этом как для STin2, так и B2-VNTR отмечалось повышение доли метилированных аллелей у людей, перенесших инфаркт, по сравнению с пациентами с ИБС.
Таким образом, впервые обнаружено понижение частоты встречаемости индивидов с метилированным UPS29 у женщин с симптоматической эпилепсией. Эти результаты указывают на возможное участие метилирования UPS29 в патогенезе эпилепсии, в частности посредством модуляции экспрессии гена ACAP3. В связи с актуальностью создания биомаркеров на основе статуса метилирования ДНК с использованием легкодоступного биологического материала, в частности периферической крови, не исключено, что в будущем оценка статуса метилирования минисателлита UPS29 может иметь большое значение в качестве одного из биомаркеров эпилепсии. 4.3. Изменение уровня экспрессии генов ACAP3 и CSTB в лейкоцитах периферической крови при эпилепсии и болезни Паркинсона
Выявленная ассоциация коротких аллелей UPS29 c эпилепсией и БП у женщин, а также изменения в характере метилирования UPS29 у женщин с эпилепсией могут отражаться на патогенезе этих неврологических заболеваний посредством участия гена ACAP3 в развитии изучаемых патологий. Для проверки данного предположения был оценен уровень экспреcсии (мРНК) гена ACAP3 у здоровых людей и пациентов с эпилепсией и БП с помощью ПЦР «в реальном времени». Кроме того, оценка уровня мРНК была проведена для гена CSTB. Выбор этого гена был обусловлен двумя причинами. Во-первых, этот ген кодирует белок, потеницально связанный с дегенеративными процессами (Ii et al., 1993), а во-вторых, в его промоторной области находится минисателлитный повтор CSTB-VNTR, экспансия которого ассоциирована с миоклонус-эпилепсией Унферрихта-Лундборга (Lalioti et al., 1997a; Joensuu et al., 2007).
Согласно полученным результатам, при эпилепсии было установлено повышение уровня экспрессии ACAP3 почти в 2 раза как у женщин (р=0,01), так и у мужчин (р=0,01). При БП выявлено статистически значимое повышение уровня мРНК ACAP3 только для женщин (р=0,01).
Известно, что изменение уровня экспрессии некоторых генов, ассоциированных с заболеваниями, связано с изменением числа копий (CNV – copy number variation) структурных элементов генов, полноразмерных генов, групп близкорасположенных генов (Henrichsen et al., 2009). В отношении эпилепсии и БП имеются сведения об изменении числа копий некоторых генов, которое оказывает влияние на развитие этих патологий. Например, увеличение числа копий гена SCNA при семейных формах БП сопровождается повышением уровня экспрессии этого гена, что приводит к интенсификации процесса формирования протофибрилл и более тяжелому течению заболевания (Bekris et al., 2010). Методом полногеномного анализа получены данные о наличии в геноме пациентов с эпилепсией делеций и дупликаций различных структур генома, которые не обнаружены в геноме здоровых людей. Результаты этого исследования указывают на существование редких изменений числа копий элементов генома, которые вносят вклад в развитие широкого ряда генерализованных и фокальных эпилепсий (Mefford et al., 2010). В основном изучение изменения числа копий при эпилепсии связано с такими участками генома, как области 15q13.3, 15q11.2, 16p13.11 (Mefford et al., 2010; Mullen et al., 2013), гены AUTS2, CNTNAP2 (Friedman et al., 2008; Mefford et al., 2010). В связи с этими сведениями в данном исследовании представлялось важным определить число копий гена ACAP3 среди пациентов с эпилепсией, БП и здоровых людей. Установлено, что у пациентов с эпилепсией и БП, а также в группе контроля ген ACAP3 представлен двумя копиями на диплоидный геном. Полученные результаты указывают на то, что число копий гена центаурина бета 5 постоянно как среди здоровых людей, так и пациентов с эпилепсией и БП, и наблюдаемые отклонения в уровне мРНК ACAP3 при эпилепсии и БП не связаны с изменением копийности гена центаурина бета 5.
Выявленные различия в экспрессии центаурина бета 5 между здоровыми людьми и пациентами с эпилепсией указывают на возможную роль ACAP3 в патогенезе неврологических заболеваний. В пользу этого предположения свидетельствуют данные о связи центауриновых белков с болезнью Альцгеймера и аутизмом (Rademakers et al., 2005; Hayashi et al., 2006). Необходимо подчеркнуть, что ген ACAP3 локализован в одном хромосомном районе с генами, нарушение функционирования которых связано с развитием различных неврологических заболеваний и синдромов, в том числе с эпилепсией и БП. Поэтому, не исключено, что «кластер» этих генов вместе с ACAP3 может находиться под влиянием одних и тех же регуляторных элементов, среди которых может быть и минисателлит UPS29.
