Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Общая характеристика болезни Ауески 11
1.2. Общая характеристика вируса болезни Ауески 12
1.3. Структурно-функциональная характеристика гликопротеинов gB HgDBBA 14
1.3.1. Структурная характеристика гликопротеина gB ВБА 15
1.3.2. Структурная характеристика гликопротеина gD ВБА 20
1.3.3. Роль гликопротеинов gB и gD ВБА в проникновении вируса в клетки 21
1.3.3.1. Первичное гепарансульфат-зависимое взаимодействие альфагерпесвирусов с клетками 21
1.3.3.2. ГС-независимое связывание альфагерпесвирусов с клетками 26
1.3.3.3. Слияние вирусной оболочки и плазматической клеточной мембраной 28
1.3.3.4. Распространение альфагерпесвирусов от клетки к клетке 30
1.4. Роль гликопротеинов gB и gD ВБА в индукции противовирусного иммунитета 32
1.5. Заключение по литературному обзору 35
Экспериментальная часть 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы 37
2.1. Химические реактивы, среды и материалы 37
2.2. Животные 37
2.3. Сыворотки и антитела 37
2.4. Культуры клеток и вирусные штаммы 38
2.5. Определение титра инфекционности вируса ВБА 39
2.6. Очистка вируса 40
2.7. Получение вирионов ВБА, меченых [ ^І-метионином 40
2.8. Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к белкам ВБА 40
2.9. Наработка и очистка моноклональных антител 41
2.10. Получение конъюгатов антител с пероксидазой хрена 42
2.11. Определение концентрации белка 42
2.12. Электрофорез белков 43
2.13. Иммуноблоттинг 43
2.14. Иммунопреципитация радиоактивно-меченых вирусных белков 43
2.15. Исследование взаимодействия вирусных гликопротеинов с конканавалин А-сефарозой 44
2.16. Очистка гликопротеинов gB и gD с помощью аффинной хроматографии 44
2.17. Иммунопероксидазное окрашивание инфицированных клеток 46
2.18. Получение и контроль реконструированных липосом 47
2.18.1. Получение и реконструированных липосом 47
2.18.2. Получение радиоактивно-меченых реконструированных
липосом 48
2.18.3. Приготовление реконструированных липосом, нагруженных репортерными молекулами 48
2.18.4. Оценка проницаемости мембран липосом по одновалентным катионам (К+) 48
2.18.5. Определение ориентации гликопротеинов ВБА в мембране виросом. 49
2.19. Исследование взаимодействия гликопротеинов gB, gD и виросом
с клетками 49
2.19.1. Исследование связывания гликопротеинов gB, gD и виросом с клетками 49
2.19.2. Специфичность взаимодействия гликопротеинов gB, gD и виросом с клетками 50
2.19.3. Взаимодействие гликопротеинов gB и gD ВБА и виросом с гепарансульфатами клеток 51
2.19.4. Влияние обработки клеток гепариназой на связывание gB и виросом с клетками 51
2.19.5. Влияние гликопротеина gB на адсорбцию вирионов ВБА на клетках 51
2.19.6. Влияние гликопротеина gB на адсорбцию инфекционных вирусных частиц на клетках 52
2.19.7. Интернализация виросом клетками 52
2.20. Связывание гликопротеина gB ВБА с гепарин-сефарозой. 53
2.21. Иммуноферментные методы 53
2.21.1. Определение ВБА-специфических антител с помощью непрямого ИФА 53
2.21.2. Двуцентровые gB, gD- и gE -специфические «сэндвич» ИФА 54
2.21.3. Определение gB-, gE- и gD-специфических антител с помощью прямых блокирующих ИФА 55
2.21.4. Определение эпитоп-специфических антител в сыворотках 55
2.21.5. Топографическое эпитопное картирование гликопротеина gD ВБА 56
2.21.6. Определение чувствительности эпитопов гликопротеина gD к 56
денатурации
2.22. Влияние gD-специфических антител на развитие вирусной инфекции in vitro 57
2.22.1. Определение вируснейтрализующей активности антител 57
2.22.2. Оценка влияния gB и gD -специфических антител на проникновение вируса внутрь клеток 57
2.22.3. Влияние gD-специфических мкАТ на распространение вируса от клетки к клетке 58
2.23. Исследование иммуногенной активности препаратов очищенных гликопротеинов gD и реконструированных липосом 58
2.24. Пассивная защита животных с помощью gB и gD-специфических мкАТ 59
2.25. Статистическая обработка результатов 59
ГЛАВА 3. Результаты исследований 60
3. Получение gD- и gB-специфических моноклональных антител и разработка методов иммуноаффинной очистки гликопротеинов 60
3.1. Получение панели gD-специфических мкАТ 60
3.2. Получение gB-специфических мкАТ 63
3.3. Разработка методов иммуноаффинной очистки гликопротеинов gB
и gD ВБА 63
4. Изучение взаимодействия гликопротеинов gB и gD ВБА с плазматическими мембранами клеток 70
4.1. Взаимодействие гликопротеина gB с клеточными культурами 70
4.2. Влияние гликопротеина gB на адсорбцию вируса на клетках 73
4.3. Связывание gB ВБА с иммобилизованным гепарином 75
4.4. Изучение связывания гликопротеина gB с гепарансульфатами клеток 77
4.5. Характеристика гепарансульфат-связывающего центра гликопротеина gB ВБА 79
4.6. Взаимодействие гликопротеина gD с клетками 80
5. Изучение взаимодействия вирусных гликопротеинов ВБА с
клетками с использованием метода реконструированных липосом 82
5.1. Реконструкция гликопротеинов ВБА в мембраны искусственных липосом 82
5.2. Изучение связывания виросом с клетками 84
5.3. Интернализация виросом клетками 88
6. Изучение антигенной структуры гликопротеина gD ВБА 89
6.1. Топографическое эпитопное картирование gD ВБА 90
6.2. Характеристика эпитопов gD ВБА 92
6.3. Консервативность антигенной структуры гликопротеина gD ВБА 94
7. Изучение гуморального иммунного ответа на гликопротеин gD ВБА 95
7.1. Вклад конформационных и линейных эпитопов гликопротеина gD
в индукцию гуморального иммунного ответа 95
7.2. Эпитоп-специфический гуморальный иммунный ответ на гликопротеин gD ВБА 96
8. Индукция защитного иммунитета гликопротеином gD ВБА 98
8.1. Противовирусная активность gD-специфических антител in vitro 98
8.2. Пассивная иммунизация мышей gD-специфическими мкАТ 101
8.3. Защитная активная иммунизация мышей гликопротеином gD ВБА 102
9. Индукция противовирусного иммунитета при иммунизации мышей
вирусными антигенами, реконструированными в мембраны липосом 104
10. Разработка gD-ИФА для серологической диагностики БА 105
11. Обсуждение результатов 111
11.1. Изучение взаимодействия гликопротеина gB ВБА с клетками 111
11.2. Реконструкция вирусных гликопротеинов в мембраны липосом и изучение взаимодействия протеолипосом с клетками и их имуногенности 117
11.3. Исследование антигенной структуры и роли в индукции противовирусного иммунитета гликопротеина gD ВБА 121
11.4. Разработка ИФА для серологической диагностики БА 129
Заключение 132
Выводы 134
Список основных публикаций по теме диссертации 135
Список литературы 137
- Общая характеристика болезни Ауески
- Первичное гепарансульфат-зависимое взаимодействие альфагерпесвирусов с клетками
- Определение титра инфекционности вируса ВБА
- Получение gD- и gB-специфических моноклональных антител и разработка методов иммуноаффинной очистки гликопротеинов
Введение к работе
Актуальность проблемы
Альфагерпесвирусы (семейство Herpesviridae, подсемейство Alphaherpesvirinae) включают в себя ряд опасных патогенов человека и животных (вирусы простого герпеса человека 1 и 2 типа, вирус ветрянки и опоясывающего лишая, вирус инфекционного ринотрахеита, вирус болезни Ауески и др.). В оболочке альфагерпесвирусов насчитывается более 10 гликопротеинов. В ряду других гликопротеинов, гликопротеины gD и gB альфагерпесвирусов занимают особое место. У отдельных альфагерпесвирусов гликопротеин gB, наряду с гликопротеином gC, играет важную роль в первичной гепарансульфат (ГС)-зависимой адсорбции вируса на клетках (Li et al., 1995; Byrne et al., 1995; Herold et al., 1994). Гликопротеин gD участвует в процессе формирования более стабильного, ГС-независимого связывания вирусов с плазматической клеточной мембраной, которое следует за первичной адсорбцией вируса (Reske et al., 2007; McClain and Fuller, 1994; Karger and Mettenleiter, 1993). К настоящему времени идентифицированы клеточные рецепторы гликопротеина gD (Spear, 2004; Spear and Longnecker, 2003). После стабильного связывания альфагерпесвирусов с клетками происходит слияние вирусной оболочки с плазматической клеточной мембраной. В данном процессе участвуют вирусные гликопротеины gB, gD и комплекс gH-gL (Campadelli-Fiume et al., 2007; Spear, 2004). Гликопротеин gK, а также ряд белков тегумента, играют модулирующую роль в этом процессе (Spear et al., 2000; Roizmanand Spear, 1996). Кроме того, gB альфагерпесвирусов необходим для распространения вируса от клетки к клетке (Nixdorf et al., 2000) и проявления синцитиального фенотипа вирусов (Navarro et al., 1992).
Несмотря на интенсивные исследования молекулярной биологии альфагерпесвирусов, механизмы взаимодействия гликопротеинов gB и gD с клетками остаются недостаточно исследованными. Имеются лишь фрагментарные данные, касающиеся клеточных белков, вовлеченных в процессы взаимодействия с гликопротеином gB альфагерпесвирусов, не определена роль клеточных белков в слиянии вирусной и клеточной мембран. Изучение взаимодействия gB и gD альфагерпесвирусов с клеточными рецепторными структурами представляет не только значительный теоретический интерес, но и может явиться основой для разработки противовирусных препаратов, так как блокирование взаимодействия клеточных рецепторов и вирусных антирецепторов представляется
перспективным направлением в создании средств защиты от вирусных инфекций.
Кроме центральной роли гликопротеинов gB и gD альфагерпесвирусов в проникновении вирусов в клетки, эти гликопротеины так же играют важнейшую роль в индукции противовирусного иммунитета. Для многих альфагерпесвирусов показано, что гликопротеины gD и gB являются основными мишенями противовирусного иммунитета, индуцируя как гуморальный, так и клеточный иммунитет (Hong et al., 2002; van Rooij et al., 2000; Erratum, 2000; Packiarajah et al., 1998). В настоящее время гликопротеины gD и gB альфагерпесвирусов рассматриваются в качестве основных кандидатов на использование в вакцинах нового поколения (субъединичные вакцины, ДНК-вакцины).
Центральная роль гликопротеинов gB и gD альфагерпесвирусов в функционировании вирусов и в формировании противовирусного иммунитета определяет важность и актуальность дальнейшего исследования роли этих гликопротеинов на разных стадиях развития вирусов в клетках и в индукции противовирусного иммунитета.
Вирус болезни Ауески (ВБА, Suid herpesvirus 1), является типичным представителем альфагерпесвирусов и поражает многие виды диких и домашних животных (Wittman et al., 1991). Гликопротеины gB и gD ВБА характеризуются высоким уровнем структурной и функциональной гомологии с соответствующими гомологами других альфагерпесвирусов (Mettenleiter, 1994). Так, например, гликопротеин gB ВБА способен комплементировать gB-негативный мутант вируса простого герпеса человека 1-го типа; gB вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота способен комплементировать gB-негативный мутант ВБА (Miethke et al., 1995; Knopp and Mettenleiter, 1992; Rauh et al., 1991). Учитывая высокий уровень структурно-функциональной гомологии гликопротеинов gB и gD ВБА и других альфагерпесвирусов, ВБА является удобной моделью для изучения молекулярных механизмов взаимодействия гликопротеинов gB и gD альфагерпесвирусов с рецепторными структурами плазматических мембран чувствительных клеток, а также изучения их роли в индукции защитного иммунитета. Достоинством этой модели является апатогенность вируса для человека, легкость культивирования вируса на различных культурах клеток и наличие лабораторных моделей животных, чувствительных к вирусу (мыши, морские свинки, кролики).
Цель и задачи работы.
Целью работы было изучение взаимодействия гликопротеинов gB и gD вируса болезни Ауески с плазматическими мембранами чувствительных клеток и их роли в индукции противовирусного иммунитета.
Для достижения данной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:
Получить и охарактеризовать панель моноклональных антител к гликопротеинам gD и gB ВБА и разработать методы иммуноаффинной очистки гликопротеинов gD и gB.
Исследовать взаимодействие гликопротеинов gB и gD ВБА с плазматическими мембранами чувствительных клеток.
3. Реконструировать вирусные гликопротеины в мембраны
искусственных липосом и исследовать с помощью полученных
протеолипосом роль гликопротеина gB ВБА в адсорбции вируса на
плазматические мембраны чувствительных клеток.
Исследовать антигенную структуру гликопротеина gD ВБА и индукцию гуморального иммунитета на этот гликопротеин при инфицировании и иммунизации животных.
Изучить роль гликопротеинов gD и gB ВБА в индукции противовирусного иммунитета с использованием очищенных гликопротеинов и реконструированных липосом.
Научная новизна работы
Впервые показано, что гликопротеин gB ВБА играет важную роль в адсорбции вируса на клетках.
Впервые доказано, что гепарансульфаты плазматических клеточных мембран играют центральную роль в связывании гликопротеина gB ВБА с клетками. Установлено, что гепарансульфат-связывающий центр на гликопротеине gB ВБА является, по крайней мере, частично, конформационно-зависимым.
Впервые проведена реконструкция гликопротеинов ВБА в мембраны искусственных липосом. Полученные протеолипосомы (виросомы) специфически связывались с плазматическими клеточными мембранами и эффективно интернализовались клетками. С помощью виросом подтверждена важная роль гликопротеина gB ВБА в адсорбции вируса на клетках. Продемонстрировано, что виросомы на основе белков ВБА являются удобной моделью для изучения взаимодействия вирусных гликопротеинов с клетками и могут быть использованы для доставки биологически-активных молекул в
клетки.
4. Впервые показано, что реконструкция гликопротеинов ВБА в
мембраны искусственных липосом приводит к выраженному повышению их
иммуногенности.
5. Установлено, что конформационные эпитопы гликопротеина gD ВБА
играют центральную роль в индукции гуморального иммунного ответа на
этот гликопротеин при инфицировании и иммунизации животных.
6. Показана высокая консервативность антигенной структуры
гликопротеина gD ВБА.
Практическая значимость работы
Полученные в работе данные, касающиеся роли гликопротеинов ВБА в индукции противовирусного защитного иммунитета, а также иммуногенности липосомальных вирусных антигенов, могут лечь в основу разработки субъединичных и липосомальных вакцин против болезни Ауески.
Разработан иммуноферментный метод серологической диагностики болезни Ауески, основанный на выявлении в сыворотке животных антител к гликопротеину gD ВБА, который по своим характеристикам не уступает имеющимся тест-системам для диагностики болезни Ауески.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Гликопротеин gB вируса болезни Ауески играет важную роль в
адсорбции вируса на клетках in vitro.
2. Гепарансульфаты плазматических клеточных мембран играют
центральную роль в связывании гликопротеина gB ВБА с клетками.
Гепарансульфат-связывающий центр на гликопротеине gB ВБА является, по
крайней мере, частично, конформационно-зависимым.
3. Гликопротеины gD и gB ВБА имеют различные сайты связывания на
плазматической клеточной мембране. Клеточные гепарансульфаты не
участвуют в связывании гликопротеина gD с клетками.
4. Конформационные эпитопы гликопротеина gD ВБА играют
центральную роль в индукции гуморального иммунного ответа при
инфицировании и иммунизации животных.
Гликопротеин gD ВБА играет важную роль в индукции защитного иммунитета при инфицировании и иммунизации животных.
Реконструкция гликопротеинов ВБА в мембраны липосом приводит к выраженному повышению их иммуногенности.
Общая характеристика болезни Ауески
Болезнь Ауески (БА, псевдобешенство), вызываемая вирусом болезни Ауески (ВБА), является распространенным контагиозным вирусным заболеванием различных сельскохозяйственных и диких животных (Малярец и др., 1993; Сергеев, 1993; Wittman and Rziha, 1989; Конопаткин, 1984; Сосов и Ведерников, 1980; Gustafson, 1970). Основным животным-хозяином Б А являются свиньи. БА широко распространена в мире и наносит значительный урон животноводству многих стран.
БА является типичной герпесвирусной инфекцией с множеством форм течения. Заболевание свиней характеризуется энцефаломиелитом, который зачастую сопровождается поражением верхних и нижних дыхательных путей (Малярец и др., 1993; Сергеев, 1993; Wittman et al., 1991; Wittman and Rziha, 1989; Конопаткин, 1984; Gustafson, 1970). Для молодых животных характерно поражение ЦНС и заболевание часто заканчивается летальным исходом, в то время как у взрослых животных обычно наблюдаются только симптомы поражения верхних дыхательных путей и заболевание не приводит к их гибели. Заболевание свиноматок приводит к резкому нарушению воспроизводства стада (аборты, мертворожденные, мумифицированные и мацерированные плоды). Переболевшие животные мало пригодны для откорма и непригодны на племя вследствие остаточных патологических явлений (Сергеев, 1993; Wittman et al., 1991; Wittman and Rziha, 1989; Gustafson, 1970).
Инфицирование вирусом других животных (крупного рогатого скота, овец, собак, кошек, крыс, пушных зверей и др.) практически всегда связано с их заражением от больных свиней или с потреблением контаминированного вирусом мяса. В большинстве случаев при инфицировании этих животных вирусом они погибают, являясь конечным звеном эпизоотической цепи, так как количество выделяемого ими вируса недостаточно для заражения других животных (Сергеев, 1993; Wittman et al., 1991; Wittman and Rziha, 1989; Gustafson, 1970). Экспериментальную инфекцию можно вызвать у различных видов млекопитающих (лошади, мыши, морские свинки, крысы, кролики и др.) и птиц (цыплята, гуси, утки, голуби и др.). Люди невосприимчивы к заболеванию (Малярец и др., 1993; Wittman and Rziha, 1989; Gustafson, 1970).
Обычно воротами инфекции и местом первичной репликации вируса являются эпителиальные клетки верхних дыхательных путей (эпителий носовых раковин, области зева и дыхательных путей). Кроме этого, вирус проникает в нервные окончания тригеминальной и обонятельных областей и через них в ЦНС. Во вторичной фазе болезни, вирус распространяется по организму в свободной форме, либо посредством лимфоцитов, инфицированных вирусом, через кровеносную и лимфатическую систему (Wittman and Rziha, 1989; Gustafson, 1970). Генерализация инфекции длится примерно 7 дней.
Переболевшие животные становятся латентно-инфицированными и являются главным резервуаром вируса в хозяйствах (Cowen et al., 1990; Schoenbaum et al., 1990; Wittman et al., 1983). Латентный вирус обнаруживается в тригеминальных ганглиях, головном и спином мозге, миндалинах, лимфоидных клетках (Wittman and Rziha, 1989). Вирус в латентном состоянии может существовать в течение всей жизни животного. При определенных условиях (стресс, УФ облучение и др.) латентный вирус может реактивироваться и животное вновь становится источником инфекции (Сергеев, 1993; Wittman et al., 1991; Wittman and Rziha, 1989; Gustafson, 1970).
Вирус болезни Ауески (Snid Herpesvirus 1, вирус псевдобешенства) относится к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesvirinae (Mayo and Pringle, 1998; Mayo and Pringle, 1997; Мэрфи, 1989). Внутри подсемейства ВБА сгруппирован с вирусом ветрянки и опоясывающего лишая человека (ВВОЛ) и рядом герпесвирусов животных (вирус инфекционного ринотрахеита КРС (вирус ИРТ), герпесвирус лошадей 1-го типа и др.) в род Varicellovirus.
Вирионы ВБА имеют размеры 150-180 нм и состоят из четырех структурных компонентов: ядра (сердцевины), капсида, тегумента и оболочки. Ядро вириона диаметром 75 нм состоит из линейной 2-цепочечной молекулы ДНК, связанной с полиаминами и рядом белков. Ядро окружает икосаэдрический капсид диаметром 105 нм, состоящий из 162 частично полых белковых капсомеров (12 пентамеров и 150 гексамеров). Капсид покрывает внешняя оболочка нерегулярной формы, состоящая из 2-слойной липидной мембраны и погруженных в мембрану вирусных гликопротеинов и ряда белков негликопротеиновой природы. Между капсидом и вирусной оболочкой расположен, зачастую ассиметрично, тегумент - аморфное вещество белковой природы (Mettenleiter, 1991; Ройзман и Баттерсон, 1989; Wittman and Rziha, 1989; Gustafson, 1970).
Геном ВБА состоит из линейной 2-цепочечной ДНК, состоящей примерно из 150000 пар оснований и кодирующей около 70 вирусных белков. Геном разделен на длинный уникальный сегмент (UL) и короткий уникальный сегмент (US) посредством инвертированных повторов, которые фланкируют US сегмент.
ВБА способен продуктивно инфицировать различные культуры клеток животных in vitro. При размножении в культуре клеток, репликативныи цикл ВБА обычно занимает около 8 ч. Инфекция заканчивается лизисом зараженных клеток, который наступает через 24-36 часов после проникновения вируса в клетку.
В адсорбции вируса на клетках участвует комплекс гликопротеинов вируса (gC, gB, gD) и ряд клеточных рецепторных структур (гепарансульфаты клеток, модифицированные гепарансульфаты, HVEM, нектины 1 и 2) (Reske et al., 2007; Spear, 2004; Spear and Longnecker, 2003; Spear, 2001; Spear et al., 2000; Spear, 1993). После адсорбции вирус проникает внутрь клеток посредством слияния вирусной и клеточной мембраны. Механизм слияния клеточной мембраны и мембран герпесвирусов до сих пор не изучен, однако определены вирусные гликопротеины, участвующие в этом процессе (gB, gD, gH-gL) (Campadelli-Fiume et al, 2007; Farnsworth et al., 2007; Reske et al., 2007; Spear, 2004; Spear and Longnecker, 2003; Spear, 2001; Spear, 2000; Spear, 1993).
В результате слияния вирусной и клеточной мембран в клетку проникает нуклеокапсид. Уже через 5 мин после проникновения, нуклеокапсиды обнаруживаются около ядерных пор (Mettenleiter, 2002; Granzow et al., 1997). Механизм транспорта нуклеокапсидов к ядерным порам в основном неизвестен. По-видимому, в этом процессе белки цитоскелета клеток играют центральную роль. Нуклеокапсиды ориентируются одной из вершин в направлении ядерной поры, и ДНК ВБА инъецируется в нуклеоплазму без разрушения нуклеокапсида (Mettenleiter, 2002; Granzow et al, 1997).
Первичное гепарансульфат-зависимое взаимодействие альфагерпесвирусов с клетками
Потенциальные сигналы интернализации обнаружены в цитоплазматическом домене gB ВБА. Значение интернализации молекул gB, появившихся на цитоплазматической мембране инфицированных клеток, до конца неясно, однако предполагается, что интернализация gB альфагерпесвирусов является механизмом таргетинга гликопротеина в аппарат Гольджи, где происходит окончательное формирование вирусной оболочки (Zhu, 1995). В других работах, однако, показано, что интернализация gB не является необходимой стадией для включения gB в оболочку вирионов и не является необходимой для функционирования gB в процессах проникновения внутрь клеток и распространения от клетки к клетке (Nixdorf, 2000). Для ЦМВЧ было показано, что gB-гомолог, появлявшийся на цитоплазматической мембране инфицированных фибробластов, затем обнаруживался в составе вирусной оболочки (Fish et al., 1998; Norais et al., 1996; Radsak et al., 1996). Интернализация поверхностно-экспрессированного gB показана при репликации ВПГ-1, однако, в составе вирионов такие молекулы gB не обнаруживались. По-видимому, в процессе интернализации важную роль играет фосфорилирование gB-гомологов герпесвирусов (Fish et al., 1998; Radsak et al., 1996). Было показано, что экспрессия gB ЦМВЧ на цитоплазматической мембране определяется реакциями фосфорилирования-дефосфорилирования (Fish et al., 1998). Дефосфорилированный gB транспортируется в составе везикул, вероятно, к местам, где капсиды ЦМВЧ приобретают оболочку (Radsak et al., 1996).
Показано, что добавление ВБА-специфических антител к вирус-инфицированным клеткам приводит к агрегации гликопротеинов ВБА, экспрессированных на клеточной поверхности, в том числе и гликопротеина gB. Комплексы гликопротеинов с антителами либо переходят в ростовую среду, либо быстро интернализуются (Favoreel et al., 1999). Взаимодействие антител с мембранными гликопротеинами ВБА-инфицированных моноцитов приводит также к резкому снижению количества вируса внутри клеток (Favoreel et al., 2003). Все это может быть механизмом, позволяющим инфицированным клеткам ускользать от иммунных механизмов элиминации инфицированных клеток и способствовать распространению вируса по организму с помощью вирус-инфицированных клеток.
gB-негативный мутант ВПГ-1 способен размножаться в культуре клеток, экспрессирующих гликопротеин gB ВБА; gB вируса ИРТ способен комплементировать gB-негативный вирус ВБА (Miethke et al., 1995; Mettenleiter et al., 1994). Это свидетельствует о высоком уровне структурно-функциональной gB гомологов различных герпесвирусов. Интересно, что gB ВБА не способен комплементировать gB ВПГ-1, что свидетельствует об отсутствии полной идентичности gB-гомологов альфагерпесвирусов.
Как следствие высокой гомологии на уровне аминокислотных последовательностей, между gB-гомологами разных герпесвирусов существует антигенное родство (Pereira, 1994; Hammerschmidt et al., 1988; Hammerschmidt et al., 1988; Robbins et al., 1987). Области наименьшей гомологии между гликопротеинами gB находятся в пределах первых 100 аминокислотных остатков, вблизи протеолитического сайта у процессируемых или в топографически гомологичном участке у непроцессируемых gB, и в цитоплазматическом сегменте. В N-концевой области находятся серотип-специфичные или штамм-специфичные эпитопы герпесвирусов (Basgoz et al., 1992; Chou et al., 1992; Van Regenmortel, 1990).
Ген, кодирующий гликопротеин gD, картирован в районе 0,813-0,832 единиц карты генома ВБА US сегмента в кластере генов гликопротеинов между генами gG и gl (Wathen and Wathen, 1986; Wathen et al., 1985). Гены gD и gl транскрибируются в виде одного колинеарного транскрипта, состоящего из 2400 нуклеотидов. Ген gD относится к поздним генам (Petrovskis et al., 1986). ВВОЛ остается единственным альфагерпесвирусом, у которого отсутствует гликопротеин gD.
Гликопротеин gD ВБА имеет молекулярную массу 50-60 кДа по данным разных авторов (Wathen et al., 1985). Гликопротеин синтезируется в виде предшественника с молекулярной массой 45 кДа, который быстро процессируется в зрелую форму примерно в течение 1 ч. Открытая рамка считывания содержит 402 аминокислотных остатка. Карбокситерминальный домен включает в себя 26 аминокислот. Особенностью первичной структуры gD является полное отсутствие потенциальных сайтов N-гликозилирования. Олигосахаридные остатки связываются с gD посредством О-гликозидной связи (Petrovskis et al., 1986).
Также как и gB, гликопротеин gD относится к мембранным белкам 1-го типа. На N-конце гликопротеина gD имеется сигнальный пептид размером в 18 аминокислот, который отрезается в процессе трансляции белка. Гидрофобный трансмембранный домен локализован между 355 и 378 аминокислотными остатками последовательности gD ВБА (Petrovskis et al., 1986) и ответственен за связывание gD с мембраной.
Хотя gD ВПГ-1 и gD ВБА имеют определенную гомологию, у них гликозилирование существенно отличается. У gD ВПГ-1 имеется как N-, так и О-гликозилирование (Cohen et al., 1983; Johnson et al., 1983), в то время как у gD ВБА обнаружено только О-гликозилирование (Petrovskis et al., 1986).
Трехметная структура gD ВПГ-1 (укороченный вариант gD без трансмембранного домена), определенная с помощью электронной микроскопии, показала, что gD ВПГ-1 существует в растворе в виде тетрамера (Pilling et al., 1999).
Показано, что gD ВБА, также как и остальные гликопротеины ВБА, в процессе созревания экспрессируется на мембране инфицированной клетки (Mettenleiter, 2000; Favoreel et al., 1999; Mettenleiter, 1999) и затем интернализуется клетками. Роль данного процесса в созревании вируса не определена. На гликопротеине gD ВБА в цитоплазматическом домене идентифицирована последовательность YRLL, обеспечивающая спонтанный эндоцитоз гликопротеина с клеточной поверхности (Ficinska et al., 2005). Установлено, что взаимодействие мембранно-связанного gD с антителами способствует интернализации комплексов gD-антитело (Favoreel et al., 1999).
Определение титра инфекционности вируса ВБА
В работе использовали адъюванты Фрейнда (полный и неполный) (Calbiochem), среды ДМЕМ и RPMI-1640, раствор Хенкса, раствор версена, раствор Трипсина производства ФГУП Института полиомиелита и вирусных энцефалитов (Россия). Эмбриональная сыворотка коров (ЭБС) была производства HyClone, сыворотка КРС была отечественного производства (Фуро). Радиоактивно-меченый по сере метионин ([ -метионин) (уд. активность 74 ПБк/моль) был отечественного производства (ГНЦ РФ ФЭИ, Обнинск). Использовали следующие смолы для хроматографии и носители: ДЭАЭoyopearl 65ОМ (Toyo-Soda), Сефароза CL-6B, Конканавалин А-Сефароза, гепарин-Сефароза, Сефадекс G-25 (Amersham).
В работе пользовались иммунохимическими реагентами собственного изготовления (антивидовые конъюгаты, ПАП-система, мостиковые антитела и др.) и иммунохимическими реагентами производства фирм Sigma, Santa Cruz, USBiological, Serotec.
Для культивирования клеток использовали пластиковую посуду (матрасы, 96-, 24-, 12-луночные планшеты, чашки Петри, пипетки) фирм «Nunc», «Costar» и «Sarstedt». Для иммунохимических реакций использовали 96-луночные планшеты «Sarstedt» и «Corning». Для электропереноса белков использовали 0,45 мкм нитроцеллюлозные мембраны и PVDF мембраны производства фирм Millipore и BioRad. Одноразовые шприцы были отечественного производства.
Использованные в работе щелочи и кислоты, этиловый спирт, формальдегид, были отечественного производства, с качеством осч или хч.
Все остальные химические реактивы, ферменты, белки, гепарин, добавки к средам приобретали в фирме Sigma или Fluka.
В работе использовали следующие сыворотки свиней: 1) сыворотки от невакцинированных неинфицированных свиней; 2) сыворотки от неинфицированных свиней, вакцинированных против вирусных заболеваний (классическая чума, парвовирусная болезнь, энзоотический энцефаломиелит); 3) сыворотки от неинфицированных свиней, вакцинированных живой gE-негативной вакциной Bartha К61 против БА; 4) сыворотки от неинфицированных свиней, вакцинированных инактивированной gE-негативной вакциной против БА; 5) сыворотки от инфицированных невакцинированных свиней; 6) сыворотки от инфицированных свиней, вакцинированных gE-негативными вакцинами против БА. Сыворотки были получены из коллекций Института ветеринарной медицины УААН (Киев, Украина), Центрального ветеринарного института (Будапешт, Венгрия) и Национального ветеринарного исследовательского института (Пулава, Польша).
Все используемые в работе сыворотки свиней исследовали на присутствие gE- и gB-специфических антител с помощью коммерческих gE-ELISA ВБА и gB-ELISA ВБА (IDEXX и Svanova Biotech, соответственно), которые рассматривали в качестве референтных тестов («золотые стандарты») и с помощью которых делали заключение о статусе сыворотки.
В работе также использовали сыворотки от лабораторных животных (мыши Balb/c, кролики Шиншилла), иммунизированных очищенными вирионами ВБА и аффинно-очищенными гликопротеинами gB или gD. Животных иммунизировали посредством подкожных инъекций антигенной эмульсии в объеме 1 мл/кролика или 0,4 мл/мышь. Иммунизирующая доза по вирусу (штамм «К») - 1010 ТЦД5о (до инактивации). Иммунизирующая доза по гликопротеинам gD, gB и gE - 10 мкг. Очистка и инактивация вируса описаны в разделах 2.6. Очистка гликопротеинов gD и gB описана в разделе 2.16. При первой иммунизации антигены эмульгировали в полном адъюванте Фрейнда: при повторных иммунизациях антигены эмульгировали в неполном адъюванте Фрейнда. Животных иммунизировали 2-4 раза с интервалом между иммунизациями в 2 недели. Кровь от животных отбирали через 14 дней после последней иммунизации и получали сыворотки стандартным способом.
Моноклональные антитела к гликопротеину gD ВБА Ь51-с5-1,4b-lcl 1 и с14-с27, направленные к gD ВБА, любезно предоставил доктор Т. Меттенлейтер (Дюссельдофский Университет, Германия).
В работе применяли монослойные культуры клеток ВНК- (фибробласты почки сирийского хомяка), Vero (фибробласты почки африканской зеленой мартышки), MDBK (фибробласты почки быка), а также клетки мышиной миеломы NS0 из коллекции клеточных культур Института биофизики клетки РАН. Клетки ВНК-21, MDBK культивировали в среде ДМЕМ (среда Игла в модификации Дальбекко), содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота (КРС). Клетки Vero и NS0 культивировали в среде ДМЕМ или RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС).
В работе использовали следующие штаммы ВБА: лабораторные штаммы ВБА (Ка, Phylaxia, К, BUK 628, Арский и ВГНКИ), вакцинные штаммы (Bartha К61, NIA-4, Begonia и 77/3) и 10 неохарактеризованных полевых изолятов ВБА. Вирусные штаммы были получены из коллекций Ветеринарного Медицинского Института (Будапешт, Венгрия) и Института ветеринарной медицины УААН (Киев, Украина). Все используемые штаммы ВБА соответствовали типовым характеристикам.
Вирусы культивировали на клетках ВНК-21. Для этого, клетки ВНК-21 выращивали до состояния монослоя, заливали поддерживающую среду без сыворотки и заражали вирусом с множественностью инфекции 1-5 ТЦДзо/клетку. Клетки инкубировали при 37С до максимального проявления цитопатического эффекта (2-3 суток). Культуральную среду, содержащую вирус, собирали и хранили при +4С или замораживали при -20С для длительного хранения.
Получение gD- и gB-специфических моноклональных антител и разработка методов иммуноаффинной очистки гликопротеинов
Основным требованием при получении репрезентативной панели мкАТ к гликопротеину gD ВБА явилось обеспечение максимального разнообразия антител и отсутствие направленного отбора мкАТ, обладающих специфическими характеристиками (например, реактивностью с денатурированными антигенами и т.д.). Получение гибридомных клонов, продуцирующих антитела к ВБА-специфическим белкам, детально описано в главе «Материалы и методы». С целью увеличения разнообразия ВБА-специфических мкАТ было проведено несколько независимых иммунизации мышей линии BALB/c вирусом и гликопротеином gD ВБА и слияний лимфоцитов иммунных мышей с миеломными клетками. На начальном этапе работы, для иммунизации использовали штамм «К» ВБА. Очищенный вирусный антиген инактивировали формальдегидом. На втором этапе работы для иммунизации использовали аффинно-очищенный нативный гликопротеин gD ВБА.
Выявление вирус-специфических мкАТ в культуральных жидкостях гибридом проводили методом иммунопероксидазного окрашивания клеток, а также с помощью непрямого ИФА, как описано в главе «Материалы и методы».
При иммунизации мышей цельным инактивированным вирусом было получено и охарактеризовано более 80 гибридомных клонов, продуцирующих мкАТ против белков ВБА. Среди ВБА-специфических мкАТ было отобрано и охарактеризовано антитело 42/11, которое обладало следующими характеристиками. мкАТ 42/11 окрашивало в иммунопероксидазном методе клетки, инфицированные вирусными штаммами Ка, К, Bartha К61 и NIA-4. Антитело реагировало с вирусным белком, который локализовался в вирусной оболочке, так как переходил в растворенную форму после обработки вирусного препарата 1% неионным детергентом тритон Х-100 (локализовался в надосадочной фракции препарата, центрифугированного при 100000 g в течение 2 ч). Антиген связывался на конканавалин А-сефарозе и специфически элюировался с аффинного сорбента метил-a-D-маннопиранозидом. Это свидетельствовало о гликопротеиновой природе антигена, с которым реагировало мкАТ 42/11. В иммуноблоттинге, антитело выявляло белковую полосу с молекулярной массой 50-55 кДа после электрофореза белков ВБА в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях (см. рис. 5 (б)). мкАТ 42/11 иммунопреципитировало гликопротеин ВБА, меченый [3э8]-метионином, имеющий молекулярную массу 50-55 кДа в восстанавливающих (Рис. 4) и обладало мощной вирус-нейтрализующей активностью. С учетом литературных данных (Petrovskis et аі., 1986; Wathen and Wathen, 1986; Wathen et al., 1985), полученные совокупные результаты позволили предположить, что мкАТ 42/11 было направлено к гликопротеину gD ВБА. Этот вывод позднее был подтвержден в экспериментах по конкуренции мкАТ с мкАТ Ь51-с5-1, полученным в другой лаборатории (см. главу 6.1.)
Антитело 42/11 очистили и ковалентно иммобилизовали на сефарозе CL-6B. С использованием полученного иммуносорбента гликопротеин gD очищали с помощью аффинной хроматографии. Очищенный гликопротеин gD использовали для иммунизации мышей и последующего получения гибридом к данному белку. В результате, было получено 11 дополнительных мкАТ, специфичных к гликопротеину gD ВБА. Два из полученных антител, также как и мкАТ 42/11, реагировали с вирусным белком с молекулярной массой 50-55 кДа после электрофореза белков ВБА в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях (данные не приведены). Антитела иммунопреципитировали белок ВБА, меченый SJ-метионином, имеющий молекулярную массу 50-55 кДа. Кроме этого, отдельные полученные антитела конкурировали с gD-специфическими антителами, полученным и охарактеризованными в других лабораториях (см. главу 6.1.).
С учетом литературных данных (Petrovskis et al., 1986; Wathen and Wathen, 1986; Wathen et al., 1985), полученные совокупные результаты позволили заключить, что нами была получена панель мкАТ, специфичных к гликопротеину gD ВБА.
Похожие диссертации на Гликопротеины gB и gD вируса болезни Ауески: взаимодействие с плазматическими мембранами клеток и роль в индукции противовирусного иммунитета
