Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Биологические и антигенные свойства.ВБА 6
1.2. Структура вириона ВБА 9
1.3. Репродукция ВБА 14
1.4. Генетический состав вирусной популяции 20
2. Материалы 28
3. Результаты исследований
3.1. Рестрикционный анализ вирусной ДНК вакцинного и вирулентного, штаммов ВБА 38
3.2. Изучение вирусспещГфических белков вакцинных и вирулентных штаммов ВБА 44
3.3. Анализ структурных белков вакцинного и вирулентного штаммов ВБА 52
4. Обсуждение результатов 59
5. Заключение 73
Выводы 75
Литература . 78
- Биологические и антигенные свойства.ВБА
- Генетический состав вирусной популяции
- Рестрикционный анализ вирусной ДНК вакцинного и вирулентного, штаммов ВБА
- Анализ структурных белков вакцинного и вирулентного штаммов ВБА
Введение к работе
Актуальность проблемы. Болезнь Ауески (Herpesvirus suis) продолжает оставаться одной из распространенных инфекций сельскохозяйственных и домашних животных, пушных зверей и грызунов, нанося большой экономический ущерб животноводетву и, особенно, свиноводству (Никитин М.Г., 1966; Сюрин В.Н., Фомина Н.В., 1979; Татаров Г., 1978; Borgen H.G.,Bendixen H.I., 1967? Stear R.L., 1978; Muirhead M.R., 1978; May г A., 1984).
Существование постоянной угрозы возникновения и быстрого распространения, наличие длительного врірусоносительст-ва у переболевших животных, а также использование живых вирусных вакцин в целях борьбы и профилактики с этой инфекцией вызвало необходимость разработки эффективных и быстрых средств идентификации и дифференциации вакцинных и вирулентных штаммов вируса, так как они не имеют между собой надежных различий ни в биологическом построении, ни по серотипам,
несмотря на разнообразные биологические маркеры (Bartha А., 1969; Kaplan A.S.,I969; bloyd G., Baskervilli A., 1978; Toma. в# et al, 1979? Piatt K.B.,Mare C.I» ,HInz P.H., 1979, 980; colais P.,Sabo S., 1982).
Существенное значение в решении этих задач призваны сыграть исследования по изучению молекулярной биологии вируса болезни Ауески (ВБА).
В литературе не было обнаружено работ, посвященных систематическому изучению макромолекул вакцинных и вирулентных штаммоЕ ВБА, Исследования в этой области способствовали бы
разработке более эффективных методов меіштаммовой дифференциации возбудителя, а также пониманию механизмов приспособления вирусов к варьирующим условиям репродукции в организме различных хозяев и такого важнейшего свойства нак вирулентность ВБА. Такое исследование штаммов вируса важно и в теоретическом плане изучения причин многообразия и путей эволюции герпесвирусов.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилась разработка методов дифференциации вакцинных и вирулентных штаммов ВБА на основе изучения их вирусспецифических макромолекул.
В задачи данного исследования входило:
Выявить, есть ли различия в продуктах реетринциоиного гидролиза вирусной ДНК между вакцинным и вирулентным штаїшами вируса.
Определить, имеется ли разница по составу вирусспецифических белков у вакцинных и вирулентных штаммов вируса.
Отработать метод получения концентрированных суспензий очищенного вируса и провести анализ структурных белков вакцинного и вирулентного штаммов вируса.
Научная новизна. Впервые установлено., что штаммы ВБА (вакцинные - ГНКИ, БУК-628 и вирулентные - Арский, "К", Эмбриональный), циркулирующие на. территории нашей страны, четко различаются между собой по белковому профилю. Выявлена также разница между вакцинным и вирулентным штаїшами и по продуктам гидролиза вирусной ДНК рестриктирующими эндонуклеа-зами. Показано, что при аттенуации вирулентного штамма Эмбриональный ВБА до степени вакцинного (штамм ГНКИ) произошли из-
..-5-. менения в структуре его ДНК и в составе белкового профиля.
Практическая ценность. На основе результатов исследовав ний разработано и опубликовано "Методическое указание по изучению шташошх различий вируса болезни Ауески с помощью электрофоретического анализа белкового профиля и рестрикти-рующих эндонуклеаз" (КВЙ,1985 г.) и получено удостоверение на рационализаторское предложение (КВИ,Казань, 1984 г.). Предлагается метод очистки и концентрирования ВБА, основное содержание которого представлено в опубликованных "Методических рекомендациях по получению очищенных, высокоочищенных и концентрированных препаратов некоторых ДНК-содержащих вирусов (оспы коз, оспы овец, оспы птиц и болезни Ауески)" (ВАСХНИЛ, 1984 г.) и получено удостоверение на рационализаторское предложение отраслевого значение (1985 г.).
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на У.и У1 конференциях молодых ученых ВГНКЙ (Москва, 1983,1984 тт,)9 на совместном заседании научных сотрудников лабораторий биофизики, биохимии, вирусологии, иммунологии и аэрозолей КВИ (Казань, 1984).
Публикация. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на SS страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав собствен ных исследований, обсуждения результатов, заключения, выюдов практических предложений и списка литературы, включающего 170 источников, в том числе 130 зарубежных. Диссертация содержит 8 рисунков и 5 таблиц.
- б -
Биологические и антигенные свойства.ВБА
Вирус болезни Ауески (ВБА) относится к семейству герпес вирусов ( Негреtoviridae ), которое насчитывает окодо 70 представителей ( Honess R.,Watson D., 1977; Matthews R., 1979, 1982. Roi2man B# I98Ij I985 )# Вирионы ВБА представляют собой сферические чатицы диаметром 180-190 нм с молекулярной массой 1000 МД и состоят из 3-х основных частей: нуклеоида , капсида и поверхностной оболочки. Капсид вирио-на в форме икосаэдра построен из 162 субъединиц, уложенных с симметрией 5:3:2. Каждая субъединица шестигранной формы диаметром 9 и длиной 12 нм. Центр субъединицы имеет полость диаметром 4 нм. Основания всех субъединиц морфологически связаны между собой ( Roizman В., Spear Р., 1973).
В отличие от других представителей рода герпес, обладающих узкой видовой специфичностью, ВБА способен вызывать заболевания у многих видов животных (Камалов Г.Х., Сюрин В.Н 1964; Быковсний А.Ф. с соавт., 1964; Базылев П.М., Прохорова Э.М., 1966; Kaplan А., 1969).
Основным природным хозяином-носителем ВБА является свинья. К экспериментальному заражению чувствительны белые крысы, молодые белые мыши и особенно кролики. Переболевшие животные длительное время ЯЕЛЯЮТСЯ виру-соносителями, несмотря на наличие антител (БаЪо А#,1969; Gutekunst D.,I979, Beran є ЦІ980;Моск є а,І98І). При болезни Ауески достаточно четко выражены различия иммунореактивности, обусловленные видом животных. Вирус хорошо размножается в первичных, культурах клеток фибробластов эмбрионов кур, почек поросенка, фибробластов мыши (Albrecht P.,Blaskovic J. et al, 1963; Singh K.V., 1962; Scherer w. et al, 1953) и в перевиваемых культурах клеток почек зеленой африканской мартышки ( Yero ), почек кролика, эмбриона свиньи, собаки, ягненка, Heia ( scherer W.F., Sinrerton, 1954; Kaplan A.S., Tatter, 1959; Singh К., 1962; Aurelian L.,Rozraan В., 1964; Ceccarelli A., Mazza J., 1958) с образованием цитопатического эффекта (Тонева В., 1958; Kaplan A.S.,Vatter A., 1959; Skoda R., 1961; Skoda R., Zuffa A., 1962; Zuffa-A., 1965; Hamada C, 1966). Многократное пассирование ВБА на кроликах не ослабляет его вирулентности. Между тем, пассирование на других животных, куриных эмбрионах и культуре клеток часто ведет к атте-нуации вируса до степени вакцинного штамма. Это подтверждает ся данными Тоневой В. (1962) по серийному пассированию штамма 117 ВБА на голубях и мышах; Skoda R.,Zuffa А.(1962) ш получению вакцинного штамма БУК; Прохоровой Э.М. (1971) при получении аттенуированного штамма ГНКИ путем перемежающихся пассажей в эмбрионах кур и культуре клеток фибробластов эмбрионов кур. Геммаглютинирующими свойствами вирус не обладает, вызывает образование комплемент связывающих, вируснейтрализующих и преципитирующих антител. Против болезни Ауески предложено много вариантов вакцин (Eayr А., 1984). Г,ивые вакцины создают более продолжительный и более полноценный по набору антител и по характеру реакций организма иммунитет. При введении живой вакцины тем же путем, каким проникает естественная инфекция, у вакцинированных формируется не только общий, но и выраженный регионарный иммунитет. Вместе с тем имеются и некоторые особенности живых вакцин, которые не позволяют сделать однозначный выбор в пользу этих препаратов. К числу таких особенностей прежде всего относятся возникшая необходимость разработки эффективных средств дифференциации вакцинных штаммов от полевых изолятов, возможность контаминации вакцинного материала посторонними вирусами и другими агентами, содержащимися в субстрате культивирования ( каріап і..,1969; Toma B»,Brun A.,є a, 1979 ; Сергеев В.А., Орлянкин Б.Г., 1983; Пшеничнов В.А., Воробьев А.А., Балаева Н.М., 1976; Тихоненко Т.Н., 1983). Кроме того, использование живых вакцин связано с введением вирусных нуклеиновых кислот, т.е. чужеродного генетического материала, В ряде случаев при высокой врожденной индивидуальной чувствительности и стрессовых реакциях, ведущих к изменению реактивности организма, аттенуированные вирусы могуя приводить к возникновению вакцинальных осложнений. Так, отмечено, что жиЕые вакцины отрицательно влияют на развитие плодов у вакцинированных свиноматок (Зуева Н.Я., 1979; Tuhaci J., Bran L», l975j Delaquean J#, boqueris , 1975)» Вакцинированные свиньи, несмотря на высокий уровень антител и клиническую инертность при заражении, являются вирусоносителями в течение 3-х месяцев после введения вирулентного вируса ( Gutekunst D.E., 1979; Mock R., Crandell R., Mesfin G.-, 1981), По гашуногенности инактивированные вакцины с масляным адъювантом не уступают живым вакцинам, вызывая образование вируснейтрализующих антител в высоком титре, и защищают кроликов и поросят при экспериментальном заражении ( тота в., Delaquean J., 1975; Prescura p., Vivoll P., Cardaras, 1977) К числу преимуществ инактивированных Еакцин относятся возможность использования поливалентных вакцин, стабильность, безопасность, быстрота изготовления. К числу перспективных направлений в иммунопрофилакти ке инфекционных заболеваний относят исследования по разра ботке очищенных иммуногенных фракций возбудителей, позволяю щих свести до минимума или исключить из вакцинных препара тов неблагоприятно действующие компоненты (Горшунова Л.П., 1977; Тихоненко Т.И., 1983; Zhdanov Y.M. et el, I978;Cha nock R# i982r Apron R» et al, 1983 ) Это так назы ваемые расщепленные ( split ) и субъединичные вакцины, содержащие лишь антиген. Сравнительно недавно приготовлена вакцина из субъединиц вириона ВБА, которая после двухкратного введения вызывала образование нейтрализующих антител в высоком титре и защищала всех мышей при контрольном заражении (Rock D.L., Reed D.E»» 1980).
Генетический состав вирусной популяции
Вирусы в процессе своего онтогенетического цикла проходят две различных фенотипических фазы: вегетативную и фазу вирусных частиц ( вириона). Вегетативная фаза рассматривается как онтогенетически зрелая фаза вируса, в которой молекулярные компоненты вируса распределены по клетке-хозяину. В этой фазе вирус обнаруживает основные физиологические свойства других организмов: метаболизм, рост, репродукцию, наследственность и изменчивость. Вирионр. второй фазы онтогенеза рассматриваются как "споры", обладающие сюйствами живого
только в потенциале (Альтштейн А.Д., Каверин Н.В., 1980; Bandea сіа іп, 1985).
При любом инфекционном процессе, вызываемом вирусами, обычно имеют дело с популяцией вируса (Канторович-Прокудина Е.Н., Іданов В.И., 1976). Специфика вирусных популяций определяется высокой численностью, быстрой сменой поколений, гаплоидностью и бесполым способом размножения, малой емкостью генома, непрерывностью во времени эпидемического процесса.
Совокупность всех генов, имеющихся у данной популяции вируса, представляет собой генофонд популяции. Содержащаяся в геноме наследственная информация обеспечивает воспроизводство вируса, а генотипическое разнообразив, представленное в генофонде, позволяет вирусам приспосабливаться и выживать в изменяющихся внешних условиях. Генофонд вирусных,популяций создается и пополняется из нескольких источников: мутаций, рекомбинаций, включения в вирусный геном генетического материала хозяина и потока генов (Цилинский Я.Я.,Львов Д.К., 1977; Инге-Вечтомов С.Г., Сойдла Т.Р., 1978; Еданов В.М., Львов Д.К., 1984).
За счет мутаций в вирусной популяции создается огромный резерв изменчивости. Сущность мутационных изменений заключается в нарушении генетического кода. При этом возможны замены, выпадения (делеции), вставки, перестановки нуклеоти-дов или их пар в одно- и двуспиральных молекулах нуклеиновой кислоты (Мёллер Г,Г., 1968; Цилинский Я.Я., Льюв Д.К.,1977; Инге-Вечтомов С.Г., 1983). Эти нарушения могут ограничиваться отдельными нуклеотидами или же распространяться на более или менее значительные участки генетической последовательности. Нутационный процесс является сложным многокомпонентным явлением. Важную роль в происхождении мутаций, помимо первичного повреждения генетического материала, играют процессы его репликации и репарации. Установлено, что частота возникновения мутаций у вирусов может изменяться в зависимости от стадии репродукции, а возможность реализации предмутацион-ных повреждений определяется клеткой-хозяина (Лобашев М.Е., 1976; Цилинский Я.Я., Львов Д.К., 1977). Различают спонтанные и индуцированные мутации. Спонтанные мутации возникают в природе при воздействии на генетический материал различных естественных факторов. В результате спонтанных мутаций в естественных условиях в ряде случаев образуются аттенуированные варианты возбудителя. Так, Генов и Йорданов X. (1964) выделили от клинически здоровых свиней аттенуированный в естественных условиях вариант ВБА, названный штаммом "Русе". По мнению Watson I,,Crick P. (1953) спонтанные мутации могут возникать вследствие таутомерного превращения оснований, входящих в состав ДНК. Конкретные же причины спонтанных мутаций чаще всего остаются невыясненными (Лучник А.Н. 1978; Muzuczka N., Poland R«, Bessman M., 1978)« Индуцированные мутации вызываются в эксперименте определенным мутагенным агентом. Принципиальной разницы в сущности мутационной перестройки при спонтанных и индуцированных мутациях нет. Считается, что использующиеся в лаборатории мутагены не индуцируют новых мутаций, а увеличивают частоту тех или иных спонтанных мутаций (Серебровский А.С., Дубинин Н.П., 1968; Цилинский Я.Я., Львов Д.К., 1977; Ауербах Ш., 1978). По изменению генотипа мутации вирусов позвоночных разделяют на генные или точечные, т.е. мутации, локализующиеся в индивидуальных генах, и мутации, занимающие более обширные участки генома. Примером точечных мутаций могут служить многие ts-мутанты (Владыко Г.В., Цилинский Я.Я., 1979; Frost Е-,Williams I., 1978; Ladin B.,Ihara, Hampl Hi 1982), Использование рестриктирующих эндонуклеаз позволило выделить обширную новую группу мутантов ДНК-содеряащих вирусов и определить молекулярную природу мутаций (Поляновский О.Л., Носиков В.В., 1978). Это относится к жизнеспособным делеционным мутантам. Так, например, Мс padder, Dales L., (1979) изучили группу делециоиных мутантов вируса вакцины и установили, что размер делеции не превышал 250 пар нуклеотидов. Были также обнаружены как единичные делении, так УС двойные выпадения, расположенные в протиюположных концах генома . Мутанты, характеризующиеся повреждением значительных участков генома, у вирусов представлены ДИ-частицами. Эти частицы по природе мутационного дефекта являются делеционны-ми, а по фенотипическому проявлению - летальными мутантами. ДИ-частицы образуются в вирусных популяциях спонтанно. Этот спонтанный фон значительно возрастает при изменении условий культивирования вируса. Из таких условий наиболее известны повышение множественности инфекции (феномен фон Магнуса). Ди-частицы играют существенную роль в поддержании пер систенции вируса in vitro и in vivo , специфически препятст вуя репродукции стандартного вируса (Ben-Porat T.et аз.,1976). По данным Stark С,Kennedy S. (1978) ДМ-частицы вируса лесов Семлики конкурируют с полным вирусом за РНК-полимера-зу и имеют при этом селективные преимущества. Молекулы РНК ДИ-частиц обладают способностью к более быстрой инициации трансляции, чем РНК полного вируса. В результате репликация РНК ДИ-частиц опережает репликацию стандартных вирионннх РНК и выход ДИ-частиц преобладает над выходом полного вируса.
Рестрикционный анализ вирусной ДНК вакцинного и вирулентного, штаммов ВБА
О целостности вирусных частиц в очищенном препарате и отсутствии посторонних примесей судили по данным электронной микроскопии. Электронно-микроскопические препараты концентрированного, и очищенного вируса готовили по методу Степанова (1962). Для этого, на поверхность воды, подогретой до 45-50, помещали алюминиевую фольгу, покрытую воском; на фольгу наносили каплю исследуемой вирусной суспензии и помещали на нее электронно-микроскопическую сетку подложной к капле. Благодаря усиливающемуся броуновскому движению частиц в подогреваемом через фольгу содержимом капли, вирус полнее и лучше прикрепляется к пленке-подложке. Через 3 мин сетку снимали и подсушивали. Полученные препараты контрастировали 2/-ным раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты и просматривали в электронном микроскопе " Hitachi-I2 " при инструментальном увеличении 200000,
Вирусную ДНК выделяли из зараженных клеток путем селективной экстракции по методу Сенкевича и Гибадуллина (1982), Для этого культуру.клеток инфицировали с множественностью не более одной вирусной частицы на клетку и после достижения полного цитопатического эффекта (приблизительно через 36-48 часов после инфицирования) клетки снимали со стекла механическим способом и осаждали на центрифуге "Beckman L5-65" при 4 тыс .об/мин, комнатной температуре в течение 20 мин. Полученный осадок pecyenендировали в лизирующем буфере, содержащем 10 мМ трис-HCl, рН 8,0; 20 мМ ЭДГА; 1% тритон хЮО.
После инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре к суспензии добавляли Ж УаС1 до конечной концентрации 0,251! и оставляли на ночь при 4, Полученный лизат клеток подвергали центрифугированию при 15 тыс,об/мин, 4 в теиение 1 часа. Полученный осадок отбрасывали, а надосадочную жидкость обрабатывали в течение 1 часа при 37 смесью панкреатической РНК-азы и РНК-азы ТІ (соответственно 250 и 100 мкг/мл), потом еще в течение 1 часа при 37 смесью проназы и протеинкиназы К (соответственно 1 мг/мл и 100 мкг/мл) без ДСН. После чего, к полученной смеси добавляли ДСН до конечной концентрации 0,5%, равный объем водонасыщенного фенола (рН 8,0), осторожно перемешивали в течение 10 мин и центрифугировали при 5 тыс. об/мин, 4 Е течение 20 мин. В результате центрифугирования вспробирке образовывалось 3 слоя: нижний - фенольний, верхний - водный,содержащий ДНК, и интерфава, в состав которой входил денатурированный вирусный белок. Водную фазу осторожно отбирали, вновь смешивали с равным объемом водонасыщенного фенола и подвергали центрифугированию при тех же режимах. Эту процедуру повторяли до тех пор, пока не исчезала интерфаза. Затем к водной фазе, содержащей ДНК, добавляли двойной объем 96 этанола, 1/10 часть объема ЭИ ацетата натрия и осторожно перемешивали. Полученную, слегка опалесци-рующую смесь, помещали на несколько часов на -20, после чего вновь подвергали центрифугированию при 14 тыс.об/мин, 4 в течение 1 часа. Надосадок сливали, а осадок промывали 70 этанолом, растворяли в дистиллированной воде и вновь подвергали депротеинизации водонасыщенным фенолом, дважды переосаждали 96 этанолом, промывали 70 этанолом, высушивали под вакуумом в течение 5 мин, а затем растворяли в дистиллированной воде.
Гомогенность препарата контролировали электрофоретичес-ки в 1%-ном агарозном геле. Вирусную ДНК подвергали гидролизу рестриктазами EcoR Уи Sal . Для этого смесь, содержащую 10 мкл исследуемой вирусной ДНК с концентрацией 1 мкг, 7 мкл дистиллированной воды, 2 мкл 0,089 И трис-боратного буфера (рН 8,0) с 0,02 М ЭДТА, 1 мкл фермента (рестриктазы), 0,01% бромфенолового синего инкубировали в течение 1 часа при 37.
Анализ вирусной ДНК и продуктов реетрикциоиного гидролиза проводили с помощью пластинчатого электрофореза в 0 ,7% агарозном геле. Двухкамерный горизонтальный аппарат, изготовленный в лаборатории, позволял одновременно анализировать 10 проб. Агарозу, растворенную в 0,089 У трис-боратном буфере (рН 8,0) (он же был и электродным) полимеризовали на стеклянной пластине размером 15x18 см, предварительно установив над ней (перпендикулярно к ее плоскости) гребенку и с ее помощью при заливке агарозы формировали колодцы с фиксированным объемом 30 мкл для внесения препаратов ДНК.
Препараты ДНК (10 мкл исследуемой ДНК с концентрацией 1-Ю мкг и 10 мкл бромфенолового синего) и пробы, содержащие рестрикты (состав описан выше) объемом 20 мкл вносили в колодцы геля и подвергали электрофорезу при комнатной температуре и напряжении 50 В (от - к +) в течение 5-6 часов (до тех пор, пока бромфеноловый синий не выходил из геля). При подготовке к электрофоретическому фракционированию очищенный вирус, меченый материал и стандартные белки с известной молекулярной массой растюряли в диссоциирующем буфере, содержащем 2% ДСН; 5% 2-меркаптоэтанола; 0,05 М трис, рН 7,0; 3% глицерина; 5 мг/мл Сэромфенолового синего, прогревали в течение 3 мин в кипящей водяной бане и быстро охлаждали. При фракционировании белков использовали метод пластин чатого электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) с ДСН по Laemmli (1970) В модификации Spear, Roizman (1972). Двухкамерный вертикальный аппарат, изготовленный в лаборатории, позволял одновременно анализировать 22 пробы. Стеклянные пластины камер обрабатывали 96 этанолом. Размеры раз делящего геля -.250 х 220 х 1,5 мм. С помощью гребенки в концентрирующем геле формировали 16 лунок, размером 10x5x15 мм, в которые вносили фракционируемые образцы. Концентрирующий гель высотой 20 мм содержал.5% акрила-мида на 0,125 М трис-HCl, рН 6,8; 0,1% ДСН. В качестве сшивающего агента использовали диаллилтартардиамид (ДАТД). Разделяющий гель высотой 250 мм включал 13,6% акрилами-да на 0,375 М трис-НС1,рН 8,8; 0,1% ДСН и 1,2% (масса/объем) ДАТД, В качестве катализаторов использовали персульфат аммония и тетраметилэтилендиамид (ТйОД). Злектродный буфер содержал 16,3% трис-НС1; 78,3% глицина; 5,4% ДСН, рН 8,0.
Анализ структурных белков вакцинного и вирулентного штаммов ВБА
При дифференциации штаммов вируса с помощью эндонук-леаз рестрикции непосредственно анализируют геном вируса, что исключает антигенные помехи, обусловленные клеткой-хозяином . Rolzman B.,Togron Mauro (1983) показали, ЧТО метод идентификации изолятов вируса простого герпеса (ВПГ) по их рестрикционным картам является более эффективным, чем иммунологические методы с использованием моноклональных антител Oirschot J. т. van GIelkens АЛ,. J. (1984) при изучении характеристик 4-х аттенуированных вакцинных штаммов ВБА и одного вирулентного установили, что аттенуированные штаммы можно отличить от дикого изучением их вирулентности на мышах или по способности к индукции тимидинкиназы, однако только при использовании рестрикциоиного анализа вирусной ДНК можно было полностью дифференцировать Еакцинные и дикий штаммы вируса. Kil patrick В «A., Huang E.S. and Pagano j.S. (1976) по " назано, что фермент EcoR і расщепляет ДНК цитомегаловирусов на 20-30 фрагментов, в зависимости от типа вируса, вируса простого герпеса 1 типа на 12 фрагментов, 2 типа - на 14 (Hayv/ard G.., 19752 Skare J.,Summers W.P.,Summers W.G., 1975)» He говоря о количестве фрагментов, в случае цитомегал ловирусов и вирусов простого герпеса, сходства в спектре мо лекулярных масс фрагментов нет. В тоже время, при сравнении продуктов гидролиза ДНК ВПГ 1 типа и ВПГ 2 типа некоторое сходство обнаруживается. В обоих продуктах имеются группы "тесно" двигающихся фрагментов с молекулярными массами от до 9 млн.дальтон, и группы "редко" двигающихся фрагментов с молекулярными массами от 5 до 1,5 млн.дальтон. Напоминаем, что ВПГ 1 типа и ВПГ 2 типа весьма близки друг другу по ряду показателей: антигенное родство, значительное количество гомологичных последовательностей нуклеотидов в ДНК и прочее (Honess R.W., v/atson D.H., 1977). Выше упомянутое сходство расположения фрагментов ДНК в геле имеет относительный характер, тем более, что даже внутри одного серотипа ВПГ имеются штаммовне различия в продуктах рестрикционного гидролиза ДНК.
Изучение же белкового профиля вакцинных и вирулентных штаммов вируса с помощью электрофоретического анализа в ПААГ может способствовать выяснению функциональной роли отдельных белков и их групп в инфекционном процессе.
Не ставя задачу всестороннего исследования молекулярной биологии и биохимии штаммов ВБА, мы попытались на основе изучения вирусспецифических макромолекул вакцинных и вирулентных штаммов вируса выявить различия между ними.
С этой целью был проведен анализ рестрикционного расщепления вирусной ДНК вакцинного и вирулентного штаммов вируса; исследованы вирусспецифические белки вакцинных и вирулентных штаммов вируса; отработана методика концентрирования и очистки вируса и дана сравнительная оценка структурных белков вакцинного и вирулентного штаммов вируса.
Для изучения строения генома ВБА необходимо иметь препаративные количества чистой и нативной вирусной ДНК. Выделять ее можно из вируса или из зараженных клеток. Мы выбрали второй вариант, так как титр внеклеточного вируса недостаточно высок и получение значительных количеств его затруднительно. С другой стороны, в процессе репликации в клетке накапливается пул молекул ДНК на порядок превышающий количество ее, входящее в состав вирусного потомства.
Основным этапом всех методов является отделение.вирусной ДНК от клеточной. Ряд авторов предпочитает использовать равновесное центрифугирование в градиенте плотности хлорида цезия (Halliburton J.W.jHIll E.A.5RUSSeii G.J., 1975)или йодида натрия (Walboomers J.M.M.j Schegget J.T., 1976), другие - седиментационное центрифугирование в градиенте плотности сахарозы (Skare J., Summers W.P., Summers W.G., 1975) или глицерина. Мы предпочли выделять вирусную ДНК путем селективной экстракции из зараженных клеток по методу Сенке-вича Т.Г. и Гибадуллина Р.А. (1982), который давал возможность получать гомогенный препарат вирусной ДНК.
Гомогенность конечного препарата вирусной ДНК была показана при помощи электрофореза в 1% ном агарозном геле (рис.1). Вирусная ДНК вирулентного штамма Эмбриональный и вак цинного штамма.ГНКИ ВБА была гидролизована двумя рестрикти рующими эндонунлеазами: EcoR V , sal . Продукты гидро лиза были фракционированы посредством горизонтального пластинчатого электрофореза в 0,7% агарозном геле (рис.2).
Распределение фрагментов.у вакцинного штамма ГНКИ и вирулентного Эмбриональный, полученных в результате гидролиза рестриктазами EcoR V и Sal г отличалось друг от друга. Так рєстриктаза EcoR v расщепляет молекулу вирусной ДНК штамма Эмбриональный на 13 фрагментов, а штамма ГНКИ - на 12. Sal соответственно на 5 и 4 фрагментов.
