Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1 Генно-инженерные векторы, используемые при создании кандидатных вакцин 12
1.1.1 Типы генно-инженерных векторов 12
1.1.2. Вирусные векторы, используемые для создания кандидатных генно-инженерных вакцин 13
1.1.3 Генно-инженерные векторы на основе аденовирусов 16
1.1.3.1 Структурно-функциональная характеристика аденовирусов человека 16
1.1.3.2 Векторы на основе генома аденовируса человека 19
1.1.3.3 Структурные особенности аденовируса птиц CELO 24
1.1.3.4 Векторы на основе генома аденовируса птиц CELO 28
1.2 Вакцинно-профилактика инфекций, вызываемых вирусом гриппа птиц и вирусом болезни Марека 31
1.2.1. Вакцины, используемые для предупреждения инфекции вируса гриппа птиц 31
1.2.2. Вакцины, используемые для предупреждения инфекции ВБМ...ЗЗ
1.2.3 Необходимость использования генно-инженерных вакцин при инфекциях вируса гриппа птиц и вируса болезни Марека 36
1.2.4. Кандидатные генно-инженерные вакцины против вируса гриппа птиц, полученные на основе вирусных векторов 40
1.2.5. Кандидатные генно-инженерные вакцины против ВБМ, полученные на основе вирусных векторов 44
2. Собственные исследования 48
2.1 Материалы и методы 48
2.1.1 Материалы 48
2.1.2. Методы 51
2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 65
2.2.1 Клонирование генов гликопротеинов gB, gE и gl из генома ВБМ и гена гемагглютинина из генома вируса гриппа H5N2 65
2.2.1.1 Клонирование генов гликопротеинов gB, gE и gl из генома ВБМ методом ПЦР 65
2.2.1.2 Клонирование полноразмерного гена гемагглютинина из генома вируса гриппа типа H5N2 методом ОТ-ПЦР 68
2.2.2 Конструирование рекомбинантных аденовирусов на основе генома CELO, несущих гены гликопротеинов gB, gE и gl ВБМ и ген гемагглютинина вируса гриппа птиц Н5 69
2.2.3 Изучение экспрессии генов гликопротеинов gB, gE и gl ВБМ и гена гемагглютинина вируса гриппа птиц рекомбинантными аденовирусами в экспериментах in vitro 73
2.2.3.1 Анализ экспрессии генов гликопротеинов ВБМ в культуре клеток, заражённых рекомбинантными аденовирусами, методом ОТ-ПЦР 73
2.2.3.2 Определение экспрессии гликопротеина gB ВБМ вирусом CELO-gB методом иммуноблоттинга в культуре заражённых клеток 75
2.2.3.3 Определение экспрессии гемагглютинина вируса гриппа птиц методом иммуноблоттинга в культуре клеток, зараженных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA 76
2.2.3.4. Определение экспрессии гена гемагглютинина НА вируса гриппа птиц штамма Н5 методом ИФА 78
2.2.4 Генетическая иммунизация рекомбинантными аденовирусами 79
2.2.4.1 Определение иммуногенности рекомбинантного гликопротеина gB ВБМ, экспрессируемого CELO-gB на цыплятах 79
2.2.4.2 Определение иммуногенности рекомбинантного гемагглютинина, экспрессируемого CELO-HA методом РТГА 82
2.2.5 Определение протективности рекомбинантного гемагглютинина, экспрессируемого CELO-HA, на лабораторных животных 83
2.2.5.1 Определение оптимального способа иммунизации мышей линии BALB/c рекомбинантным CELO-HA 83
2.2.5.2 Анализ протективности НА-специфического иммунного ответа мышей, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, с последующим заражением летальной дозой вируса гриппа птиц H5N2 86
3. Обсуждение результатов 89
Выводы 101
Список используемой литературы 102
- Структурно-функциональная характеристика аденовирусов человека
- Клонирование генов гликопротеинов gB, gE и gl из генома ВБМ и гена гемагглютинина из генома вируса гриппа H5N2
- Определение иммуногенности рекомбинантного гликопротеина gB ВБМ, экспрессируемого CELO-gB на цыплятах
- Анализ протективности НА-специфического иммунного ответа мышей, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, с последующим заражением летальной дозой вируса гриппа птиц H5N2
Введение к работе
Актуальность проблемы. На сегодняшний день для вакцинации сельскохозяйственных животных используют инактивированные и аттенуированные формы возбудителей инфекций микробного или вирусного происхождения. С целью расширения спектра защиты при вакцинации применяют поливалентные вакцины, представляющие собой смесь аттенуированных патогенов разных штаммов. Такие вакцины способны обеспечивать протективность против возбудителя инфекции на длительный период. Однако, в результате вспышек инфекций, вызванных патогеном, против которого была проведена вакцинация, выявляют «новые» более вирулентные штаммы, способные преодолевать сформированный иммунный барьер (202).
Причиной появления «новых» штаммов является генетическая вариабельность, которая может привести к существенному изменению антигенной структуры. В результате специфический иммунитет, установившийся на аттенуированную вакцину, может дать незначительную защиту или совсем её не обеспечить (8).
В связи с вышесказанным на сегодняшний день существует потребность в создании эффективной вакцины, технология получения которой позволяла бы быстрое конструирование и переориентацию производства в зависимости от возникающей опасности. Традиционные вакцины и технологии их создания во многом несовершенны и не отвечают данным требованиям. Использование генно-инженерных вакцин может обеспечить решение этой проблемы. Генно-инженерные векторы, применяемые при конструировании предполагаемых вакцин, являются хорошо изученными и имеют, как правило, быструю и эффективную схему получения (59, 123).
Одной из перспективных систем для доставки генетической информации, кодирующей гены инфекционных возбудителей, является система, основанная на аденовирусных векторах (Ад) (111, 32). Данные системы
имеют ряд преимуществ перед другими системами. Во-первых, пакующая емкость существующих векторов на основе аденовирусов позволяет доставлять генетическую информацию размером 7000-8000 п.о. Во-вторых, разработано большое количество аденовирусных векторов с измененным тропизмом, который достигается модификацией нуклеотидной последовательности структурных белков вириона (106, 130). В-третьих, разработаны быстрые и гибкие технологии получения рекомбинантных аденовирусов, позволяющие реализацию масштабного производства различных кандидатных вакцин на основе аденовирусных векторов на одной технологической линии, без ее переоборудования и изменения регламента. Вышеперечисленные свойства делают Ад векторы привлекательными для создания на их основе вакцинных препаратов нового поколения, позволяющих решать ключевые задачи микробилогии.
Аденовирусные векторы могут быть использованы для создания на их основе генно-инженерных вакцин против инфекций, вызванных вирусом гриппа птиц (ГП) и вирусом болезни Марека (ВБМ). Эти вирусы вызывают развитие острого заболевания с высокой контагиозностью и многообразием вариантов патогенетического проявлений (16). Инфекции, вызванные данными вирусами, сопровождаются высокой смертностью, что наносит значительный экономический урон сельскому хозяйству (137; 73).
В связи с этим изучение возможности использования аденовирусного вектора птиц CELO для конструирования кандидатного вакцинного препарата против потенциально опасных инфекций, вызванных вирусом болезни Марека или вирусом гриппа птиц, представляет самостоятельный научный интерес.
Цель исследования. Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, несущих гены гликопротеинов вируса болезни Марека и вируса гриппа птиц, и последующее изучение на лабораторных животных индукции специфического иммунитета в ответ на экспрессируемые
антигены.
В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи:
Клонирование гена гемагглютинина из генома вируса гриппа птиц штамма H5N2 и генов гликопротеинов gB, gE и gl из генома вируса болезни Марека штамма RB1B.
Получение рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, несущих ген гемагглютинина НА5 и гены гликопротеинов gB, gE и gl ВБМ под контролем CMV-промотора в сайте делеции несущественной области генома вектора, методом гомологичной рекомбинации в E.coli.
Изучение экспрессии целевых генов в составе рекомбинантных вирусов на основе аденовируса CELO в условиях in vitro.
Изучение индукции специфического иммунитета в ответ на экспрессию гликопротеинов вируса болезни Марека и гриппа птиц в организме лабораторных животных при генетической иммунизации рекомбинантными вирусами CELO.
Определение протективности гемагглютинин-специфического иммунного ответа у мышей, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом CELO, экспрессирующим НА5 вируса гриппа птиц штамма H5N2.
Научная новизна. Разработана эффективная технология получения рекомбинантных аденовирусов на основе CELO, основанная на гомологичной рекомбинации в E.coli.
Получен набор рекомбинантных аденовирусов: CELO-HA, несущий ген гемагглютинина вируса гриппа птиц штамма H5N2, и CELO-gB, CELO-gE, CELO-gl, несущие гены соответствующих гликопротеинов ВБМ штамма RB1B.
Показана экспрессия мРНК генов гликопротеинов gB, gE и gl ВБМ на культуре клеток, заражённых рекомбинантным аденовирусом птиц CELO, несущим соответствующий целевой ген.
Подтверждена идентичность антигенных свойств рекомбинантного гликопротеина gB, экспрессируемого вирусом CELO-gB, в сравнении с природным гликопротеином gB ВБМ штамма RB1B. Показана иммуногенность гликопротеина gB ВБМ, экспрессируемого рекомбинантным аденовирусом CELO-gB, на естественно восприимчивой для вируса болезни Марека модели птиц.
Подтверждена идентичность антигенных свойств рекомбинантного гемагглютинина, экспрессируемого вирусом CELO-HA, в сравнении с природным гемагглютинином вируса гриппа птиц штамма H5N2. Определено содержание рекомбинантного гемагглютинина НА5 в культуре клеток, заражённых рекомбинантным аденовирусом CELO-HA.
Определён оптимальный способ иммунизации лабораторных животных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, при котором экспрессируемый гемагглютинин проявляет наибольшую защиту против вирулентного вируса гриппа.
Впервые показана 95% защита мышей, иммунизированных
рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, экспрессирующим
гемагглютинин НА5, в условиях экспериментального заражения мышей летальной дозой вируса гриппа птиц H5N2 (50LDso).
Практическая значимость. Ген гемагглютинина вируса гриппа птиц штамма H5N2 и гены гликопротеинов gB, gE и gl вируса болезни Марека штамма RB1B, клонированные в плазмидном векторе pGEM-T-Easy, коллекция рекомбинантных аденовирусов: CELO-HA, CELO-gB, CELO-gE и CELO-gl, - хранятся в музее лаборатории молекулярной биотехнологии ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН).
Рекомбинантные аденовирусы CELO-gB, CELO-gE и CELO-gl, содержащие изолированные гены, кодирующие гликопротеины ВБМ, используются в эксперименте по определению их иммуногенности на
естественно восприимчивой для ВБМ модели птиц.
Рекомбинантный аденовирус CELO-HA, экспрессирующий гемагглютинин НА вируса гриппа птиц штамма H5N2, используется в эксперименте по определению протективности иммунизации на пермиссивной для вируса гриппа модели птиц.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на IV международной научной конференции студентов и молодых учёных «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2005), международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России (Курск, 2006), V международной научной конференции студентов и молодых учёных «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2006), IV Московском международном конгрессе «Экспо-биохим-технологии» (Москва, 2007), VI международной научной конференции студентов и молодых учёных «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007), расширенном заседании кафедры биологии, вирусологии и генной инженерии ГОУ ВПО МГУПБ 1 ноября 2007 года, заседании отдела генетики и молекулярной биологии бактерий 13 декабря 2007 г. ГУ НИИ ЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК, и 5 статей в сборниках международных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 124 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы и список используемой литературы (214 источников, из которых 15 отечественных и 199 иностранных). Работа содержит 4 таблицы и 20 рисунков.
Основные положения, выносимые на защиту.
Конструирование рекомбинантных аденовирусов CELO, содержащих соответствующий ген гликопротеина gB, gE или gl вируса болезни Марека штамм RB1B или ген гемагглютинина НА вируса гриппа птиц H5N2, технологией, основанной на гомологичной рекомбинации в Е. coli.
Изучение антигенных свойств гликопротеина gB ВБМ и гемагглютинина НА вируса гриппа птиц, экспрессируемых соответствующим рекомбинантным аденовирусом CELO-gB или CELO-HA.
Определение иммуногенности рекомбинантного гликопротеина gB и гемагглютинина НА5, экспрессируемых аденовирусами CELO-gB и CELO-HA соответственно, в экспериментах in vivo. Изучение протективности НА-специфического иммунного ответа у животных, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, в условии экспериментального заражения патогенным вирусом гриппа птиц.
Структурно-функциональная характеристика аденовирусов человека
Впервые аденовирусы были выделены в 1953 году (187). В 1954 году M.Hilleman и J.Werner идентифицировали аденовирус при эпидемии ОРЗ, которая возникла у новобранцев армии США и протекала без осложнений (91). На сегодняшний день идентифицированы более 100 аденовирусов, составляющих семейство Adenoviridae, которое подразделяется на 4 рода: Mastadenovirus (аденовирусы млекопитающих), Aviadenovirus (аденовирусы птиц), Atadenovirus и Siadenovirus.
Ад человека относятся к роду Mastadenovirus семейства Adenoviridae. Вирионы Ад, имеют размер 70-80 нм, и лишены внешней липопротеиновой оболочки. Капсид Ад имеет форму икосаэдра (20 триангулярных поверхностей и 12 вершин), образованного капсомерами гексона и пентона. Капсомер пентона располагается в вершине капсида и состоит из основания пентона и фибера. Белки пентона обеспечивают взаимодействие Ад с клеточным рецептором. С-концевой домен фибера (knob) осуществляет первичное высокоаффинное взаимодействие с рецептором CAR (coxsackie adenovirus receptor) (3, 27, 28, 106). Основание пентона несет RGD мотив, ответственный за связывание вириона с вторичными рецепторами ау(3з и avPs белками, принадлежащими к семейству интегринов, и осуществление интернализации Ад вирионов в эндосомы (120, 136, 185, 203, 204, 205). Геном Ад представлен в виде двухцепочечной молекулы ДНК размером 36000 пар оснований (и.о.). Левым принято считать конец молекулы ДНК Ад, несущий сигнал упаковки. Цепь ДНК, транскрибируемую слева направо, определяют как "г", справа налево - "1". 5 - конец каждой цепи ДНК ковалентно связан через остаток серина с терминальным белком, служащим в качестве праймера при репликации ДНК. На обоих концах молекулы ДНК присутствуют инвертированные концевые повторы (ИКП) длиной 100-140 п.о., необходимые для формирования репликативного комплекса (12). Наиболее изученным представителем Ад млекопитающих является Ад человека типа 5.
Геном Ад5 содержит 4 ранние области (Е1-Е4) и 5 поздних областей (L1-L5). Поздние гены находятся под контролем главного позднего промотора (MLP) и транскрибируются в основном во время поздних стадий инфекции после начала репликации вирусного генома. В результате транскрипции поздних генов формируется про-РНК, при процессинге которой (полиаденилирование и сплайсинг) образуется более 20 поздних мРНК. И ранние и поздние мРНК Ад подвергаются кэпированию и полиаденилированию (12). Синтез мРНК как ранних, так и поздних генов Ад осуществляет клеточная РНК-полимераза II. В геноме Ад5 обнаружены гены, кодирующие две небольшие РНК, транскрибируемые клеточной РНК-полимеразой III. Эти вирус-ассоциированные РНК (ВА-РНК) не кодируют белки, и их функция заключается в преодолении блока трансляции мРНК, индуцируемого инфекцией Ад (181).
Область Е1 расположена на левом конце "г" цепи генома Ад5 (Рис. 1). В данной области различают две ранние транскрипционные единицы - Е1А и Е1В. Транскрипционная единица Е1А кодирует два белка, необходимых для индукции транскрипции остальных ранних областей генома (129). Белки, кодируемые Е1 областью, индуцируют переход клетки из GO в S фазу клеточного цикла, что обеспечивает возможность осуществления репликации кодируемые El областью, индуцируют переход клетки из GO в S фазу клеточного цикла, что обеспечивает возможность осуществления репликации генома Ад. Продукты Е1В области ингибируют апоптоз инфицированной клетки (213). Кроме этого, белки Е1 области способны вызывать трансформацию клеток in vitro и ответственны за потенциальную онкогенность вируса (2, 77, 181, 197).
Е2 область расположена на "1" цепи генома Ад и содержит две транскрипционные единицы - Е2А и Е2В. Белки данной области обеспечивают репликацию вирусного генома, а также оказывают влияние на транскрипцию и трансляцию поздних вирусных генов (12, 87).
Гены ЕЗ области транскрибируются с "г" цепи и не являются необходимыми для репликации Ад в культуре клеток. Продукты экспрессии данной области осуществляют защиту инфицированных клеток от атаки иммунной системы организма за счёт нарушения транспорта молекул комплекса гистосовместимости первого класса, удаления с поверхности клетки и деградации некоторых рецепторов и сигнальных лигандов. (64, 195). В целом, ЕЗ область позволяет Ад защитить инфицированную клетку от противовирусной активности иммунной системы организма.
Транскрипция Е4 области генома Ад осуществляется с "1" цепи генома. В клетках, инфицированных Ад, обнаруживают 6 белков, кодируемых Е4 поздних вирусных белков из ядра в цитоплазму и ингибирование транспорта большинства клеточных мРНК (активность, проявляемая в комплексе с Е1В 55К) (12).
Промотор Е4 области активируется на ранних стадиях инфекции продуктом Е1А области и ингибируется на поздних стадиях вирусным ДНК-связывающим белком. Область поздних генов Ад транскрибируется с "г" цепи и контролируется главным поздним промотором, аттенюированным во время транскрипции ранних генов. Экспрессия поздних генов приводит к продукции структурных белков и образованию зрелых вирионов Ад в ядре инфицированной клетки. В результате лизиса клетки происходит выход вирусного потомства и начало следующего раунда репродукции вируса (12, 25,35,48).
Одним из наиболее распространённых аденовирусных векторов, используемых для доставки генетической информации, является аденовирус человека 5-го серотипа (Рис. 2.).
Ад векторы первого поколения несут делецию Е1 области вирусного генома, необходимой для репликации вируса (72, 209). Данные векторы не способны к репликации в отсутствие продуктов Е1 области, и для их получения и накопления созданы клеточные линии, такие как 293 (41, 78) и 911 (65), комплементирующие функции Е1 области in trans. При накоплении Ад в данных культурах клеток могут быть получены препараты векторов с титром до 10 БОЕ/мл. Кроме этого, удаление Е1 области увеличивает пакующую емкость векторов на основе Ад.
Для увеличения размера вставки Ад векторы первого поколения могут нести также делеции в ЕЗ области (32). Ад векторы второго поколения наряду с делециями Е1 и ЕЗ областей генома Ад несут также делеции в Е2 и Е4 областях. Такие векторы позволяют встраивать 10000 п.о. генетической наряду с делениями Е1 и ЕЗ областей генома Ад несут также делеции в Е2 и Е4 областях. Такие векторы позволяют встраивать -10000 п.о. генетической информации. Одним из существенных недостатков Ад векторов является их способность индуцировать иммунный ответ в организме, в результате которого снижается продолжительность экспрессии доставляемого трансгена (30, 103). Но этот недостаток можно миновать, используя аденовирусы различного типа.
Клонирование генов гликопротеинов gB, gE и gl из генома ВБМ и гена гемагглютинина из генома вируса гриппа H5N2
В качестве источника генов гликопротеинов ВБМ использовали ДНК вируса болезни Марека типа 1 штамма RB1B (Gene Bank AF 147806.2). Геномную ДНК из препарата ВБМ выделяли методом, описанным Heine Н,-G. (88).
Гены гликопротеинов gB, gE и gl ВБМ изолировали из генома ВБМ методом ПНР. Размеры генов гликопротеинов gB, gE и gl ВБМ составляют 2600 п.о., 1441 п.о. и 1065 п.о. соответственно. Поскольку при амплификации возможно накопление ошибок ДНК-полимеразы, в случае с геном гликопротеина gB, получали два ГЩР-продукта: первый - gBl, соответствующий 5 -концу, и второй - gB2, соответствующий 3 -концу гена. Аналогичным способом выделяли ген гликопротеина gE ВБМ.
Для амплификации использовали праймеры, последовательности которых указанны в таблице 1. Схема сайтов гибридизации праймеров с геномной ДНК вируса изображена на рис. 4. Полученные в результате ПНР последовательности ДНК были субклонированы в плазмидный вектор pGEM-Easy.
Полную последовательность гена gB восстанавливали клонированием фрагмента gB 1 в плазмиду pGEM-gB2 по сайтам распознавания нуклеазой рестрикции SphI, расположенных в перекрывающейся области ГЩР-продуктов и полилинкере плазмидного вектора. Схема восстановления гена gB представлена на рис. 5. Аналогичным способом был восстановлен ген gE, с использованием рестриктазы EcoRI.
Схема восстановления гена гликопротеина gB ВБМ в плазмидном векторе pGEM-Easy
Нуклеотидные последовательности клонированных ПЦР-продуктов определяли сиквенированием (НПФ «Литех»). Идентичность нуклеотидных последовательностей клонированных ПЦР-продуктов в составе плазмиды pGEM-Easy и генов gB, gE и gl ВБМ штамма RBI В была установлена в результате сравнительного анализа (BLAST).
Таким образом, в результате проведенной работы нами были изолированы гены гликопротеинов gB, gE и gl ВБМ, полученные ПЦР-продукты были клонированы в плазмидный вектор pGEM-Easy, установлена идентичность изолированных генов с соответствующими генами гликопротеинов ВБМ штамма RB1В.
2.2.1.2 Клонирование полноразмерного гена гемагглютинина из генома вируса гриппа H5N2 методом ОТ-ПЦР
Поскольку геном вируса ГП представлен сегментированной РЫК, для изолирования полноразмерного гена гемагглютинина, реакцией обратной транскрипции была получена кДНК генома вируса. В качестве матрицы для получения кДНК использовали РНК, выделенную из препарата вируса гриппа птиц A/Mallard Duck/Pennsylvania/10218/84 (H5N2) (Gene Bank DQ234078.1). При проведении ОТ-ПЦР использовали систему Reverse Tpanscnption System («Invitrogene», USA). Ген гемагглютинина вируса гриппа птиц получали путем амплификации кДНК с праймерами HA5-For и HA5-Rev, фланкирующими последовательность гена гемагглютинина. Нуклеотидные последовательности праймеров указаны в Таблице 1. Фрагмент ДНК, кодирующий ген гемагглютинина вируса гриппа птиц, был клонирован в плазмидный вектор pGEM-Easy. Схема клонирования гена гемагглютинина вируса ГП представлена на рис. 6.
Первичную последовательность клонированного фрагмента ДНК определяли методом сиквенирования (НПФ «Литех»). Идентичность гена гемагглютинина ГП в составе плазмиды pGEM-Easy проверяли сравнением (BLAST) его первичной структуры с последовательностью гена гемагглютинина вируса гриппа птиц A/Mallard Duck/Pennsylvania/10218/84 (H5N2). Анализ нуклеотидной последовательности клонированного ПЦР-продукта замен не выявил.
Таким образом, нами был клонирован полноразмерный ген гемагглютинина вируса ГП в плазмидный вектор pGEM-Easy, и проведен сравнительный анализ нуклеотидной последовательности клонированного ПЦР-продукта с геном НА вируса ГП H5N2, который показал идентичность сравниваемых последовательностей.
Рекомбинантные аденовирусы CELO, несущие целевые гены, получали методом гомологичной рекомбинации в E.coli. Метод основан на гомологичной рекомбинации между полноразмерным геномом аденовируса и челночным плазмидным вектором, который содержит последовательности, гомологичные концам генома вируса, и экспрессирующую кассету с целевым геном. В результате рекомбинации получается плазмидная конструкция, содержащая сайт инициации репликации Ori, ген устойчивости к антибиотику и экспрессирующую кассету в составе генома аденовируса. Преимуществом метода является возможность использования клеток Е. coli в качестве основного инструмента для проведения клонирования, рекомбинации и наращивания аденовирусной ДНК. Возможность проведения гомологичной рекомбинации в E.coli позволяет работать с индивидуальными клонами, содержащими плазмидные конструкции только рекомбинантных аденовирусов, что исключает вероятность контаминации аденовирусом дикого типа.
Для конструирования рекомбинантных аденовирусов, гены gB, gE и gl вируса болезни Марека и ген НА вируса гриппа птиц были субклонированы из плазмиды pGEM-Easy в плазмидный вектор pCDNA3.1-BPL, содержащий нетранслируемый двучастный лидер BPL (bipartite leader -BPL) аденовируса птиц CELO на 3 -конце промотора цитомегаловируса человека (CMV). BPL расположен на 5 - конце всех поздних аденовирусных мРНК и способен повышать уровень трансляции вирусных белков на поздних стадиях инфекции (182).
Конструкции BPL-gB, BPL-gE, BPL-gl и BPL-HA были клонированы из вектора pCDNA3.1-BPL в челночный плазмидный вектор pCShuttle, несущий концевые фрагменты генома CELO и кассету, содержащую CMV промотор и сигнал полиаденилирования. Принципиальная схема клонирования целевых генов в челночный вектор представлена на рис.
Определение иммуногенности рекомбинантного гликопротеина gB ВБМ, экспрессируемого CELO-gB на цыплятах
Для изучения иммуногенности гликопротеина gB, экспрессируемого рекомбинантным аденовирусом CELO-gB, в качестве экспериментальных животных использовали цыплят 14-суточного возраста. Цыплят подкожно иммунизировали рекомбинантным аденовирусом CELO-gB в количестве 1,2 1010 физических частиц на цыплёнка. В таблице 3 приведена схема иммунизации. Образцы сывороток получали через 3 недели после иммунизации.
Полученные образцы сывороток были исследованы на наличие специфических антител к ВБМ. Уровень специфических антител определяли методом непрямого ИФА. Для постановки непрямого ИФА в качестве антигена использовали очищенный ВБМ. Результат проведенного иммуно-ферментного анализа представлен на рис. 14.
В результате анализа сывороток цыплят, иммунизированных вирусом CELO-gB, были детектированы антитела к вирусу ВБМ с титром до 8 log2.
Полученный результат свидетельствует об индукции ВБМ-специфического гуморального иммунитета, индуцируемого в ответ на подкожное введение рекомбинантного вируса на основе птичьего аденовируса CELO, экспрессирующего ген гликопротеина gB ВБМ штамма RB1B под контролем промотора CMV.
Таким образом, в результате генетической иммунизации рекомбинантным аденовирусом CELO-gB, показана индукция специфического иммунитета в ответ экспрессию гликопротеина gB.
Для подтверждения функциональной активности вектора на основе аденовируса птиц CELO, образцы полученных сывороток анализировали на наличие специфических антител к вирусу CELO, как маркеру иммунизации. Уровень специфических антител определяли предварительно разработанным методом непрямого ИФА. Для постановки непрямого ИФА в качестве антигена использовали очищенный в градиенте CsCL вирус CELOwt в сенсибилизирующей дозе - 5 мкг\мл. Комплекс антиген-антитело выявляли антивидовым иммунопероксидазным конъюгатом (Anti-chicken IgG-HRP, Amersham). Активность измеряли, используя ТМБ-субстрат. Результат проведенного анализа представлен на рис. 15.
Исходя из результатов иммунноферментного анализа в группах цыплят, иммунизированных препаратами вируса CELOwt и CELO-gB, были обнаружены антитела специфические к вирусу CELO, как маркеру иммунизации (титр log2 9.5).
В настоящее время совместно с лабораторией диагностики вирусных болезней птиц ФГУФЦО ЗЖ (г. Владимир) проводится эксперимент на курах по определению иммуногенности рекомбинантных аденовирусов CELO-gB, CELO-gE и CELO-gl, несущих гены гликопротеинов ВБМ
Оценку иммуногенности рекомбинатного гемагглютинина, экспрессируемого аденовирусом CELO-HA, проводили методом РТГА. Для этого мышей линии BALB/c внутривенно иммунизировали аденовирусом CELO-HA. Повторную вакцинацию провели через 30 суток. Образцы сывороток отбирали через 30 дней после повторной иммунизации. Полученные образцы сывороток анализировали на наличие специфических гемагглютинирующих антител к вирусу гриппа птиц штамма H5N2. Для постановки РТГА использовали очищенный вирус гриппа птиц штамма H5N2. Результат проведенной реакции торможения гемагглютинации представлен на рис. 16.
Анализ протективности НА-специфического иммунного ответа мышей, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, с последующим заражением летальной дозой вируса гриппа птиц H5N2
В результате проведения предыдущего эксперимента установили, что оптимальным для вакцинации является двукратное интраназальное введение рекомбинантным аденовирусом CELO-HA. Целью этого эксперимента являлось изучение протективных свойств рекомбинантного аденовируса CELO-HA в условии заражения мышей летальной дозой (50 LD5o) вируса гриппа птиц штамма H5N2. Для этого мышей линии BALB/c иммунизировали аденовирусом CELO-HA в соответствии с результатом, полученным в предыдущем эксперименте. В качестве отрицательных контролей использовали аденовирус дикого типа CELOwt или солевой изотонический раствор. Через 21 день после повторной иммунизации мыши были интраназально заражены летальной дозой вируса гриппа птиц штамма H5N2. Группы наблюдались в течение 2-х недельного периода после заражения. На рис. 19. представлена диаграмма выживаемости мышей по результатам двух экспериментов.
В результате эксперимента установлено, что мыши, интраназально иммунизированные рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, не восприимчивы к заражению летальной дозой вируса-пробойника. В то время как в группах негативного контроля, где мышам вводили вирус CELOwt дикого типа или солевой раствор, падение наблюдали с 7 дня после заражения вирусом гриппа. Через 14 суток после заражения вирусом-пробойником в контрольных группах пали все особи. Данные анализа свидетельствуют о наличие протективного иммунитета сформированного в ответ на интраназальную иммунизацию рекомбинантным аденовирусом CELO, экспрессирующим ген гемагглютинина НА вируса гриппа птиц штамма H5N2.
Таким образом, в результате эксперимента было установлено, что уровень защиты при экспериментальном заражении летальной дозой (50 LD5o) вируса гриппа H5N2 мышей, интраназально иммунизированных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, экспрессирующим ген гемагглютинина НА5, составил 95%. 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Вакцинация против возбудителей инфекций, вызванных паразитами микробной или вирусной природы, основана на использовании их инактивированных и аттенуированных форм. Такие вакцинные препараты обеспечивают высокий уровень защиты иммунизированных животных против соответствующего инфекционного возбудителя.
Однако традиционные вакцины неэффективны по отношению к «новым» или, наоборот, «спящим» возбудителям инфекций, с антигенной структурой, сильно отличающейся от структуры вакцины. С другой стороны, уже существующие вакцины от особо опасных инфекций требуют постоянных и значительных экономических затрат для обеспечения их безопасного производства.
Очевидно, что в условиях постоянно возникающих новых эпидемиологических угроз существует необходимость в разработке новых эффективных вакцин с гибкой технологией получения, которая бы позволяла быструю переориентацию производства в зависимости от возникающей опасности.
В связи с этим возникает необходимость в разработке новых эффективных вакцин с гибкой технологией получения, которая бы позволяла быструю переориентацию производства в зависимости от возникающей опасности.
Преодоление выше означенной проблемы принципиально возможно при использовании генно-инженерных систем.
Одной из перспективных является система, основанная на использовании аденовирусных векторов.
Интерес к данной векторной системе основан на наличии у аденовирусов ряда особенностей, определяющих их привлекательность как генно-инженерные векторы. Во-первых, для аденовирусных систем разработаны высокотехнологичные схемы получения рекомбинантных вирусов, несущих и экспрессирующих в составе собственной геномной ДНК, гены определённых инфекционных возбудителей (13, 52, 53, 83). Время, затрачиваемое на получение нового аденовирусного вектора, экспрессирующего целевой ген, составляет 4-6 недели. При использовании такой технологии на выходе получается стандартный рекомбинантный аденовирусный вектор, накапливаемый в препаративных количествах в стандартных производственных условиях. Таким образом, масштабное производство различных кандидатных вакцин на основе аденовирусных векторов может быть реализовано на одной технологической линии без ее переоборудования и изменения регламента, что может существенно снизить трудозатраты на производство вакцин и, как следствие, их себестоимость. Кроме того, в настоящее время разработаны и утверждены эффективные технологии крупномасштабного GMP (Good Manufacturing Practice) производства препаратов Ад.
Во-вторых, аденовирусы способны инфицировать различные типы делящихся и неделящихся клеток. В настоящее время, разработан обширный инструментарий, позволяющий легко модифицировать молекулярные структуры (геном и белки оболочки капсида) аденовирусов с целью создания высокоэффективных векторов с определенными заданными свойствами. Аденовирусные векторы с расширенным тропизмом, обеспечивающим его проникновение в разные типы тканей, в том числе и резистентных к аденовирусной инфекции, служат основой для создания кандидатных генно-инженерных вакцин. Кроме того, создано большое количество Ад векторов, которые способны локально или системно доставлять до 35 т.п.о. чужеродной ДНК в клетки млекопитающих и птиц.
![Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс]](/i/i/4503/199818.png "Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс] Донин Михаил Васильевич")
