Введение к работе
Акт>аіьность пробтечы Аденовирусы (Ад), наряду с другими ДНК-содерлащичи вирусами, представляют собой широко используемую модель в молекучярно-биочогических биомедицннских и биотехнологических исследованиях В последнее десятилетие интенсивно исследуется возможность использования в качестве векторных систем для доставки чужеродной генетической информации Ад чечовека 5-го серотипа (Ад5) Векторы на основе генома Ад5 обладают рядом неоспоримых пренм\ществ, к которым относятся широкая тропность, способность расти в высоком титре и безопасность В тоже время следует отметить ряд недостатков этой векторной системы, в частности, недостаточная пакующая емкость, высокая себестоимость препаратов рекомбинантных Ад, предсуществующий иммунный ответ в организме человека В связи с этим большой интерес вызывает возможность создания новых векторных систем на основе геномов аденовир\сов птиц лишенных лих недостатков
Перспективным вектором для доставки генов в кчегки мтекопитающих m vivo является аденовирус птиц 1-го серотипа (CELO) Вирус имеет типичную дія всех аденовирусов икосаэдрическую форму капсида, который состоит из капсомеров гексона и пептона, диаметр вириона составляет 70-80 нм Геном Ад CELO представлен линейной двухцепочечной мотекулой ДНК Преимуществами векторов на основе генома CELO явчяются большая пакующая емкость и более высокая физическая стабильность вирнонов Ад CELO, чем вирнонов Ад млекопитающих, непермиссивность клеток человека и животных для данного вируса, отсутствие первичного имм) иного ответа в организме млекопитающих, возможность наращивания вируса в куриных эмбрионах, что значитетьно снижает стоимость получения препаративных кочичеств Ад CELO по сравнению с Ад человека
Недавние исследования показали, что вирус CELO может быть использован в качестве вектора для доставки генетической информации в генной терапии и вакцинации (Карпов А и соавт, 2007, Logunov D Y et al, 2004, Francois A et al, 2004) Однако практическое применение векторов на основе CELO ограничено вследствие недостаточной эффективности транедукцни определенных типов клеток млекопитающих
Для решения проблемы, связанной с ограниченной эффективностью транедуции клеток млекопитающих векторами на основе Ад человека, разработаны подходы, закчючающиеся в генетической модификация отростка пептона (фибера) Данные подходы включают конструирование «химерных» фиберов (замена глобулярного домена на соответствующий домен альтернативного серотипа Ад) или введения различных гетерологичных рецептор-связывающих последовательностей на С-конец или в Ш-петлю
глобулярного домена фибера Такие модифицированные векторы способны обеспечивать эффективную доставку генетической информации в клетки млекопитающих, в норме резистентных к Ад инфекции
В отличие от Ад человека, в каждой вершине вириона CELO находится два фибера различной длины Длинный фибер CELO способен к взаимодействию с основным аденовирусным рецептором - CAR (coxsackie and adeno\irus receptor) и, в отличие от короткого фибера, несущественен для сборки и проникновения вируса в пермиссивные клетки (Tan Р К et al, 2001) Такая структурно-функциональная организация капсида CELO позволяет предположить возможные направленные модификации длинного фибера, с целью повышения тропности вируса по отношению к определенным типам клеток млекопитающих В связи с этим исследования связанные с созданием фибер-модифицированных векторов CELO, представляет самостоятельный научный интерес
Цель н задачи исследования Цечью настоящей работы являлось создание на основе вируса CELO с модифицированным тропизмом векторных систем, способных к эффективному переносу генетической информации в CAR-дефицитные и/или CAR-негативные клетки млекопитающих т и w vno
В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи
1 Идентификация участков в аминокислотной последовательности глобулярного домена
длинного фибера вируса CELO пригодных для модификации вирусного тропизма
2 Получение модифицированных вирусных векторов, содержащих в качестве
гетерологичного лиганда интегрин-связывающую последовательность RGD внутри
идентифицированных петель глобулярного домена длинного фибера CELO, и несущих
репортерный ген SLAP или EGFP под контролем CMV-промотора
Опредетение эффективности доставки генетической информации модифицированными векторами CELO в экспериментах по трансдукции различных культур клеток
Изучение механизма проникновения модифицированных векторов CELO в клетки млекопитающих
Исследование влияния последовательности RGD на проникновение модифицированных векторов CELO в клетки млекопитающих
Определение эффективности доставки репортерного гена SEAP, встроенного в геном модифицированных векторов CELO в CAR-дефицигные клетки млекопитающих в экспериментах т \ ivo
7 Изучение возможности экспрессии гена лактоферрина человека модифицированными векторами CELO в молочной жетсзе козы
Научная новизна и практическая значимость В результате проведенной работы впервые идентифицирована НІ-петля в аминокислогной последовательности глобутарного домена длинного фибера аденовируса птиц CELO
Впервые получены векгоры на основе аденовируса птиц CELO, содержащие последовательность RGD в структуре длинною фибера, и несущие репортерные гены SEAP или EGFP под контролем CMV промотора (CELOSFAP-HIRGD, CEI OEGFP-HIRGD, CELOSEAP-RGD и CELOEGFP-RGD) Показано, что введение интегрин-связываюшей последовательности RGD в НІ-петлю глобулярного домена длинного фибера не влияет на исходные функции данного белка, не снижает способность CELO к высокопродуктивной инфекции в куриных эмбрионах и приводит к изменению тропизма вир>са
Методом ПЦР в режиме реального времени и по уровню экспрессии репортерных генов показано увеличение эффективности транедукции CARv^nniiTHbix и CAR-негативиых клеточных культур модифицированными векторами CELO (CEIOSEAP-HIRGD, CELOEGFP-HIRGD)
Впервые показан CAR-независимый механизм транедукции клеток млекопитающих модифицированным вектором CELO-HIRGD Определено увеличение процессов прикрептения и интернализации вектора CELO-HIRGD в клетки млекопитающих
В ходе работы показано уветичение экспрессии трансгена (SEAP), встроенною в геном модифицированного CELO вектора (CELOSEAP-HIRGD) при транедукции CAR-дефицигных клеток млекопитающих в условиях т vno
Впервые показана эффективная доставка и экспрессия ієна тактоферрина человека модифицированным вектором CELOL1-HIRGD в молочной железе козы
Работа представляет не только научный интерес, но и в перспективе может иметь практическое применение Модифицированные Ад птиц CELO могут быть испотьзоваиы в качестве средств доставки и экспрессии целевых генов с целью применения таких векторов в медицине и ветеринарии в качестве генно-инженерных вакцин, для создания средств профилактики различных заболеваний, а также в генной терапии
Научная новизна проведенных исследований подтверждена патентом положительное решение о выдаче Патента Российской Федерации на изобретение по заявке №2007121785 «Способ создания рекомбинантных аденовирусов птиц для вакцинации и генной терапии»
Апробация работы Результаты работы были представтены на научно-
практической конференции молодых ученых и аспирантов «Современные проблемы биохимии и биофизики в биологи и медицине», ФГУВПО МГЛВМиБ им К И Скрябина (Москва, 2005), международной юбилейной на\чно-практическои конференции посвященной 110-летию Курской биофабрики и aiробиологической промышленности России (Курск, 2006) V международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биотогическая безопасность населения», ГОУ ВПО МГУПБ (Москва, 2006) научно-практической конференции посвященной 40-тетию ВБФ и 110-летию С И Афонскою «Вопросы физико-чимической биоіогии в ветеринарии», ФГУВПО МІАВМиБ им К И Скрябина (Москва, 2006), международной русско-французской конференции «Virus vectors for gene function study, gene therapy, veterinary and biomedical applications)/, ГУНИИЭМ им H Ф Гамалеи (Москва, 2007), межкафедральном научном совещания сотрудников кафедр ветеринарной вирусологии микробиологии, иммунологии и биотехночогии ФГОУ ВПО «МГАВМиБ» 20 февраля 2008г
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК, и 4 статьи в сборниках конференций
Структура диссертационной работы Диссертация изтожена на 135 страницах, включает 2 таблицы, 21 рисунок, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения, выводов, списка используемой литерагуры (включающего 229 наименований, в том числе 225 на иностранных языках)
