Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Типы вирусных векторов для экспрессии пептидов и полипептидов в 8
растениях
1.2. Системы презентации эпитопов 9
1.2.1. Системы презентации эпитопов на основе палочковидных вирусов 9
1.2.2.Системы презентации эпитопов на основе сферических, вирусов 16
1.3 Системы экспрессии полипептидов 22
1.3.1.Вектора, сконструированные по принципу «замена гена» 22
1.3.2.Вектора, сконструированные по принципу «дополнительный ген» 23
1.3.2.1 .Системы экспрессии полипептидов на основе палочковидных вирусов 23
1.3.2.2.Системы экспрессии полипептидов на основе сферических вирусов 31
1.4. Получение вирусоподобных частиц (ВПЧ) в растениях с помощью
вирусных векторов 35
1.5. Стратегии «full virus» и «deconstructed virus» 43
1.6. Векторная система на основе делеционного варианта РНК-2 CPMV 49
1.7. Системы презентации внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа А 51
1.8. Нуклеокапсид вируса гепатита В (HBcAg) человека как система презентации эпитопов и полипептидов 56
1.9. Вирусы растений и нанотехнологии 59
1.10 Заключение 62
Глава 2. Материалы и методы 64
2.1. Растения и бактериальные штаммы 64
2.2. Животные 64
2.3. Штамм вируса гриппа 64
2.4. Питательные среды и антибиотики 64
2.5. Ферменты и коммерческие наборы 65
2.6. Реактивы и буфера 65
2.7. Синтетические олигонуклеотиды 65
2.8. Конструирование векторов экспрессии 66
2.9. Секвенирование ДНК 66
2.10. Приготовление компетентных wiQTOKA.tumefaciens для электропорации 66
2.11. Трансформация A. tumefaci$ns и агроинфильтрация растений N. benthamiana и V.unguiculata 66
2.12. Приготовление глицеринового стока культур A.tumefaciens 67
2.13. Приготовление грубого экстракта из листьев V.unguiculata для заражения здоровых растений 67
2.14. Выделение вирусных частиц CPMV 68
2.15. Выделение РНК из вирусных частиц CPMV для ОТ-ПЦР анализа 68
2.16. Частичная очистка ВПЧ HBcAg 69
2.17. Вестерн-блот анализ экспрессии белка нуклеокапсида в растениях N. bentham і'ana и V.unguiculata 69
2.18. Получение очищенных препаратов ВПЧ HBcAg 70
2.19. Иммуно-сорбентная электронная микроскопия (ISEM) 70
2.20. Трансмиссивная электронная микроскопия (ТЕМ) 70
2.21. Иммунологическое мечение золотом 71
2.22. Исследование иммуногенпых и протективных свойств химерных вирусных частиц CPMV/M2e 71
2.22.1.Способ введения препарата, получение эмульсии, дозы и схема 71
иммунизации
2.22.2.Метод анализа специфических антител 72
2.22.3.Электронная микроскопия 72
2.22.4.Масс-спектрометрия 73
2.22.5.Статистический анализ 73
Глава 3. Результаты и обсуждение 74
3.1. Получение ВПЧ HBcAg в растениях с помощью векторов на основе Х-ВК и полноразмерной РНК-2 CPMV 74
3.1.1.Конструирование векторов экспрессии HBcAg на основе Х-ВК и CPMV 74
3.1.2. Заражение растений N.benthamiana и V.unguiculata и характер развития симптомов вирусной инфекции 76
3.1.3.Исследование экспрессии белка нуклеокапсида HBV в растениях 78
3.1 ^.Идентификация ВПЧ HBcAg методом ISEM 80
3.2. Получение ВПЧ HBcAg с помощью векторной системы на основе делеционного варианта РНК-2 CPMV 83
3.2.1.А.Конструирование вектора экспрессии HBcAg на основе делеционного варианта РНК-2 CPMV 84
3.2.1.Б. Конструирование вектора экспрессии HBcAg/M2e на основе делеционного варианта РНК-2 CPMV 84
3.2.2.Агроинфильтрация растений TV.benthamiana векторными конструкциями pBinP/Acore и pBinP/AcoreM2e и анализ экспрессии вариантов HBcAg 85
3.2.3.Электронно-микроскопическое исследование препаратов ВПЧ HBcAg 87
3.2.4.Исследование свойств ВПЧ HBcAg методом иммунологического мечения золотом 90
Система презентации внеклеточного домена М2-белка вируса гриппа А (М2е-эпитопа) человека и птиц на основе CPMV 89
3.3.1.Конструирование векторов экспрессии внеклеточного домена М2-белка вируса гриппа А человека и птиц на основе CPMV 90
3.3.2.3аражение растений V. unguiculata и характер развития вирусной инфекции 92
З.З.З.Анализ генетической стабильности рекомбинантных вирусов 93
З.ЗАВыделение и анализ рекомбинантных вирусных частиц 96
3.3.5.Иммунизацияия мышей химерными вирусными частицами CPMV/M2eH и CPMV/M2eA 100
З.З.б.Изучение протективного действия препарата CPMV/M2eH на модели летальной гриппозной инфекции 101
Выводы 104
Список литературы
- Системы презентации эпитопов на основе палочковидных вирусов
- Питательные среды и антибиотики
- Вестерн-блот анализ экспрессии белка нуклеокапсида в растениях N. bentham і'ana и V.unguiculata
- Заражение растений N.benthamiana и V.unguiculata и характер развития симптомов вирусной инфекции
Введение к работе
Технология рекомбинантных ДНК открыла широкие возможности для создания систем экспрессии белков как для фундаментальных исследований, так и для практического применения в современной медицине, для получения вакцин, антител, гормонов для заместительной терапии, факторов роста и т.д. Большинство белков в процессе синтеза подвергаются посттрансляционным модификациям, таким как гликозилирование, отщепление сигнальных пептидов, образование дисульфидных связей и, как следствие, в активном состоянии могуг быть получены только в эукариотических системах экспрессии.
Первые эукариотические системы экспрессии были основаны на технологии "клеточных биореакторов" с использованием культур клеток млекопитающих[1], насекомых [2], дрожжей [3]. Однако стоимость рекомбинантных белков, получаемых с помощью данных систем, достаточно высока, а в случае использования клеток животных существует риск наличия в них вирусных патогенов, опасных для человека.
Наиболее перспективными являются системы экспрессии на основе высших живых организмов-трансгенных животных и растений. Если использование трансгенных животных не снимает проблем безопасности, связанных с риском заражения патогенами, то системы экспрессии на основе растений являются привлекательной альтернативой по ряду причин.
Во-первых, системы экспрессии на основе растений дают возможность получить значительные количества биомассы без сравнительно больших энергетических и денежных затрат и специального оборудования для ферментации.
Во-вторых, исключена возможность заражения патогенами, опасными для человека и животных. В-третьих, системы посттрансляционной модификации в растениях обеспечивают синтез функционально активных белков.
В настоящее время существует три основных метода получения рекомбинантных белков в растениях: стабильная генетическая трансформация ядерного генома, генетическая трансформация генома хлоропластов и использование векторов экспрессии на основе вирусов растений.
Генетическая трансформация подразумевает стабильную интеграцию целевого гена в хромосому растения, либо методом агробактериальной трансформации [4], либо с помощью биолистической трансформации [5]. Основным преимуществом данного подхода является то, что интегрированная последовательность стабильно наследуется. Однако, процесс регенерации трансформированных растений довольно длительный и сложный, может занимать от 6 недель до 1 года, в зависимости от вида растения. Экспрессия трансгена подвержена влиянию таких факторов, как число копий трансгена, эффект положения,
5 і
сайленсинг. Основным же недостатком трансгенных растений в качестве источника рекомбинантных белков является низкий уровень экспрессии.
Трансформация генома хлоропластов позволяет значительно повысить уровень экспрессии целевого белка, в некоторых случаях до 46% от общего количества растворимого белка [6]. Этот метод позволяет избежать таких негативных явлений, как эффект положения и сайленсинг, и кроме того, исключает попадание трансгена в окружающую среду с пыльцой, т.к. хлоропласты у большинства растений наследуются только по материнской линии. Основным недостатком данного метода является отсутствие системы гликозилирования белков в хлоропластах, что значительно ограничивает его использование.
Несмотря на то, что трансгенные растения, полученные с помощью вышеописанных методов, успешно использовались для получения различных белков, длительное время, необходимое для их получения и анализа, является основным недостатком таких систем, особенно в случае, когда необходимо одновременно протестировать несколько различных кассет экспрессии.
Альтернативой генетической трансформации является использование векторов экспрессии на основе вирусов растений. Одним из главных преимуществ данного метода является то, что вирус размножается внутри инфицированной клетки, и, следовательно, ген целевого белка в составе вирусного генома амплифицируется в большом количестве копий, что в сочетании со способностью многих вирусных векторов вызывать системную инфекцию, обеспечивает высокий уровень экспрессии в сравнительно короткий промежуток времени. Генно-инженерные манипуляции с геномами растительных вирусов относительно просты в силу небольшого размера их геномов.
За редким исключением, большинство вирусов растений не интегрирует в геном клетки-хозяина. Таким образом, ген целевого белка не наследуется и не передается через семена. Это с одной стороны является недостатком данной системы экспрессии, но с другой стороны экспрессия не подвержена эффекту положения.
Данная система экспрессии, как и любая другая, не лишена определенных недостатков.
Существуют ограничения по размеру и сложности последовательностей, которые могут экспрессироваться в составе вирусных векторов без нарушения способности вируса к репликации, сборке и транспорту. Основная проблема, связанная с использованием вирусных векторов-проблема генетической стабильности. РНК-содержащие вирусы растений, на основе которых создано большинство существующих векторов экспрессии, мутируют с высокой частотой из-за ошибок, возникающих в процессе синтеза РНК с
участием РНК-полимеразы, вследствие чего инсерция обычно модифицируется и нередко делетируется в процессе вирусной инфекции. Тем не менее, несмотря на все перечисленные недостатки, системы экспрессии с использованием вирусных векторов являются более предпочтительными в случаях, когда необходимо быстро протестировать большое количество векторных конструкций, получить белок для исследований в максимально короткие сроки, исследовать возможное токсичное воздействие экспрессии белка интереса на рост и развитие растения. Т.к. многие вирусы растений способны инфицировать широкий круг хозяев, одна и та же векторная конструкция может быть использована для изучения влияния эффекта хозяина на экспрессию целевого белка.
К настоящему моменту создано множество различных векторных систем на основе вирусов растений, которые успешно используются как для получения пептидов и полипептидов в растениях, так и в фундаментальных исследованиях для изучения механизмов экспрессии генов. В то же время, до сих пор отсутствуют четкие критерии выбора оптимальной векторной системы для экспрессии того или иного целевого белка. В этой связи, интересным является сравнение эффективности различных векторных систем для экспрессии одного и того же полипептида, а также изучение влияния инсерции гена целевого белка на характер развития вирусной инфекции.
Целью настоящей работы являлось создание векторных систем на основе вируса мозаики коровьего гороха (CPMV) и Х-Вируса Картофеля (Х-ВК) для получения в растениях важных диагностических и протективных антигенов вирусов гепатита В человека (HBV) и вируса гриппа человека и птиц типа А и исследование их сравнительной эффективности. Для этого в работе решались следующие задачи:
1. Конструирование и сравнительный анализ эффективности векторов экспрессии
белка нуклеокапсида (HBcAg) в растениях на основе CPMV и Х-ВК.
2. Исследование характера развития инфекции, а также способности к самосборке
IIBcAg в тканях растений при его синтезе CPMV или Х-ВК векторов.
Исследование возможности использования новой векторной системы на основе делеционного варианта РНК-2 CPMV для оптимизации процедур выделения чистых препаратов ВПЧ HBcAg.
Создание системы презентации эпитопов внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа А человека и птиц на основе CPMV.
Исследование иммуногенных и протективных свойств внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа А человека в составе частиц CPMV при иммунизации мышей препаратами химерных вирусных частиц.
Системы презентации эпитопов на основе палочковидных вирусов
ВТМ является типичным представителем семейства Tobamoviridae. Геном ВТМ состоит из единственной (+)-цепи РНК размером 6,4 т.н., капсид содержит 2130 субъединиц единственного БО (17,5 кДа), вирусная частица имеет палочковидную форму и размеры 300x18 нм. Геном вируса кодирует два белка, обеспечивающих репликацию, которые транслируются непосредственно с геномной РНК, транспортный белок и БО, которые транслируются с субгеномных мРНК. Таким образом, ВТМ использует две различные стратегии экспрессии белков: слабый amber-стоп ко дон и синтез субгеномных мРНК. 5 -ОРС транслируется с геномной РНК с образованием 126 кДа белка, наличие amber-стоп кодона обеспечивает синтез 183 кДа белка, которые и образуют РНК - зависимую РНК полимеразу. РНК - зависимая РНК полимераза обеспечивает синтез (-)-РНК копий генома, которые служат матрицами для последующего синтеза (+)-РНК геномов и субгеномных мРНК для синтеза транспортного белка и БО. Транспортный белок (30 кДа) обеспечивает межклеточный транспорт ВТМ, модифицируя структуру плазмодесм. БО экспрессируется на поздних этапах вирусного цикла репликации. БО необходим для образования вирионов и системного транспорта вирусных частиц по сосудистой системе растения [13]. Круг хозяев очень широк, ВТМ заражает более 200 видов растений. Выход вируса может достигать 50% от сухого веса растения, что составляет до 60 мг вируса на 1 г растительной ткани. В природе для ВТМ не существует естественных переносчиков, например, насекомых, поэтому проблемы генетической безопасности таких векторов сведены к минимуму [14]. Эти свойства объясняют большой интерес к разработке векторов экспрессии на основе ВТМ.
Первая попытка создания системы презентации эпитопов на основе ВТМ относится к 1986 году, когда химерный БО ВТМ, несущий на С-конце эпитоп полиовнруса длиной 8 а.к.о., был экспрессирован в E.coli [15].
Первая попытка получить химерные вирусные частицы ВТМ в клетках растений была предпринята Takamatsu et al. [16]. Последовательность, кодирующая Leu-энкефалин, опиоидный пептид, модулирующий болевую чувствительность в спинном мозге, была клонирована в С-конец гена БО, непосредственно перед стоп-кодоном. Оказалось, что данная инсерция препятствует образованию вирионов и, как следствие, системному транспорту вируса. Это первое исследование обозначило общую проблему использования ВТМ в качестве системы презентации эпитопов. С одной стороны, капсид ВТМ содержит большое количество субъединиц БО, что теоретически делает вирус привлекательным для презентации эпитопов, но с другой стороны, белковые субъединицы в составе капсида очень плотно прилегают друг к другу, что накладывает пространственные ограничения на способность к сборке капсида при презентации относительно длинных эпитопов. Для преодоления этих пространственных ограничений был разработай вектор экспрессии, который обеспечивает одновременный синтез нативных и модифицированных субъединиц БО, содержащих эпитоп на С-конце. Технически это достигается введением слабого стоп-кодона в С-конец гена БО ВТМ [17]. Данная система позволяет получить химерные вирусные частицы ВТМ, у которых до 5% субъединиц БО в составе капсида несут эпитоп на С-конце. С помощью данной системы были получены химерные частицы ВТМ, несущие на поверхности эпитопы различных патогенов, например, возбудителя малярии [18]. В дальнейшем были найдены и другие, более оптимальные сайты инсерции, и такие системы презентации дали возможность модифицировать все субъединицы БО в составе химерного вириона без нарушения его способности к сборке [19-20].
Таким образом, на сегодняшний день в качестве сайта инсерции чаще всего используется положение между 154 и 155 а.к.о.БО. Однако, максимальный размер инсерции ограничен 23 а.к.о., несмотря на все усилия по оптимизации сайта инсерции [21].
Для преодоления ограничений, связанных с размером эпитопа, который может быть экспрессирован в составе БО ВТМ без нарушения сборки и транспорта вируса, был разработан комбинированный подход с использованием ВТМ в качестве вектора и БО вируса мозаики люцерны (A1MV) в качестве носителя эпитопа [22]. Геном A1MV состоит из 4 молекул РНК Приготовление компетентных клеток E.coli, трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК, выделение плазмидной ДНК, обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции, отжиг синтетических олигонуклеотидов, лигирование, электрофорез в агарозном геле и другие стандартные манипуляции проводились в соответствии с описанными методиками (Маниатис и др., 1984) или с помощью коммерческих наборов в соответствии с протоколами производителя.
Анализ полученных векторных конструкций проводили методом секвенирования с использованием набора ABI BigDye3.1 sequencing kit (Applied Biosystems) согласно протоколу производителя.
Приготовление компетентных клеток A.tumefaciens для электропорации Колонию A.tumefaciens LBA4404 высевали в 10 мл жидкой среды LB и наращивали до ОП 0,5-1 при 28С на качалке в течение ночи. Далее 5 мл культуры переносили в 100 мл LB, содержащей 50 мкг/мл рифамшщина и наращивали при 28С в течение 4-х часов. Клетки осаждали ц/ф 4000 g, 15 мин., 4 С и осадок ресуспендировали в 20 мл буфера ( 1 мМ HEPES/KOH рН 7,0). Далее клетки осаждали ц\ф 4000 g, 5 мин., 4 С и повторно промывали 20 мл буфера ( 1 мМ HEPES/KOH рН 7,0). Осадок ресуспендировали в 700 мкл 10% глицерина и хранили в аликвотах по 40 мкл при -80С.
Трансформацию компетентных клеток A.tumefaciens LBA4404 соотвествующими бинарными векторами проводили методом электропорации на приборе BioRad Gene Pulse в 2 мм кюветах (BioRad) в режиме 2,5 кВ, 25 цф, 200D, 4 мс). К клеткам после электропорации добавляли 1 мл LB и наращивали на качалке в течение 2-х часов при 28С. Далее высевали на чашки с агаризованной средой LB, содержащей 100 мкг/мл канамицина и инкубировали в течение 2-3 дней при при 28 С.
Полученные штаммы высевали в жидкую среду LB, содержащую 100 мкг/мл канамицина и наращивали до стационарной фазы (обычно в течение 2-х дней), до ОП=0.5-1 при 28С. Клетки осаждали центрифугированием (2000g, 4 - 10С, 15 мин), осадок ресуспендировали в среде ММА (10 мМ MgCb,10 мМ MES рН5.6, ЮОцМ ацетосерингон) до 011=1 и индуцировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Смешивали равные объемы соответствующих клеточных культур. Для агроинфильтрации N.benthamiana (возраст 2-3 недели) использовали 1 мл шприцы без иглы. На нижней стороне листа делали небольшие повреждения с помощью наконечника для автоматических пипеток и мягко вводили суспензию культуры агробактерии. ( Учебный видеоролик по технике агроинфильтрации можно посмотреть на сайте http://www.sainsbury laboratory.ac.uk/dcb/services/AgroTnfntrationHP.htm). Для агроинфильтрации растений коровьего гороха V.unguiculata на внешней стороне листа делали неглубокие насечки с помощью наконечника для автоматической пипетки для повреждения восковой кутикулы и в данные участки мягко вводили суспензию агробактерии.
Приготовление глицеринового стока культур A.tumefaciens Одиночную колонию агробактерии , LBA4404, трансформированную соответствующей бинарной векторной конструкцией, высевали с чашки в 5 мл жидкой среды LB, содержащей канамицин в концетрации 50 мкг/мл и наращивали до максимальной плотности в течение 2-х дней при 27 С[. Из полученной культуры отбирали 1 мл, осаждали в настольной центрифуге, осадок ресуспендировали в 100 мкл 10 мМ MgS04, добавляли 300 мкл 80% глицерина и хранили при -80 С. Данные стоки можно использовать для выращивания культур для последующей агроинфильтрации.
Приготовление грубого экстракта из листьев V.unguiculata для заражения здоровых растений Собранные листья взвешивали, помещали в ступку и растирали с помощью пестика в жидком азоте до состояния порошка. К полученному порошку добавляли 2 объема 0,1 М Na-фосфатного буфера рН 7,0, перемешивали пестиком и фильтровали через двойной слой марли в чистую пробирку. Полученный фильтрат центрифугировали в течение 10 мин, 4500 об/мин, 4С, супернатант переносили в чистую пробирку. Добавляли 0,25 объема раствора NaCl/PEG6ooo ДО конечной концентрации 0,2 М/5% (исходный раствор 1М NaCl/20%PEG6ooo)- Инкубировали 1 час на магнитной мешалке при комнатной температуре. Центрифугировали 15 минут, 4С, 10 000 об/мин, осадок ресуспендировали в 1 мл 10 мМ Na-фосфатного буфера рН 7,0, осветляли центрифугированием в настольной центрифуге Eppendorf, 15 000 об/мин, 10 мин, и супернатант переносили в чистую пробирку. Для инокуляции растений V.angidciilata брали 50 мкл полученного экстракта на лист. Лист посыпали порошком карборунда, наносили 50 мкл экстракта в виде нескольких капель и мягко втирали, стараясь минимально повредить поверхность листа. Далее растение сбрызгивали водой и на сутки помещали в защищенное от прямого света место. После этого выращивали в обычном режиме до появления симптомов вирусной инфекции. Необходимо иметь в виду, что данный экстракт не хранится и использовать его нужно в день получения или максимум на следующий день, хранить при 4С.
Листья растений коровьего гороха V.imguiciilata с симптомами вирусной инфекции собирали, взвешивали, гомогенизировали в жидком азоте и добавляли 2 объема 0,1 М Na-фосфатного буфера рН 7,0. Метод гомогенизации зависел от количества исходного растительного материала. При наличии 1-20 г листьев использовали ступку и пестик, при наличии больших количеств использовали бытовой миксер (блендер). Все растворы предварительно охлаждали, а манипуляции проводили на льду. Полученный гомогенат фильтровали через 2 слоя марли в чистые пробирки и центрифугировали 4500 об/мин, при 4С в течение 20 мин. Супернатант переносили в чистую пробирку, осадок ресуспендировали в 0,25 объема 0,1 М Na-фосфатного буфера рН 7,0, центрифугировали в аналогичном режиме и супернатанты объединяли. Далее к полученному суммарному супернатанту добавляли 0,7 объема смеси н-бутанол-хлороформ 1:1 (v/v) и интенсивно встряхивали в течение 1 минуты в вытяжном шкафу. Центрифугировали 4500 об/мин, при 4С в течение 20 мин для разделения фаз, водную фазу переносили в чистую пробирку. Добавляли 0,25 объема раствора NaCl/PEGeooo до конечной концентрации 0,2 М/5% (исходный раствор 1М NaCl/20%PEG6ooo). Инкубировали 1 час на магнитной мешалке при комнатной температуре. Центрифугировали 15 мин, 10 000 об/мин, 4С, в роторе SS34, осадок ресуспендировали в 10 мМ Na-фосфатном буфере рН 7,0 из расчета 0,5 мл на 1 г веса исходного растительного материала. Центрифугировали 20 мин, 15 000 об/мин, 4С, в роторе SS34, отбирали супернатант. Полученный супернатант ультрацентрифугировали 36 000 об/мин, 2,5 часа, 4С в Т1270 роторе, осадок ресуспендировали в небольшом объеме 10 мМ Na-фосфатного буфера рН 7,0, осветляли центрифугированием в настольной центрифуге Eppendorf, 15 000 об/мин, 10 мин, и супернатант переносили в чистую пробирку. Для определения концентрации вирусных частиц измеряли ОП при 260 нм с учетом, что 1 МГ/МЛ СООТВеТСТВуеТ ОП 260=8,1.
разной длины, и все они необходимы для вирусной инфекции, поэтому использование данного вируса в качестве вектора является сравнительно сложной задачей. БО A1MV способен образовывать вирусные частицы разного размера (20-60 нм) и формы -сферические, эллипсоидные, палочковидные, и форма частиц зависит от размера молекулы РНК в составе вириона [23]. Это говорит о достаточной гибкости белок-белковых взаимодействий между субъединицами БО в составе капсида. В качестве сайта инсерции используется N-конец БО AUV1V, как наиболее экспонированный на поверхности частицы участок. Таким образом, гибридная система презентации представляет собой вектор экспрессии на основе ВТМ, в котором БО A1MV с соответствующим эпитопом экспрессируется под контролем дополнительного субгеномного промотора гена БО ВТМ. Данная система позволила получить химерные частицы, несущие эпитопы размером до 47 а.к.о. без нарушения сборки вирусных частиц. В частности, 40 а.к.о. последовательность, содержащая эпитопы из глико- и нуклеопротеинов вируса бешенства была экспрессирована в растениях Nicotiana benthamiana с помощью описанного подхода. Было показано, что модифицированный БО A1MV собирается в эллипсоидные частицы, несущие на поверхности эпитопы вируса бешенства. Иммунизация мышей очищенными частицами приводит к образованию нейтрализующих антител даже в отсутствии адъюванта и установлению протективного иммунитета против летальной дозы вируса бешенства при оральной иммунизации [24].
В дальнейшем было показано, что вектор на основе тобамовируса может быть успешно использован для презентации и более длинных пептидов без нарушения сборки вирионов. При создании такого вектора был использован подход, разработанный для презентации чужеродных белков на поверхности нитевидных бактериофагов [25]. В частности, было исследовано влияние различных коротких линкеров. Так было показано, что функциональный фрагмент белка А (133 а.к.о.) из Staphylococcus aureus может быть экспрессирован на поверхности вириона TVCV (Turnip Vein Clearing Virus) в растениях N.benthamiana путем слияния его с С-концом БО через гибкий линкер длиной 15 а.к.о. Использовались два типа линкеров: гибкий глицин-богатый линкер (GGGGS)3 и спиральный линкер (ЕАААК)з. Оба линкера обеспечивали высокий выход химерных вирионов, тогда как вектора, не содержащие линкера, были неспособны к образованию функциональных вирионов. Белок А обладает способностью связывать антитела и широко используется для очистки IgG различного происхождения [26]. На основе полученных химерных вирионов был разработан протокол очистки моноклональных антител, чистота препарата составляла более 90%. Данный дизайн вектора обеспечивает презентацию более 2100 копий белка А на вирион, что обеспечивает адсорбцию 2 г антител на 1 г химерных вирионов. Это делает данный подход довольно дешевым и перспективным для очистки антител [27].
Питательные среды и антибиотики
До недавнего времени только короткие эпитопы (до 25 а.к.о.) могли быть успешно экспрессированы в составе белков оболочки, более длинные эпитопы нарушали процесс сборки вирусных частиц . Однако недавно было продемонстрировано, что и более длинные полипептиды, например, функциональный фрагмент Белка А размером 133 а.к.о. может быть эффективно презентирован на поверхности тобамовирусов как С-концевой гибрид с БО с использованием гибкого линкера [151].
Ограничения, связанные с использованием «full virus» стратегии, заставили исследователей пересмотреть основные принципы дизайна вирусных векторов. Это в конечном итоге привело к появлению стратегии «Deconstructed virus», которая в самом общем виде заключается в том, что в составе вектора сохраняются только вирусные элементы, необходимые для эффективной экспрессии гена целевого белка, а остальные функции обеспечиваются не-вируснымн компонентами.
Два элемента векторов первого поколения являются лимитирующими — способность к системному транспорту, которая обеспечивается белком оболочки, и зачастую низкий уровень экспрессии белка интереса, что отчасти можно объяснить тем фактом, что значительная часть метаболических ресурсов инфицированной клетки направляется на синтез белка оболочки вируса. Простейшим решением этих проблем стала элиминация гена белка оболочки и замена системного транспорта на доставку вирусного вектора методом агроинфильтрации с использованием Agrobacteriam. Однако для векторов на основе ВТМ первоначальные попытки применения метода агроинфильтрации оказались о неэффективными, примерно одно заражение на 10 клеток Agrobacterinm. На основании анализа ранних стадий агроинфекции было выдвинуто предположение, что препятствием для образования активных репликонов служит низкая способность лревичного транскрипта транспортироваться из ядра. РНК цитоплазматических вирусов, таких как, например, ВТМ, в естественных условиях никогда не проникает в ядро клетки, и, следовательно, не приспособлена для взаимодействия с механизмами процессинга РНК в ядре. Анализ вирусного генома показал, что многие участки не распознаются как кодирующие последовательности. Таким образом, вектор, являющийся по сути вирусом дикого типа, вероятнее всего подвергается деградации прежде, чем достигнет цитоплазмы. Различные модификации вектора, такие как удаление криптических сайтов сплайсинга, оптимизация кодонового состава, добавление последовательностей растительных интронов позволили получить высокоактивные синтетические Т-ДНК матрицы. При введении таких матриц в ядро клетки методом агроинфильтрации отмечался эффективный процессинг и образование активных репликонов в 93% клеток. Усовершенствованные таким образом вектора обеспечивали одно заражение на 10-20 клеток Agrobacterium [82].
Таким образом, в настоящее время стратегия «Deconstructed virus» основана на использовании Agrobacterium для доставки вирусных векторов в растение. Уже на протяжении нескольких лет агроинфильтрация используется в качестве более эффективной и экономичной альтернативы заражению растений с использованием вирусных частиц, и тем более ДНК- или РНК-инфекционных клонов. Процесс представляет собой инфильтрацию целого растения или отдельных листьев разбавленной суспензией агробактерий, трансформированных соответствующим бинарным вектором, содержащим провирусный репликон в составе Т-ДНК. В данном случае агроинфильтрация заменяет канонические процсссы-первичную вирусную инфекцию и системный транспорт. Амплификация внутри каждой отдельной клетки и межклеточный транспорт обеспечивается репликоном. В зависимости от типа вектора, растения-хозяина и плотности исходной суспензии агробактерий, процесс занимает 4-10 дней, и обеспечивает уровень экспрессии целевого белка до 5 г\кг свежего веса, что соответствует 50% от общего растворимого белка. Т.к. вектор не содержит гена БО, это дает возможность экспрессировать более длинные гены (до 2.3 т.п.н. или белки до 80 кДА). Инфильтрация растений или отдельных листьев может производиться разными способами, например, вручную с помощью шприца без иглы (в лабораторных условиях). Для более масштабных целей используется вакуумная инфильтрация. При этом надземная часть растения погружается в суспензию агробактерий и дается вакуум -0.8-0.9 bar в течение 10-30 сек. [83]. Эта новая стратегия получила название «magnifection» и сочетает в себе достоинства трех систем - скорость амплификации и уровень экспрессии вируса, эффективность заражения агробактерий, и посттрансляционные модификации и низкую себестоимость растительных систем экспрессии. Сходная стратегия недавно была разработана для векторов на основе Х-ВК [152].
К настоящему времени более 50 разнообразных белков различного происхождения и сложности были экспрессированы в растениях с использованием стратегии magnifection.
Использование метода агроинфильтрации также открывает новые возможности для конструирования векторов экспрессии. Компания ICON Genetics (Halle, Germany) разработала уникальную векторную систему экспрессии на основе ВТМ, которая основана на сборке функционального вирусного вектора in planta из отдельных про-векторных модулей с участием сайт-специфических рекомбиназ.
Исходный вектор, адаптированный для агроинфильтрации, создан на основе crMV, который также способен заражать N.tabacum и Arabidopsis thaliana. Для удобства клонирования 5 -участок вектора, включая ген РНК- зависимой РНК полимеразы и часть гена транспортного белка, был взят из близкородственного тобамовируса TVCV (Turnip Vein-Clearing Virus), который на 98% гомологичен crMV на уровне аминокислотной последовательности. Остальная последовательность вектора, включая часть гена транспортного белка, субгеномный промотор гена БО, и З -НТО, принадлежит crMV. Ген БО был заменен на ген GFP. Полученная векторная кассета была клонирована в бинарный вектор между АСТ2 промотором и nos-терминатором для последующей трансформации агробактерии и агроинфильтрации растений N.benthamiana. Таким образом, вектор не способен к системному транспорту, но сохраняет способность к межклеточному транспорту, т.к. содержит ген транспортного белка. Далее данный вектор был разделен на два независимых модуля. 5 -модуль содержит гены РНК - зависимой РНК полимеразы и транспортного белка, субгеномный промотор гена БО, и 1охР сайт. 3 -модуль содержит 1охР сайт, ген целевого белка (в данном случае gfp) и 3 -участок вирусного вектора. Ген целевого белка не может независимо экспрессироваться с 3 -модуля, т.к. в конструкции отсутствует субгеномный промотор.
Известно, что Т-ДНК способны к рекомбинации в растительной клетке [153]. Однако, для обеспечения точной и эффективной сборки про-векторных модулей in planta необходима высокая частота и точность сайт-специфической рекомбинации. В данной векторной системе это достигается введением 1охР сайтов в провекторные модули и одновременной агроинфильтрацией растения бинарным вектором экспрессии рекомбиназы Сге. В качестве возможной и не менее эффективной альтернативы может использоваться другая система рекомбинации, интеграза фага С31 Streptomyces и сайты рекомбинации AttP и AttB. Одна из целей создания данной векторной системы заключалась в возможности получения различных гибридных белков путем рекомбинации про-векторных модулей. Различные 5 -модули могут содержать различные адресные последовательности, сигнальные пептиды, связывающие домены, специфические tag- последовательности для последующей очистки белка или сайты прогеолиза, которые в результате рекомбинации добавляются в рамку к гену целевого белка. Это дает возможность исследовать особенности экспрессии данного белка в различных клеточных компартментах при минимальном количестве стадий клонирования.
Вестерн-блот анализ экспрессии белка нуклеокапсида в растениях N. bentham і'ana и V.unguiculata
Детекцию экспрессии белка нуклеокапсида НВ V в инфицированных тканях растений проводили методом Вестерн-блот (см. Материалы и методы). В качестве положительного контроля использовали рекомбинантный HBcAg из P.pastoris (Fitzgerald, USA).
Анализ препаратов суммарного белка, полученных из листьев растений N.benthamiana, инфицированных векторной конструкцией PVX201/core с использованием анти-HBcAg поликлональных антител кролика (Biomeda) показал накопление белка нуклеокапсида в инфицированных тканях (Рис.11.А)
В препаратах суммарного белка из листьев здоровых растений и растений, инокулированных исходным вектором PVX201, иммунореактивного материала не выявлялось (Рис. 11 .А, дорожки 1-2).
Интенсивная иммунореактивная полоса, соответствующая по молекулярной массе мономеру рекомбинантного HBcAg из P.pastoris, наблюдалась в препаратах суммарного белка из системных листьев 5-ти разных растений N.benthamiana, инокулированных векторной конструкцией PVX201/core (рис.11. А, дорожки 3-7).
Сравнение интенсивности полученных сигналов для разных растений позволяет сделать вывод, что уровень экспрессии HBcAg варьирует от 50 до нескольких сотен мкг HBcAg на 1 г веса свежего листового материала. Полученные результаты также свидетельствуют о том, что HBcAg не подвергается значительной протеолитической деградации и посттрансляционному процессингу в растениях, по крайней мере при транзиентной экспрессии в растениях N. benthamiana.
В случае векторной конструкции pBinPS2/core Вестерн-блот анализ препаратов суммарного белка, полученного из инфицированных листьев растений V. unguiculata не выявил присутствия иммунореактивного материала (данные не показаны). Можно было ожидать, что это обусловлено относительно низким уровнем синтеза белка.
Для проверки возможности каким-то образом сконцентрировать исследуемый материал, было проведено дифференциальное центрифугирование экстрактов, полученных из инфицированных листьев V. ungaiculata.
Вестерн-блот анализ материала, полученного в результате дифференциального центрифугирования, показал наличие четкой полосы, соответствующей по размеру мономеру рекомбинантного HBcAg из P.pastoris. (Fuel 1.Б, дорожка 4).
Данный факт, что экспрессируемый в растениях V. imguiculata белок нуклеокапсида детектируется методом Вестерн-блот после дифференциального центрифугирования, и не детектируется в препаратах суммарного белка, указывает на то, что белок находится в высоко агрегированном состоянии, и не исключено, что в форме вирусоподобных частиц. Кроме того, в образцах, полученных из растений V. unguiculata, как и в контрольном образце рекомбинантного HBcAg из P.pastoris, присутствует полоса, соответствующая по размеру димеру белка нуклеокапсида.
Этот результат согласуется с данными о том, что сборка HBcAg происходит через этап димеризации мономеров белка нуклеокапсида, и такие димеры служат своего рода строительными блоками HBcAg [184].
Образец, полученный из инфицированных тканей V. unguiculata после дифференциального центрифугирования, также содержит некоторое количество материала более высокой молекулярной массы, чем димер белка нуклеокапсида (Рис.11.Б).
Полученные данные могут свидетельствовать о более высокой степени агрегации белка нуклеокапсида. С другой стороны, этот материал может представлять собой продукт неполного протеолитического расщепления с участием 2А-пептида [114], что приводит к образованию S-2A-core гибридного белка, где S-это малый белок оболочки CPMV. Выход частично очищенных методом дифференциального центрифугирования частиц HBcAg составляет приблизительно 10 мкг на 1 г веса свежего листа V. unguiculata.
Для исследования вопроса, способен ли белок нуклеокапсида к самосборке с образованием вирусоподобных частиц HBcAg при экспрессии в растениях с помощью вирусных векторов, была проведена иммуносорбентная электронная микроскопия (ISEM) препаратов, полученных из инфицированных векторными конструкциями растений. В качестве положительного контроля использовали рекомбинантный HBcAg из P.pastoris (Fitzgerald, USA). Анализ сока из растения N. benthamiana, инфицированного векторной конструкцией PVX201/core, показал наличие вирусоподобных частиц, по морфологии сходных с частицами HBcAg из P.pastoris (Рис. 12.Б.).
Анализ материала, полученного из растений V.unguiculata, инфицированного векторной конструкцией pBinPS2/core, после дифференциального центрифугирования, также подтвердил присутствие вирусоподобных частиц HBcAg, по морфологии сходных с частицами HBcAg из P.pastoris. (Рис. 12.В). В данном препарате присутствуют также частицы CPMV, что неудивительно, учитывая их значительное содержание в препаратах после дифференциального центрифугирования.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что белок нуклеокапсида экспрессируется как в составе вектора на основе Х-ВК в растениях N. benthamiana, так и в составе вектора на основе полноразмерной РНК-2 CPMV в растениях V.unguiculata, и что белок нуклеокапсида сохраняет при этом способность к самосборке в вирусоподобные частицы HBcAg. Данные векторные системы могут позволить получать и скринировать конструкции с различными вариантами HBcAg в относительно короткий промежуток времени.
В настоящей работе с помощью вирусных векторов был экспрессирован полноразмерный белок нуклеокапсида, в котором присутствует аргинин-богатый С-концевой участок, содержащий два сигнала ядерной локализации [181]. Известно, что усеченный вариант белка нуклеокапсида, не содержащий С-концевого аргинин-богатого участка, также способен к сборке в вирусоподобные частицы, и, вероятно, возможно использовать и такой вариант белка для экспрессии в растениях.
Заражение растений N.benthamiana и V.unguiculata и характер развития симптомов вирусной инфекции
Векторные конструкции pBinPCP2-M2eH и pBinPCP2-M2eA, как и большинство систем презентации эпитопов на основе CPMV, сконструированы таким образом, что последовательность эпитопа расположена между А1а22 и Рго23 рВ-ЗС петли S-белка оболочки, т.к. данный участок является максимально экспонированным на поверхности вириона [53]. ДСН-ПААГ анализ препаратов некоторых химерных вирусов показал, что значительная пропорция субъединиц S-белка оболочки подвергается протеолитическому расщеплению между двумя С-концевыми остатками эпитопа [222], и сайт протеолиза не зависит от размера и последовательности эпитопа [61].
Таким образом, как уже упоминалось выше, С-концевая часть химерного S-белка оболочки (обозначаемая как S ) состоит из последнего а.к.о. эпитопа и 192 С-концевых а.к.о. S-белка оболочки, тогда как N-концевой участок содержит последовательность эпитопа за исключением последнего а.к. остатка, связашгую с 22 N-концевыми а.к. остатками S-белка оболочки. В нативном вирусе две эти части S-белка оболочки не диссоциируют, а удерживаются посредством нековалентных взаимодействий [57]. Как следствие этого протеолитического расщепления, эпитоп находится не в виде замкнутой петли, а в состоянии, близком к релаксировашюй конформации.
Предотвращение протеолитического расщепления эпитопа или обеспечение конформации, близкой к нативной, могло бы обеспечить более адекватную презентацию конформационных эпитопов на поверхности CPMV.
Высказано предположение, что протеолитическое расщепление каким-то образом зависит от фланкирующей последовательности эпитопа, и была предпринята попытка делегировать или заменить Phe24 S-белка оболочки, т.к. этот гидрофобный остаток вероятно мог инициировать протеолиз [57]. Однако позже было показано, что данные мутации Phe24 не предотвращают протеолиз [58].
Была предпринята попытка экспрессировать конформационные эпитопы в другой петле S-белка оболочки, рС -рС", или сдвинуть сайт инсерции в составе рВ-рС петли на несколько нуклеотидов с целью исследования влияния сайта инсерции на структурные и иммуногенные свойства эпитопа, в частности, особый интерес представляло влияние на степень и сайт протеолиза.
Полученные результаты показали, что протеолиз эпитопа между двумя последними С-концевыми остатками возникает и в случае его экспрессии в рС -рС"-петле S-белка оболочки. Кроме того, были получены данные, что протеолиз имеет место и в случае экспрессии эпитопа в составе L-белка оболочки [21].
Таким образом, вероятнее всего, протеолитическое расщепление пептидов, экспрессированных на поверхности CPMV, является универсальным феноменом. Перемещение сайта инсерции в составе РВ-РС петли на 2-3-нуклеотида ближе к С-концу не изменило ни сайта, ни степени протеолиза эпитопа, перемещение на один нуклеотид изменило сайт протеолиза, но не его степень. Таким образом, закономерности, определяющие сайт и степень протеолиза пептидов в составе CPMV, пока не установлены [58].
Для оценки способности химерных частиц CPMV/M2eH и CPMV/M2eA к индукции специфических антител и выработке сывороточного иммунного ответа, проводили подкожную иммунизацию беспородных белых мышей полученными препаратами, а также контрольным препаратом CPMV/wt. В полученных сыворотках определяли титры специфических антител (IgG) к М2е и CPMV антигенам как описано в разделе «Материалы и методы». Полученные данные показали, что при подкожной иммунизации CPMV/M2eH и CPMV/M2eA эффективно индуцировали антитела против вирусных белков оболочки, однако титры анти-М2е антител были существенно ниже (Таблица 4).
Титры IgG антител к CPMV/wt в группе, иммунизированной CPMV/M2eH, в 4 раза выше, чем в группе, иммунизированной CPMV/M2eA, что может быть связано с более высокой дозой антигена, использованного при иммунизации (50 и 35 міст на мышь соответственно).
Выявленная таким образом низкая иммуногенность М2е-эпитопа в составе химерных частиц CPMV/M2eH не позволяла рассчитывать на эффективные протективные свойства полученного препарата. Эти предположения были подтверждены в опытах по заражению иммунизированных мышей летальными дозами вируса гриппа.
Данные, представленные в таблице 5, показывают, что исследованный образец химерных вирусных частиц CPMV/M2eH после трехкратного подкожного введения обнаружил умеренное протективное действие от летальной гриппозной инфекции, вызванной LD70 патогенного штамма вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1). Количество выживших животных в контрольной группе, иммунизированной диким штаммом CPMV/wt на 14-е сутки после заражения, составила 33,3%, в опытной группе после подкожной иммунизации — 66,6%. После заражения вакцинированных животных дозой вируса LDgo протективное действие не было обнаружено.
Причина слабой иммуногенности М2е-эпитопа в составе CPMV до конца не ясна, однако можно предположить, что это каким-то образом связано с конформацией, которую принимает данный эпитоп в результате протеолиза, характерного для систем презентации на основе CPMV, и которая, вероятнее всего, отличается от нативной конформации данного эпитопа в составе вируса гриппа А.
Как показали некоторые исследования, не все эпитопы в составе CPMV обладали способностью вызывать образование нейтрализующих антител и, как следствие, протективными свойствами. Одним из первых эпитопов, чья иммуногенность была исследована на животных, был 14 а.к.о. эпитоп риновируса-14 человека (HRV-14), представляющий собой участок с 85 по 98 а.к.о. VP1, известный как NImlA-сайт. Внутримышечная и подкожная иммунизация кроликов химерными вирусными частицами приводила к образованию антител против данного эпитопа, но антитела не обладали нейтрализующей активностью [53].
Данный результат дал повод для дальнейшего изучения факторов, которые влияют на иммуногенность эпитопа в составе химерной вирусной частицы. Было показано, что иммунологические свойства эпитопа каким-то образом зависят от сайта инсерции на поверхности молекулы-носителя. Различия в иммунологических свойствах были интерпретированы как следствие различных конформации, которые может принимать один и тот же эпитоп в зависимости от сайта инсерции. Однако, до определенного момента экспериментальных подтверждений этой гипотезы получено не было.
Для исследования данного вопроса была получена кристаллическая структура химерных вирусных частиц CPMV - NIml А [57], что позволило сопоставить конформацию данного эпитопа в составе частиц CPMV и нативную конформацию эпитопа в составе риновируса-14, структура которого была на тот момент уже известна [238]. На поверхности риновируса-14 структура NIml А-эпитопа стабилизируется внутрипетельными водородными связями, вследствие чего эпитоп имеет вид петли на поверхности вириона риновируса, расстояние между первым и последним а.к.о. составляет 9А. В составе CPMV NlmlA
Похожие диссертации на Вирус мозаики коровьего гороха как вектор для получения рекомбинантных антигенов вирусов гепатита B и гриппа A в растениях
