Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 9
Организация генома втм и вирусный цикл 9
Плазмодесмы и тб втм 11
Тб-обусловленный транспорт вирусной рнк 14
Клеточные компоненты,участвующие в танспорте 16
Роль телец включения 17
Роль микротрубочек 19
Роль микрофиламентов 20
Другие хозяйские факторы, участвующие в 21
Инфекции функциональные домены тб втм 21
Фосфорилирование в растениях 23
Ратительные мап киназы 25
Общая характеристика 25
Мапк 28
Мкк 30
Sipk и wipk-киназы, участвующие в ответе на стресс 31
Растительные казеиновые киназы i и ii (кк1 и кк2) 33
Фосфорилирование тб фитовирусов 34
Фосфорилирование ТБ ВТМ 36
Материалы и методы 38
Анализ пептидов 38
Кинирование белков и получение триптических пептидов 38
Двумерное картирование пептидов и фосфоаминокислотный анализ 38
ВЭЖХ 39
Анализ аминокислотной последовательности пептидов 39
Выделение препаратов различных клеточных фракций 40
Получение препарата фракции клеточных стенок 40
Получение препарата фракции Р30 40
Получение микросомальных фракций 40
Анализ микросомальных фракций 40
Кинирование in vitro 40
Анализ влияния двухвалентных катионов на киназную активность 41
Анализ присутствия ВІР 41
Фосфорилирование in vitro 41
Протеинкиназа С 41
Фракция клеточных стенок 41
Кинирование в геле 42
Получение рнп-комплексов 42
Анализ рнп на нитроцеллюлозных фильтрах 42
Выделение и заражение протопластов 43
Конструирование плазмид 44
Получение конструкций с С-концевыми мутантами 44
Получение конструкций с мутациями в положении 104 45
Транскрипция, заражение растений и анализ заражения 46
АСМ 47
Формирование РНП 47
Измерения с помощью АСМ 47
Работа с агробактериями 47
Трансформация агробактерий 47
Агроинфильтрация 47
Изучение стабильности белков 48
Получение антител к вір 48
Круговой дихроизм 49
Результаты и обсуждение 50
Изучение влияния с-конца тб втм на свойства рнп 50
Определение структуры комплексов рнк-тб втм методом асм 53
Изучение роли с-концевых аминокислот тб в транспорте втм 58
Характеристика киназнои активности эр-обогащенных фракций 60
Определение сайтов фосфорилирования тб втм 62
Микросомальной фракцией изучение влияния треонина в положении 104 66
Транспортные свойства тб втм изучение стабильности мутантных тб 70
Выводы 72
- Тб-обусловленный транспорт вирусной рнк
- Ратительные мап киназы
- Двумерное картирование пептидов и фосфоаминокислотный анализ
- Определение структуры комплексов рнк-тб втм методом асм
Введение к работе
Изучение механизма межклеточного транспорта вирусной инфекции является одной из проблем современной вирусологии растений. В момент заражения растения вирусом лишь незначительное число клеток оказывается инфицированным. Для развития инфекции необходимо, чтобы вирус перемещался от пораженных клеток к здоровым. Межклеточный (ближний) транспорт вирусной инфекции в растениях осуществляется преимущественно через плазмодесмы, а перенос вирусного инфекционного материала в соседние листья (т. н. дальний транспорт) происходит по клеткам флоэмы.
Долгое время считалось, что межклеточный транспорт вирусов - это генетически пассивный процесс. В настоящий момент доказано, что он кодируется вирусным геномом и осуществляется при помощи одного или нескольких вирусспецифических транспортных белков (ТБ) (Atabekov and Dorokhov, 1984; Atabekov and Taliansky, 1990). Именно ТБ играют ключевую роль в переносе вирусного генома внутри инфицированной клетки к плазмодесмам, далее в распространении вирусной инфекции через плазмодесмы по клеткам паренхимы и, в случае некоторых вирусов, в транспорте вирусного генома по сосудам флоэмы (Carrington et ah, 1996). Таким образом, функционирование транспортных белков является необходимым условием развития инфекционного процесса. Очевидно, что прогресс в исследовании вирусных ТБ, их взаимодействий с вирусными нуклеиновыми кислотами и различными вирусными и клеточными белками открывает широкие перспективы для создания новых методов борьбы с вирусными инфекциями растений.
Одной из посттрансляционных модификаций ТБ, необходимых для их нормального функционирования, может являться их фосфорилирование. Возможность фосфорилирования фитовирусного транспортного белка была впервые показана Watanabe et al. (1992) на примере ТБ ВТМ. В течение последующих лет накапливалось много данных о фосфорилировании ТБ вирусов растений in vivo и in vitro. Однако до сих пор не определен точный механизм фосфорилирования ТБ. Более того, суммируя проведенные исследования, невозможно четко сформулировать роль фосфорилирования в позитивной или негативной регуляции транспорта вирусов растений. Возможно, что неоднозначность получаемых различными исследователями результатов отражает многофункциональность фосфорилирования.
Целью настоящей работы являлась идентификация аминокислот в составе ТБ ВТМ, подверженных фосфорилированию микросомальной фракцией и фракцией клеточных стенок in vitro, а также последующее изучение функциональной роли этих аминокислот с помощью мутационного анализа.
Тб-обусловленный транспорт вирусной рнк
Многие РНК- и ДНК- содержащие вирусы передвигаются из клетки в клетку в виде вирионов, сильно изменяя при этом структуру ПД (Wellink et al., 1993; Kasteel et al., 1997). Считается, что BTM и ряд других РНК-содержащих вирусов используют иной подход и передвигаются из клетки в клетку в виде вытянутых рибонуклеопротеидных комплексов (РНП). В случае ВТМ для такого переноса нужен только ТБ (Dawson et al., 1988). Было показано, что ПД растений, трансгенных по ТБ, содержат фибриллярные структуры, окрашиваемые антителами к ТБ (Ding et al, 1992), а в остальном заметных изменений ПД не происходит. Было показано, что ТБ связывается с РНК (и одноцепочечной ДНК) in vitro с образованием протяженного ТБ:РНК комплекса (Citovsky et al, 1990, 1992; Kiselyova et al., 2001). Диаметр таких комплексов был оценен в 2,0-3,5 нм. Было высказано предположение, что комплексы ТБ:РНК представляют собой отдельный пул вирусной РНК, предназначенный для транслокации в соседнюю клетку и высвобождаемый для этого из реакции репликации (Citovsky et al., 1990). РНК и ТБ-содержащие РНП были выделены из зараженных ВТМ растений (но не из растений, инокулированных температурочувствительным мутантом ТБ при непермессивной температуре) (Dorokhov et al, 1983,1984). Karpova et al. (1997) было показано, что при комплексообразовании ТБ с вирусной РНК трансляция РНК ингибируется in vitro и in vivo в протопластах. Однако, те же комплексы транслируемы в растении, где, как предполагают авторы, РНП подвергаются модификации при прохождении через ПД. Фосфорилирование ТБ in vitro протеин киназой С снимает эффект ингибирования трансляции (Karpova et al, 1999). Еще одним возможным подтверждением существования комплексов вРНК с ТБ in vivo считаются результаты опытов по микроинъекции белков в клетки трихом N. clevelandii. В этих экспериментах было продемонстрировано, что репортерный белок Р-глюкоуронидаза (GUS) может транспортироваться в соседние клетки, только если он ковалентно слит с ТБ, но не при их совместной инъекции (Waigmann and Zambryski, 1995).
Следовательно, ТБ влияет на ПД не опосредованно, а как цис-медиатор, и для транспорта макромолекул ТБ необходимо быть с ними связанными. Инъецированный ТБ может не только сам двигаться из клетки в клетку, но и помогать межклеточному транспорту совместно с ним инъецированных нуклеиновых кислот (Waigmann et al, 1994; Fujiwara et al, 1993; Noueiry et al, 1994; Ding et al, 1995). Однако все представленные доказательства являются лишь косвенным подтверждением способности вРНК транспортироваться в виде простого комплекса с ТБ. Более того, существует ряд фактов, который противоречит существованию таких комплексов в растворимом виде. Например, в работах Hemlein et al. (1998) и Mas and Beachy (1999) была показана колокализация ТБ ВТМ с вирусными репликазой и РНК на мембранах ЭР (см. ниже). КЛЕТОЧНЫЕ КОМПОНЕНТЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В ТРАНСПОРТЕ. Продукция функционального ТБ, ковалентно сшитого с репортерным зеленым флуоресцирующим белком, green fluorescent protein (GFP), позволила проанализировать внутриклеточную локализацию ТБ в растениях и протопластах и связать этапы развития инфекции с различными клеточными компонентами. Приведенное здесь описание локализации ТБ-GFP основано на данных Heinlein et al. (1995, 1998), Epel et al. (1996), Padgett et al. (1996), Mas and Beachy (1998, 1999). Стоит отметить, что все эти авторы использовали в своих микроскопических экспериментах ВТМ, лишенный БО, так что описываемая картина инфекции характерна именно для ближнего транспорта. Инокулирование ВТМ с ТБ-GFP в N. benthamiana или в другие подверженные инфекции растения приводит к образованию радиально растущих инфекционных сайтов уже через 3 дня. Флюоресценция в этих сайтах имеет форму кольца. Внешний радиус кольца соответствует переднему фронту инфекции, т.е. ее самым ранним стадиям, где ТБ виден только в районе ПД. Образования неровной формы, наблюдаемые в местах самой яркой флюоресценции, сразу вслед за лидирующим фронтом, принято называть тельцами включения, и они образуются в тесной связи с кортикальным ЭР. В ходе развития инфекции ТБ переходит с ЭР на микротрубочки, которые хорошо видны на внутреннем радиусе флюоресценции, соответствующем поздним стадиям инфекции. При этом во всех клетках, где наблюдается какая-либо флюоресценция, ТБ локализуется и в районе плазмодесм. Интересно, что внутри светящегося кольца флюоресценция, связанная с ТБ, затухает. Это соответствует данным Padgett et al. (1996) о том, что ТБ-GFP накапливается в клетках растений лишь временно с максимумом через 22 часа после начала инфекции, а затем разрушается. Также показано, что ТБ специфически деградирует в ходе инфекции: добавление к зараженным ВТМ протопластам ингибиторов 26S протеосомы приводило к накоплению убиквитинилированного ТБ (Reichel and Beachy, 2000). В дополнение к описанным сайтам локализации необходимо отметить еще две формы свечения ТБ-GFP, происхождение которых менее ясно. В протопластах ТБ обнаруживается в районе плазматической мембраны в форме точек (англ. puncta) (Heinlein et ai, 1998). Предполагалось, что эти точки находятся в районе ПД, которые существовали в клетке до образования протопласта. Позже такие же структуры были обнаружены и в эпидермальных клетках (Reichel and Beachy, 1998). По другой гипотезе, точки могут быть локализованы в местах прикрепления цитоплазматических нитей к ЭР, плазматической мембране или клеточной стенке, как это наблюдается при плазмолизе растительных клеток (Oparka et ai, 1994; Oparka, 1994; Pont-Lezica et ai, 1993). Обработка протопластов брефельдином A - агентом, разрушающим эндомембранную систему клетки (Henderson et ai, 1994; Staehelin and Driouich, 1997) - мешает образованию точек на ранних (но не на поздних) стадиях инфекции. Следовательно, сборка ТБ-GFP в такие структуры или присоединение белка к ним может отражать этап сектреторного пути ТБ (Heinlein et ai, 1998). Цитохалазин D уменьшает количество ТБ-GFP, накапливаемого в точечных структурах, указывая на участие микрофиламентов в присоединении ТБ к таким сайтам. ТБ-GFP также обнаруживается в составе длинных структур, вытягивающихся с поверхности протопластов (Heinlein et al, 1998; Mas and Beachy, 1998).
Считается, что такие удлинения (англ. protrusions) отражают способность ТБ ВТМ образовывать тубулы при транслокации через ПД. Последние данные Mas and Beachy (1999) показывают, что эти удлинения содержат вРНК, и для такой ее локализации необходим ТБ. Удлинения не исчезали после обработки оризалином, вещством, деполимеризующим микротрубочки (Hugdahl and Morejohn, 1993) или цитохалазином D, но окрашивались DIOC6, краской, связывающейся с мембранами ЭР. На основе этих данных Mas and Beachy (1999) делают вывод, что описываемые удлинения могут быть аналогами плазмодесмальных десмотрубочек. Роль телец включения Тельца включения, наблюдаемые в инфицированных клетках, содержат, кроме ТБ, репликазу (Heinlein et al.t 1998) и вирусную РНК (Mas and Beachy, 1999), и, по всей вероятности, являются сайтами репликации вируса и синтеза его белков. Эти тельца могут происходить из кортикального ЭР, где ТБ локализуется на ранних стадиях инфекции (Heinlein et al, 1998; Mas and Beachy, 1999). Более ранние исследования методом электронной микроскопии показали, что репликация ВТМ ассоциирована с некими включениями или вироплазмами, которые увеличиваются в ходе инфекции и образуют трубчатые «Х-тельца», связанные с богатым рибосомами матриксом (Saito et al, 1987; Hills et al, 1987). Такая компартментализация ВТМ на ЭР, вероятно, обеспечивает эффективные трансляцию, репликацию и внутриклеточный транспорт вируса. Кроме того, мембраны ЭР, возможно, играют немалую роль в конфигурации репликационного комплекса. Так, Osman and Buck (1996) показали, что РНК-полимеразная активность репликазы связана с ее локализацией на мембранах: переведение полимеразы в растворимую форму полностью ингибировало ее активность; т.е. мембраны необходимы для синтеза РНК. Reichel and Beachy (1998) опубликовали данные о поведении агрегатов ЭР во время инфекции ВТМ. Ими было показано, что эти агрегаты формируются временно, и их образование и исчезновение коррелирует с накоплением и деградацией ТБ. Более того, такие же агрегаты образовывались в клетках, временно продуцирующих только ТБ-GFP. Интересно, что при экспрессии в протопластах ВТМ, не кодирующего ТБ (ВТМ-ДТБ), или после обработки протопластов цитохалазином D, деполимеризующим актин, тельца включения, содержащие вРНК, не образовывались (Mas and Beachy, 1999). Т.е. образование телец включения на ЭР является свойством ТБ и связано с полимеризацией актина. Однако, известно, что ТБ не нужен для репликации вируса (Meshi et al, 1987). Более того, тот факт, что вирусная РНК ВТМ-ДТБ продолжала локализоваться на ЭР, говорит о том, что ассоциация с ЭР является в свойством РНК и/или репликазы и не требует присутствия ТБ (Mas and Beachy, 1999). Последние исследования показали, что делеция 55 С-концевых аминокислот в ТБ ВТМ приводит к неспособности белка образовывать тельца включения, но он продолжает обеспечивать транспорт вируса, хотя и с меньшей эффективностью (Boyko et al, 20006). Таким образом, ТБ-зависимая агрегация ЭР в тельца включения может лишь увеличивать эффективность распространения вируса, но не являться критичной для самого транспорта.
Ратительные мап киназы
Общая характеристика За последние несколько лет стало очевидно, что МАПК каскады играют наиболее важную роль в путях передачи сигнала в растениях, в дрожжах и в млекопитающих. Путей активации МАПК насчитывается множество: стимулом могут служить самые разнообразные агенты, начиная с факторов роста и цитокинов до облучения радиацией или осмотического стресса (рис. 6). Основой пути МАПК является трехкомпонентныи модуль, консервативный от дрожжей до человека (Widmann et al, 1999) (рис. 6). Первой киназой такого модуля является киназа киназы МАПК (МККК) (Fanger et al, 1997). Сама МККК может быть активирована киназой (МКККК) или путем взаимодействия с маленькими GTP-связывающими белками семейства Ras или Rho. МККК является серин-треониновой киназой и активирует киназу МАПК (МКК) в этом каскаде (Siow et al, 1997). МКК, в свою очередь, узнает характерный мотив Thr-Xyr в активационной «Т-петле» МАПК (Johnson et al, 1996). Кристаллографические данные говорят о «двудольной» трехмерной структуре МАПК (Wang et al, 1997; Wilson et al, 1996; Zhang et al, 1994) с активным центром, погруженным между двумя долями (рис . 7). МАПК является последним звеном в трехкиназном модуле и она фосфорилирует остатки серина или треонина своих субстратов. Наиболее часто встречающимися субстратами МАПК являются транскрипционные факторы, однако, МАПК способна фосфорилировать и многие другие субстраты, такие как иные протеинкиназы, фосфолипазы, цитоскелет-связанные белки и т.д. (Treisman et al, 1996) (рис. 6). Почему для активации МАПК необходимо еще по крайней мере две киназы? Двойное фосфорилирование МАПК по остаткам Thr и Туг обеспечивается МКК путем узнавания третичной структуры МАПК вокруг мотива Thr-Xyr, где X - Glu, Gly, Pro или Asp. Такие комбинации MKK -МАПК являются очень специфическими и позволяют тонко регулировать МАПК Геном растения A.thaliana насчитывает 20 генов МАПК. Взяв этот список за основу, и добавив к ним открытые МАПК из других растений, Ichimura et al. (2002) разделили известные МАПК на четыре основные группы (A-D) (Рис. 8). Из них группы А-С принадлежат одному подклассу, который содержит мотив TEY в активационном домене, а группа D - к другому, содержащему мотив TDY. Киназ ы группы А наиболее часто участвуют в ответах на гормональный стресс или на стрессы окружающей среды. Так, МРК6 из Arabidopsis активируется в ответ на окислительный стресс или воздействие различных абиотических веществ (Kovtun et al, 2000; Nuehse et al., 2000; Ichimura et al., 2000; Desikan et al, 2001; Yuasa et al, 2001). Табачная киназа SIPK, сначала определенная в качестве киназы, индуцируемой салициловой кислотой, Рис. 8. Филогенетическое дерево и доменная структура растительных МАП киназ. Приведено по Ishimura et al (2Ш2). также, как оказалось, участвует в ответе на биотические и абиотичесие стрессы (Zhang and Klessig, 2001).
Похожим образом ведут себя и SIMK из люцерны (Munnik et al, 1999) и МРКЗ из Arabidopsis (Mizoguchi et al, 1996). Табачная киназа WIPK участвует в передаче сигнала в ответ на ранение листа (Seo et al, 1995, 1999). Подробнее о SIPK и WIPK см. ниже. Несколько хуже изученная группа В включает в себя киназы, не только вовлеченные в ответ на стрессы окружающей среды, как это было показано для МРК4 из Arabidopsis (Ichimura et al, 2000; Desikan et al, 2001), но и регулирующие деление клеток. ММКЗ из люцерны и табачная Ntf6 активируются на определенной стадии клеточного цикла, а во время телофазы демонстрируют специфическую локализацию в фрагмопластах (Calderini et al, 1998; Boegre et al, 1999). Данные о группе С ограничены. Было показано, что продукция МРК7 из Arabidopsis происходит в зависимости от циркадного ритма растения (Schafer et al, 2001). Общей структурной особенностью групп А и В является наличие у их представителей докинг-домена с С-конца от активационного мотива. Этот домен выполняет функцию связывания с МКК, фосфатаз и субстратов киназ, и содержит последовательность LHLHYDxxDExxDEEpxC (где х -любая аминокислота) (Tanoue et al, 2000). Пары кислых аминокислот (D и Е) важны для взаимодействия МАПК с кластерами основных аминокислот, найденными в МКК. Гидрофобные аминокислоты (L,H и Y) взаимодействуют со своими аналогами (LxLxL) в докинг-доменах МКК (Tanoue et al, 2000). Докинг-домен у киназ группы С несколько изменен по сравнению с выше описанным. Группа D протеинкиназ интересна тем, что объединяет МАПК с мотивом TDY в Т-петле и более протяженным С-концом по сравнению с группами А-В (рис. 8). Кроме того, у белков этой группы отсутствует докинг-домен. Два изученных представителя этой группы BWMK1 из риса и TDY1 из люцерны индуцируются распространением грибов и ранением листа, соответственно (Не et al, 1999; Schoenbeck et al, 1999). Универсальным методом для изучения МАПК является так называемый метод фосфорилирования в геле. Суть этого метода заключается в том, что субстрат МАПК полимеризуют в геле, в котором впоследствии разделяют растительные экстракты электрофорезом в присутствии ДСН. Для определения работающих киназ гель после ренатурации инкубируют в присутствии [у32Р]АТР и киназного буфера. Обычно в геле полимеризуют субстрат МАПК myelin basic protein, MBP. Более того, считается, что способность ренатурировать после ДСН-ПААГ электрофореза присуща именно МАПК (Wrzaczek and Hirt, 2001; Zhang and Klessig, 2001). Еще один часто используемый метод анализа - это иммунодетекция МАПК антителами к фосфорилированному мотиву pThr-Glu-pTyr или к пептиду, общему для членов одного МАПК-семейства. Наконец, очистка активного фермента и последующее клонирование его гена часто завершают исследования МАПК и делают результаты неоспоримыми. МКК В геноме Arabidopsis насчитывается 10 МКК, что составляет половину от всех МАПК. Предполагается, что одна МКК может активировать несколько МАПК, обеспечивая таким образом взаимную регуляцию между различными путями передачи сигналов. Сравнивая последовательности известных МКК, Ichimura et al. (2002) сгруппировали их в четыре группы A-D (рис. 9). Общей особенностью всех МКК является наличие связывающего МАПК докинг-домена с последовательностью [K/R][K/R][K/R]x(l-5)[IJI]x[L/I] (Bardwell and Thorner, 1996), а также сайта фосфорилирования S/TxxxxxS/T (Yang et al., 2001), активируемого MKKK.
Основываясь на данных фосфорилирования in vitro и дрожжевом двугибридном анализе МКК1 и МКК2 из Arabidopsis группы А действуют в каскаде, активируя МРК4 (Huang et al, 2000; Ichimura et al, 1998; Mizoguchi et al, 1998; Matsuoka et al, 2002). MKK6 из Arabidopsis сходна с табачной NtMEKl, которая участвует в делении клетки и активации Ntf6 (Calderini a/.,2001). МККЗ из Arabidopsis и NPK2 из табака принадлежат к группе В и обладают необычной структурной особенностью: в С-конце этих белков находится сайт связывания фактора 2 ядерного транспорта (NTF2, nuclear transport factor 2). NTF2 - небольшой белок, участвующий в импорте комплексов RAN (Ras-related nuclear protein) с GTP из ядра и связывающийся с одним из нуклеопоринов (Quimby et al, 2000). Охарактеризованные МКК из группы С активируют МАПК группы А. Так, SIMKK активирует SIMK в протопластах петрушки (Kiegerl et al, 2000), а временная суперпродукция табачной NtMEK2 приводит не только к активации SIPK и WIPK, но и к смерти клеток (Yang et al, 2001, а также см. ниже). Более того, трансформация Arabidopsis МКК4 и МКК5 также приводит к подобным эффектам (Ren et al, 2002). К сожалению, данные о функциях МКК группы D пока не известны. Сведения о большой группе известных растительных МККК разрозненны и противоречивы (только геном Arabidopsis насчитывает 52 МККК), поэтому они не приведены в этом обзоре. SIPK и WIPK - киназы, участвующие в ответе на стресс. С точки зрения фитовирусологии наиболее важными являются МАПК, участвующие в ответах на внешние стрессы и особенно на заражение растений патогенами. Некоторые растительные МАП киназы вовлечены в позитивную или негативную регуляции защиты растения от болезней (Asai et al, 2002; Frye et al, 2001; Innes, 2001; Petersen et al, 2000; Tena et al, 2001; Zhang and Klessig, 2001). Так, инфекция растений табака, несущих N ген, вирусом табачной мозаики приводит к активации двух табачных МАПК - SIPK и WIPK (Zhang and Klessig, 19986). Обе эти МАПК активируются и в ответ на Avr9, грибковый фактор из Cladosporiun fulvum (Romeis et al, 1999). Кроме того, другие видонеспецифичные факторы, такие как элицитины из Phytophtora spp., грибковые элиситоры из клеточных стенок или бактериальный элиситор гарпин также могут активировать одну или обе эти киназы (Lee et al, 2001; Suzuki et al, 1999; Zhang et al, 1998, 2000). Эти данные дают возможность предполагать, что SIPK и WIPK - киназы, к которым сходятся сигналы от многих патогенов или связанных с ними элиситоров. Ингибирование активации SIPK и WIPK стауроспорином приводит к супрессии клеточной смерти в суспензионной культуре после обработки ее грибковым элицитином (Zhang et al, 2000).
Двумерное картирование пептидов и фосфоаминокислотный анализ
Рекомбинантные 6xHisB ВТМ или его мутанты с концентрацией 0,2 мкг/мкл (50-100 мкг) были инкубированы в киназном буфере (20 мМ HEPES, рН 7.4, 50 мМ КС1, 5мМ МпС12) в присутствии микросомальной фракции с максимальной киназной активностью (1/20 общего объема реакционной смеси) и 100 иКи [у-32Р]-АТФ (г. Обнинск) при комнатной температуре в течение 30 минут. Экстракция белков из мембран производилась в течение 1 часа при комнатной температуре в буфере, содержащем 6М GuCl (ICN), рН 8.0, при постоянном перемешивании. Далее белки связывались на колонке с Ni-NTA агарозой (QIAGEN) в том же буфере. Промывки и снятие проводились в соответствии с рекомендациями производителя. Очищенные белки иммобилизовали на заранее подготовленной по прилагаемому протоколу тиопропил сефарозе (Sigma) в буфере для нанесения (6М GuCl, 0.2М Tris-HCl, рН 7.5) в течение 4 часов при комнатной температуре. После смены буфера для нанесения на 0.1М бикарбонат аммония, рН 7.8, к белку, связанному с носителем, добавляли трипсин (sequencing grade, Sigma) в соотношении субстрат:фермент 50:1 и инкубировали ночь при 37С. Полученные пептиды, включающие 90% радиоактивного материала, снимали водой и упаривали досуха на вакуумном испарителе, а затем трижды ресуспендировали в 300 мкл воды и снова упаривали досуха. Двумерное картирование пептидов и фосфоаминокислотный анализ. Упаренную смесь пептидов растворяли в 10 мкл буфера первого направления пиридин:бутанол:уксусная кислота:вода (1:2:1:36), рН 4.72. В дальнейшей работе использовали прибор для двумерного картирования HTLE-7002 фирмы C.B.S. Scientific Со. Анализы проводили в соответствии с указаниями производителя. Кратко, для двумерного картирования пептидов раствор пептидов наносили на целлюлозную пластину и подвергали электрофорезу в буфере первого направления в течение 50 минут при 1000 В. Разделение пептидов во втором направлении проводили в стандартной хроматографической смеси (пиридин:бутанол:уксусная кислота:вода, 2,6:2:1:1) в течение 18-19 часов при комнатной температуре в хроматографической камере той же фирмы. Затем пластины высушивали и авторадиографировали.
Для фосфоаминокислотного анализа пептиды элюировали с целлюлозной пластины буфером рН 1,98 (муравьиная кислота:уксусная кислота:вода, 1:3:16) и инкубировали 1 час в 6,8 М НС1 при 110С. После упаривания под вакуумом перевар снова переводили в буфер рН 1,98 и добавляли смесь стандартов фосфоаминокислот (Sigma) до конечной концентрации 133 мкМ. Полученную смесь разделяли в первом направлении в буфере с рН 1,98 при 1500 В в течение 20 минут, а во втором - в буфере с рН 3,5 (уксусная кислота:пиридин:вода, 1:0,1:8,9) при 1300 В в течение 15 минут. После высушивания, положение фосфоаминокислотных стандартов определяли опрыскиванием платы раствором 0,5% нингидрина в ацетоне, а положение меченных аминокислот - авторадиографией. ВЭЖХ Для анализа методом ВЭЖХ использовали приблизительно 0.5 мг ТБ ВТМ или его мутантов. Их кинирование, очистка и обработка трипсином проводилась как описано выше. После обработки трипсином белки с тиопропил сефарозы снимали 500 мкл буфера, содержащего 6М GuCl и 0.2М Tris-HCl, рН 7.5. Препарат анализировали обращенно-фазовой ВЭЖХ в хроматографической системе Beckman 344. 100 мкл элюата наносили на С-18 колонку 4,6x250 мм (Beckman) и элюировали градиентом ацетонитрила (0-50% в течение 60 минут, 50-60% - 10 минут и 60-100% - 15 минут) в 0,1% трифторуксусной кислоте. Хроматографию проводили со скоростью потока 1 мл/мин; элюат отслеживали снятием поглощения при 215 и 280 нм. Фракции, соответствующие пикам, собирали в пробирки, и измеряли содержание радиоактивного материала по Черенкову. Анализ аминокислотной последовательности пептидов Радиоактивно меченные фракции упаривали под вакуумом. Их N-концевой сиквенс проводили реакциями Эдмана с использованием автоматической системы Precise cLC Protein Sequencing System (модель 491, РЕ Applied Biosystems). Фенилтиогидантоиновые производные аминокислот анализировали, используя РТН Analyzer (модель 120А, РЕ Applied Biosystems). ВЫДЕЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ РАЗЛИЧНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЙ Получение препарата фракции клеточных стенок. Выделение фракции клеточных стенок (КС-фракции) N.tabacum или N. benthamiana проводили по методу, описанному Citovsky et al., (1993). Листья гомогенизировали в 5х объеме буфера Н (0.1 М HEPES, рН 7.4, 10 мМ ЭДТА, 5 мМ ДТТ, 1мМ PMSF) с добавлением 1% Тритона Х-100. После центрифугирования (lOOOg, 5 мин при +4С) осадок ресуспендировали в 10 объемах буфера Н + 1% Тритон Х-100 и повторяли центрифугирование. Подобную очистку (промывку в 10 объемах буфера) повторяли 2 раза с использованием буфера Н + 1% Тритона Х-100 и затем 2 раза - буфером Н без добавления Тритона Х-100. Полученную белую суспензию использовали для кинирования белков. Получение препарата фракции РЗО Листья гомогенизировали в буфере 2 объемах HI (0.1 М HEPES, рН 7.4, 10 мМ ЭДТА, 5 мМ ДТТ, 5 мМ NaF, 0.1 мМ Na3V04, 0,1 мкМ окадаиковой кислоты) и отфильтрованы через мембрану Miraclothe. К супернатанту добавляли немного целита и центрифугировали 10 минут при 10 тыс.об. (операцию проделывали трижды). Растворимую фракцию центрифугировали при 30 тыс. g, 30 минут. Осадок (фракция РЗО) использовали для получения микросомальных фракций. Получение микросомальных фракций Выделение микросомальных фракции проводили по методу описанному Reichel and Beachy (1998). Осадок РЗО тщательно ресуспендировали в 500 мкл буфера HI и разделяли в сахарозном градиенте 18%-55% при 100 тыс. g в течение 8 часов. Для анализа градиент раскапывали на фракции по 600 мкл. Получившиеся 18 фракций анализировали на наличие киназной активности. АНАЛИЗ МИКРОСОМАЛЬНЫХ ФРАКЦИЙ Кинирование in vitro 1 мкг рекомбинантного ТБ ВТМ фосфорилировали в киназном буфере в присутствии 5 мкКи [у- Р]-АТФ и 1/20 объема реакционной смеси каждой из микросомальных фракций. После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре эффективность включения радиоактивной метки анализировали электрофорезом по Лэммли (Laemmli, 1970). Белки в геле фиксировали с помощью Кумасси и радиоавтографировали. Анализ влияния двухвалентных катионов на киназную активность 1 мкг рекомбинантного ТБ ВТМ фосфорилировали в присутствии 5 мкКи [у- Р]-АТФ, 1/20 объема реакционной смеси микросомальной фракций с максимальной киназной активностью в различных киназных буферах. Общими составляющими этих буферов были 0.1 М HEPES, рН 7,4 и 50 мМ КС1. Каждый из киназных буферов содержал 1, 5 или 10 мМ Mg2+, Мп2+ или Са2+. После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре эффективность включения радиоактивной метки анализировали электрофорезом по Лэммли (Laemmli, 1970). Белки в геле фиксировали с помощью Кумасси и радиоавтографировали. Анализ присутствия ВІР 10 мкл каждой из микросомальных фракций прогревали с буфером для нанесения (2% ДСН, 15% глицерин, 5% Р-меркаптоэтанола) и проводили электрофорез по Лэммли.
После переноса белков на PVDF мембрану, иммуноблотинг проводили с антителами к ВІР в разведении 1:10000. Анализ связывания антител проводили системой ECL (Amersham). ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ IN VITRO Протеинкиназа С Фосфорилирование ТБ ВТМ протеинкиназой С (ПКС) проводили в соответствии с протоколом фирмы Promega в реакционной смеси, содержащей очищенный ТБ, 5-кратный активирующий буфер (1.6 мг/мл фосфатидилсерин, 0.16 мг/мл диацилглицерол, 100 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 50 мМ MgCl2), 5-кратного коактивирующий буфер (1.25 мМ ЭГТА, 2 мМ СаС12, 0.5 мг/мл БСА), 0.5 мкл ПКС (Promega) и АТФ в конечной концентрации 1 мМ. Реакционную смесь инкубировали в течение 15 мин. при комнатной температуре, реакцию останавливали добавлением буфера для нанесения на ПААГ или переносом пробы на -20 С. Для получения [32Р] - меченных белков вместо "холодного" АТФ в реакционную смесь добавляли 0.5 мкл [у-32Р] - АТФ (5000 Ки/мМ, 400 МБк/мл). Фракция клеточных стенок Фосфорилирование ТБ ВТМ фракцией клеточных стенок N.tabacum проводили по методу, описанному Citovsky et al., (1993). 2-4 мкг ТБ инкубировали с фракцей клеточных стенок (1/20 объема реакционной смеси) в протеинкиназном буфере (20 мМ HEPES-KOH, рН 7.4, 5мМ MgCl2, 50 мМ КС1) в присутствии АТФ (конечная концентрации 1 мМ) в течение 30 мин. при +25С реакцию останавливали добавлением буфера для нанесения на ПААГ. Для получения [ Р] - меченных белков вместо "холодного" АТФ в реакционную смесь добавляли 1 мкл [у- Р] - АТФ (5000 Ки/мМ, 400 МБк/мл).
Определение структуры комплексов рнк-тб втм методом асм
Предположение о том, что описанные выше комплексы подвергаются транслокации через ПД, требовало изучения их структуры. Соответствуют ли параметры комплексов, формируемых in vitro, известным из литературы параметрам клеточных структур, таких как ПД? Как фосфорилирование ТБ влияет на структуру РНП? Для ответов на эти вопросы был использован метод ACM. Этот метод позволяет исследовать структуру объектов без применения фиксаций или дополнительных обработок. Эксперименты показали, что кооперативное связывание ТБ с РНК ВТМ происходит при молярном соотношении белок:РНК 60:1 (что соответствует 100 нт на одну молекулу ТБ). После инкубации таких комплексов при комнатной температуре они способны разворачиваться с образованием показанной на рисунке ПА структуры. Эти структуры получили условное название «толстые нити». Длину таких структур было сложно определить, так как они обладали тенденцией к линейной агрегации. Однако, ширина комплексов, измеренная на половине высоты, составляла 15-18 нм, что оказалось больше, чем ширина одной молекулы ТБ ВТМ (10-12 нм). Необходимо отметить, что горизонтальная составляющая объекта, наблюдаемая в АСМ, всегда больше, чем истинная величина, что обусловлено геометрией острия зонда. Используя метод Stemmer and Engel (1990), ширину одной молекулы ТБ можно оценить как 2,4-3,3 нм (считая радиус кончика левера равным 10 нм)., Высота комплексов составляла 2,5-3,5 нм и также оказалась в 1,5-2 раза выше индивидуальных молекул 30К и в несколько раз выше молекул РНК (по данным Drygin et al., (1998), она составляет 0,3-0,5 нм). Интересно, что в большинстве случаев в структуре «толстых нитей» можно было различить квази-периодические изменения высоты. Такие вариации высот (наглядно представлены на рис. 11Б и В) могли указывать на существование ряда плотно упакованных блоков, причем расстояние между центрами блоков изменялось в широком диапазоне от 22 до 50 нм. В исследуемых структурах сегменты с постоянной шириной и высотой (указаны стрелками на рис. 11 А), вероятно, состояли из очень плотно упакованных молекул со структурой более тонкой, чем разрешение АСМ. На рис. НА видно, что практически прямые участки комплексов перемежаются изгибами. Принимая во внимание, что изображение АСМ -это двумерная проекция трехмерной конформации комплексов, можно предположить, что изгибы соответствуют РНК, свободной от белка, а прямые участки плотно покрыты молекулами ТБ. Исходя из этого, можно было предположить, что обработка комплексов РНКазой А приведет к образованию линейных сегментов, не подверженных воздействию фермента.
Действительно, обработка комплексов РНКазой А приводила к образованию фрагментов «толстых нитей» длиной 150-350 нм (данные не показаны), что соответствует 300-650 нт, и совпадает с данными Karpova et al. (1999) по обработке РНКазой А комплексов ТБ:РНК в молярном соотношении 100:1. Увеличение соотношения белок:РНК до 100:1 (т.е. до 60 нт на одну молекулу ТБ) привело к образованию больших (более 40 нм) глобулярных структур с неопределяемой структурой. Однако, структуры РНП удалось визуализовать при соотношениях более высоких, чем 100 нт на одну молекулу белка, используя короткие (890-нт) транскрипты РНК вместо интактной (6000-нт) РНК ВТМ. Структура таких более плотных комплексов (80, 30 и 20 нт на одну молекулу ТБ) была одинакова между собой и не отличалась от описанной ранее структуры «толстых нитей» (данные не представлены). Важно отметить, что получаемые на основе транскриптов короткие комплексы (приблизительно 350 нм) были не подвержены влиянию РНКазы А. Можно предположить, что эти комплексы повторяют структуры прямых плотно упакованных участков, наблюдаемых в случае комплексов, формируемых с вирусной РНК. На основе данных, полученных в АСМ, было высказано предположение о возможной структуре «толстых нитей». На рис. 12 представлена трехмерная модель, в которой молекулы ТБ расположены по спирали вокруг молекулы РНК. В соответствии с этой моделью, описанная выше вариабельность высоты может отражать шаг спирали (от 22 до 45 нм нарис. 12). схематическое шображение, т. _ рж Т( тРикул получаемое є лем Как было указано ранее, описанная методом АСМ структура комплексов ТБ:РНК имеет высоту 2.5-3.5 нм. Эксперименты Citovsky et al. (1992) приводят данные о 1.5-2.5 нм. Принимая во внимание, что ТБ ВТМ увеличивает пропускную способность ПД с 0.75-1 кДа до 20 кДа (Wolf et al., 1989; Waigmann et al., 1994), модифицированная ПД соответствует диаметру 5-9 нм. Иными словами, комплекс РНК:белок диаметром до 3.5 нм вполне может транспортироваться сквозь ПД, модифицированную 30К белком. Изменится ли структура комплексов, если для их формирования использовать фосфорилированный ТБ ВТМ? Чтобы ответить на этот вопрос, были сформированы комплексы с ТБ, фосфорилированным ПКС, и вирусной РНК (в молярном соотношении 60:1). Считается, что ПКС фосфорилирует ТБ по тем же сайтам, что и растительная фракция КС (Karpova et al., 1999), поэтому такая замена фосфорилирующего агента оказалась возможной для применения в микроскопических исследованиях. Получающийся комплекс имел глобулярную структуру высотой около 30 нм и, в отличие от комплексов РНК с ТБ, не был способен разворачиваться (данные не представлены). Поэтому для изучения стабильности РНП были использованы обработки РНКазой А и слабой ионной силой. После обработки комплексов РНКазой А можно было увидеть в основном невысокие глобулы размером с мономеры ТБ (2-3 нм). Эти данные говорят о деградации комплекса и, следовательно, о доступности РНК. Обработка РНП низкой ионной силой (10мМ NaCl) привела к картине, показанной на рис. 13. В отличие от структур «толстых нитей», в комплексах приведенных на рис. 13 видны отдельные белковые глобулы высотой до 3 нм. Учитывая эффект уширения, всегда присутствующий на АСМ изображениях, молено предполагать, что комплексы РНК-ФТБ в 10мМ NaCl представляют собой несвязанные друг с другом глобулы белка на нити РНК. В то же время обработка комплексов с нефосфорилированным ТБ низкой ионной силой приводила к неспособности комплекса к разворачиванию, но не к дестабилизации структуры (данные не представлены).
