Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 7
1.1 Молекулярная организация вируса гепатита С 9
1.2 Строение и функции вирусных белков 10
1.3 Особенности ВГС-инфекции 26
1.4 Антигенная структура белков ВГС и методы картирования 35
2 Материалы и методы 49
2.1 Иммуногистохимическая детекция белков 49
2.1.1 Пациенты 49
2.1.2 Исход ОГС 50
2.1.3 Морфологический анализ 50
2.1.4 Выделение МКА из асцитных жидкостей 51
2.1.5 Моноклональные антитела 50
2.1.6 Определение концентрации белка 51
2.1.7 Иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание 51
2.2 Картирование антигенных детерминант белков ВГС 53
2.2.1 Фаговая библиотека 53
2.2.2 Аффинный отбор 53
2.2.3 Трансдукция клеток E.coli фагами 54
2.2.4 Иммуноскрининг 54
2.2.5 Выделение одноцепочечной фаговой ДНК и секвенирование 55
2.2.6 Анализ результатов секвенирования 55
2.3 Изучение иммуногенности отдельных детерминант 56
2.3.1 Иммунизация мышей 56
2.3.2 Определение активности антител в сыворотках мышей 57
2.3.3 Реакция блаеттрансформации спленоцитов 57
2.4 Изучение антигенных свойсв отдельных антигенных детерминант.. 58
2.4.1 Реакция иммуно-ДОТа с сыворотками больных ГС 58
2.4.2 Приготовление лизата E.coli 58
2.4.3 Истощение сывороток больных 59
2.4.4 Иммуноферментный анализ. Непрямой ИФА 59
2.4.5 Сендвич-ИФА№1 59
2.4.6 Сендвич-ИФА №2 60
2.4.7 Статистическая обработка результатов 60
3 Результаты 62
3.1 Выявление натуральных антигенных детерминант в печени больных ОГС 62
3.2 Картирование антигенных детерминант 70
3.3 Изучение иммуногенных свойств отдельных детерминант 80
3.4 Изучение антигенных свойств отдельных детерминант 83
4 Обсуждение результатов 92
Выводы 109
Список цитированной литературы 109
- Строение и функции вирусных белков
- Антигенная структура белков ВГС и методы картирования
- Морфологический анализ
- Реакция блаеттрансформации спленоцитов
Введение к работе
Актуальность проблемы
Значительный рост показателей заболеваемости острым гепатитом С, частое поражение лиц молодого возраста, высокий уровень хронизации с возможным исходом в цирроз и первичный рак печени определяют повышенное внимание к этому заболеванию.
Изучение молекулярных механизмов взаимодействий вируса с клеткой-хозяином, в частности изучение нативных вирусных белков, представляет сложную задачу в связи с низким уровнем накопления вируса в организме хозяина и отсутствием клеточной системы для его культивирования. В то же время выяснение структуры и свойств индивидуальных белков необходимо как для решения теоретических проблем (локализация антигенных и иммуногенных детерминант, определение протективных эпитопов), так и для решения задач практической медицины - создания профилактических средств, терапевтических препаратов и диагностических тест-систем.
Серодиагностика, основанная на определении специфических антител к различным вирусным белкам, сегодня является одним из основных методов диагностики ВГС-инфекции. Однако в некоторых случаях антитела к вирусу могут отсутствовать, например, в период «окна», при запаздывании иммунного ответа и при применении иммуносупрессивной терапии. Высокий уровень генетической вариабельности ВГС может обусловливать ложноотрицательные результаты. Возможно также получение ложноположительных результатов за счет перекрестно-реагирующих детерминант. Часто отмечаются несовпадения в результатах тестирования контрольных панелей сывороток с помощью различных тест-систем. В основе перечисленных недостатков - использование в тест-системах рекомбинантных белков и пептидов, которые по строению не всегда точно соответствуют нативным вирусным белкам, а также неполное знание антигенной структуры возбудителя и особенностей его взаимодействия с иммунной системой хозяина.
Цели и задачи исследования
Цели данной работы:
- изучение экспрессии белков ВГС в клетках печени больных острым гепатитом С;
- картирование антигенных детерминант белков ВГС методом фагового дисплея и изучение их иммуногенных и антигенных свойств.
Для достижения целей нами были поставлены следующие задачи:
1. С помощью моноклональных антител (МКА) исследовать выявляемость отдельных антигенных детерминант (АД) нативных вирусных белков в клетках печени больных острым гепатитом С (ОГС).
2. Получить фаговые клоны, имитирующие антигенные детерминанты вирусных белков, и картировать эти антигенные детерминанты.
3. Оценить иммуногенные свойства антигенных детерминант белков ВГС, экспонированных на фаговых частицах.
4. Разработать метод детекции антител к отдельным детерминантам в сыворотках больных гепатитом С, используя в качестве антигенов полученные фаговые клоны.
5. С помощью данного метода изучить спектр антител у больных гепатитом С на разных стадиях заболевания.
Научная новизна и практическая значимость.
1. Впервые показано, что отдельные антигенные детерминанты белков ВГС выявляются в клетках печени больных ОГС с различной частотой. Наиболее часто выявляются четыре антигенных детеминанты на белках NS4 и NS5, что может быть связано с пространственной доступностью этих детерминант.
2. Установлена структурная организация 6 антигенных детерминант, не описанных ранее, в составе белков core, NS3, NS4B и NS5A ВГС.
3. Показано, что антигенные детерминанты белков ВГС, экспонированные на поверхности фаговых частиц, индуцируют у мышей развитие вирусспецифического гуморального ответа.
4. Разработан лабораторный метод выявления антител у больных ГС к индивидуальным антигенным детерминантам белков ВГС, экспонированным на фаговых частицах.
5. Показано, что на ранних сроках после манифестации инфекции (до 1 месяца) спектр антител к индивидуальным антигенным детерминантам достоверно шире у пациентов с последующей реконвалесценцией, чем у больных с дальнейшей хронизацией инфекции. Данный критерий может иметь прогностическое значение при оценке исхода острого гепатита С.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Установлено, что частота выявления отдельных антигенных детерминант белков ВГС в клетках печени больных ОГС различается. В целом индивидуальные белки core, NS3, NS4 и NS5 выявляются в клетках печени 100% пациентов с острым гепатитом С.
2. Получены фаговые клоны, имитирующие антигенные детерминанты белков ВГС. Определены ключевые аминокислотные остатки 11 антигенных детерминант на белках core, NS3, NS4 и NS5, участвующие в связывании с антителами, установлена конформация 6 детерминант.
3. Показана иммуногенная активность антигенных детерминант белков ВГС в составе фаговых частиц.
4. Разработана схема детекции антител к отдельным антигенным детерминантам белков ВГС в сыворотках крови больных гепатитом С с использованием фагов, несущих пептиды, имитирующие эти детерминанты (т.н. фаговые мимотопы).
5. Установлено, что у больных ОГС частота выявления антител к отдельным антигенным детерминантам достоверно выше по сравнению с ХГС, что может иметь диагностическое значение при разграничении стадий инфицирования.
Строение и функции вирусных белков
Структурные белки. Core (С) белок. Первые 191 а.о. полипротеина ВГС образуют нуклеокапсилный или core-белок. Это высококонсервативный и иммуногеный белок, он содержит несколько линейных В-клеточных эпитопов рядом с N-концом [5, 79], которые используются для обнаружения антител в сыворотках больных [34]. Различают несколько форм нуклеокапсидного белка, отличных по длине и молекулярной массе. Наиболее протяженная форма core образуется путем отщепления от полипротеина с помощью клеточной пептидазы в положении 191 а.о. Это незрелая форма С-белка, молекулярная масса его составляет 23 кДа (р23). Core - высоко основный белок, имеющий гидрофобный участок на С-конце, который является сигналом транслокации Е1 в ЭПР и необходим для мембрано-зависимого процессинга нуклеокапсидного белка [96]. Кроме формы р23, в условиях in vivo обнаруживают также форму р21. Процессинг этого белка происходит путем расщепления р23 между 173Ser и 174Phe а.о. Мутации в этом сайте подавляют образование формы р21[93]. В сыворотках больных гепатитом С core находится в укороченной форме р21. Считается, что это зрелая форма, способная участвовать в формировании вирусных частиц. В некоторых работах белки р23 и р21 называют р21 и р19, соответственно [101, 129].
В исследованиях in vitro обнаруживают также форму р16. Его аминокислотная последовательность идентична N-концу р23. При трансфицировании клеток в отсутствии последовательности, кодирующей Е1, р16 является доминирующей формой экспрессии нуклеокапсидного белка. Однако, в присутствии генов Е1 доминируют формы р23 и р21. Образование р16 зависит от лизина в 9 позиции. Замена его на аргинин эффективно тормозит экспрессию ріб [101]. Сравнение аминокислотных последовательностей core у ВГС разных генотипов показало, что наличие лизина в 9 позиции характерно для субтипа 1а [129]. С-белок р23 в клетках находят в основном в цитоплазме, где он локализуется на мембранах ЭПР и митохондрий [114], а также в перинуклеарном пространстве, демонстрируя зернистое иммуногистохимическое окрашивание [94, 107]. Укороченная форма р21, лишенная гидрофобного хвоста, выявляется в ядре [168, 169, 170]. В проникновении нуклеокапсидного белка в ядро играет роль N-концевой участок core, имеющий основную природу и содержащий несколько сигналов ядерной локализации и ДНК-связывающий мотив [30]. Core-белок обладает РНК-связывающей активностью, что доказывает его роль в формировании вирусных нуклеокапсидов. Эта активность ассоциирована с N-концом белка, а именно с 1-75 а.о., представляющих высококонсервативную последовательность основных а.о. Связывание РНК происходит неспецифично и некоторые авторы считают, что благодаря этому core способствует развитию гепатоцеллюлярной карциномы [138]. При структурном анализе N-конца С-белка при помощи ядерного магнитного резонанса (ЯМР) было показано, что мотив 17-37 а.о. представляет собой структуру а спираль - петля - а-спираль, и несет как минимум один конформационный эпитоп [102]. Участок между а.о. 82 - 102 содержит последовательность, богатую остатками триптофана, которая, предположительно, участвует в олигомеризации молекул С-белка. N-концевые 120 а.о. нуклеокапсидного белка характеризуются отсутствием собственного фолдинга, т.к., возможно, подвергаются индуцированому фолдингу при взаимодействи с разнообразными лигандами в клетке хозяина. Такая конформационная пластичность позволяет С-белку взаимодействовать с различными партнерами и обуславливает широкий круг функций данного белка в клетке [165]. С-конец зрелого нуклеокапсидного белка (приблизительно 121-173 а.о.) в основном гидрофобный. Предсказано, что этот сегмент уложен в а-спирали и ответственен за ассоциацию молекул core с липидными каплями в клетках млекопитающих и с мембранами ЭПР [74].
Нуклеокапсидный белок ВГС регулирует транскрипцию некоторых клеточных и вирусных генов, в том числе с-тус и c-fos [128], через взаимодействие с gClq рецептором он ингибирует пролиферацию Т-лимфоцитов [84]. Известно также, что он подавляет апоптоз, индуцированный Fas или TNF через активацию NF-kB [97]. Кроме того, вместе с ras-онкогеном нуклеокапсидный белок может трансформировать клетки грызунов в раковые, а у трансгенных мышей, экспрессирующих его в клетках печени, развивается гепатоцеллюлярная карцинома [109]. Эти свойства core-белка свидетельствуют о том, что он обладает онкогенными качествами и влияет на нормальные клеточные функции, такие как клеточная пролиферация и клеточная смерть, и позволяют предположить, что core играет важную роль в патогенезе ВГС. Однако, следует отметить, что большинство данных относительно функций С-белка имеют противоречивый характер, поэтому детальный структурно-функциональный анализ этого белка остается актуальной задачей.
В последнее время появляются данные о потенциальной возможности сдвига открытой рамоки считывания (open reading frame, ORF) и появлении помимо нативных вирусных белков так называемых белков альтернативных рамок считывания (alternative reading frame protein, ARFP). Было показано, что такие белки могут образовываться при рибосомальном сдвиге рамки на 5 -конце гена, кодирующего core-белок в составе полипротеина. В экспериментах in vitro в клетках млекопитающих обнаружена экспрессия ARFP-белка ВГС генотипа 1а с молекулярной массой 17 кДа. Сдвиг рамки в данном случае происходил между 9 и 11 кодонами гена нуклеокапсидного белка [166]. Показано также, что при сдвигах рамки «-1/+2» в данном регионе также может образовываться белок массой 1,5 кДа [36]. Предполагают, что положение, в котором происходит сдвиг, является генотипически-зависимым: так для генотипа lb был охарактеризован сдвиг «+1» в 42 ко доне [24]. Обнаружение антител к ARFP-белкам в сыворотках больных говорит о том, что эти белки экспрессируются в течение ВГС-инфекции. Однако, экспрессию альтернативных белков в печени больных еще предстоит показать.
Оболочечные белки. Гликопротеины (ГП) El (gp31) и Е2 (gp70), представляющие оболочечные белки ВГС, являются N-гликозилированными по 4 и 11 сайтам, соответственно. Оба они являются трансмембранными белками и имеют N-концевые гидрофильные домены длиной от 160 до 334 а.о. и С-концевые трансмембранные домены (ТМД) длиной приблизительно 30 а.о. [96]. Наличие гидрофобных участков подтверждается исследованиями, в которых делеции этих областей приводили к продукции секретируемой растворимой формы Е2 [87]. Конформационная структура ТМД Е1 была изучена с помощью ЯМР: показано, что он образует единичную а-спираль. ТМД играют ключевую роль в заякоривании оболочечных белков в мембране ЭПР, в образовании димера Е1/Е2.
Антигенная структура белков ВГС и методы картирования
Белки представляют собой наиболее распространенный класс антигенов. Участки белков, связывающие антитела, так называемые антигенные детерминанты (АД) или эпитопы, активно изучаются при помощи разнообразных методик. Детерминанты принято разделять на непрерывные (линейные) и прерывистые (конформационно-зависимые) [144]. Линейные эпитопы представляют собой короткий участок полипептидной цепи. Прерывистые антигеные детерминанты состоят из а.о., сближеных в пространстве, но отстоящих друг от друга в составе первичной последовательности белка. Структура прерывистых детерминант определяется топологическими свойствами белковой молекулы (отсюда название «конформационно-зависимые»).
Один из экспериментальных подходов к картированию АД, основанный на кросс-реактивности синтетических пептидов с антителами к исследуемому белку, был предложен Geysen с соавт. в 1987 году [64]. Метод называется «pepscan» и заключается в синтезе множества коротких частично перекрывающихся пептидов, повторяющих аминокислотную последовательность белка. Данные пептиды тестируют на способность взаимодействовать с антителами к целому белку при помощи стандартного иммуноферментного анализа.
Кроме «pepscan», существует еще несколько модификаций пептидного картирования. Например, так называемый метод «окна». В данном методе используют набор синтетических пептидов, повторяющих заданную аминокислотную последовательность, но имеющих разную длину. Такой набор пептидов позволяет определить минимальный учаток («окно»), который обеспечивает максимальное связывание с антителом.
Иногда для картирования АД используют также набор пептидов, у которых один из а.о. заменен другим, определяя таким образом, какой а.о. является ответственным за связывание с антителом, а также степень кросс-реактивности изучаемого антитела [65].
Картированию АД на белках ВГС с помощью пептидов посвящено множество работ. Такие исследования проводят с целью усовершенствования диагностических тест-систем [68], для анализа роли антител к различным АД в течение инфекции, для изучения спектра антител в сыворотках больных и изменения этого спектра в ходе ВГС-инфекции [3, 4], для разработки систем детекции белков ВГС (в основном core-белка) в сыворотке больных [98]. Знание антигенной структуры белков помогает понять механизмы взаимодействия вируса с клеткой-хозяином и его персистенции [77].
При помощи пептидов картированы АД на поверхностных белках ВГС -Е1 (рисунок 6) и Е2 [176], а также на неструктурных белках NS4A, NS4B, NS5A и NS5B [28, 50, 134]. Попытки картировать перекрывающимися короткими пептидами антигенные эпитопы на белке NS3 не увенчались успехом [81]. Авторы предполагают, что АД данного белка представлены в основном конформационно-зависимыми детерминантами, в связи с чем их следует картировать с использованием протяженных пептидов или другими методами картирования (например, методом фагового дисплея) [121]. Сообщается лишь о двух случаях картирования линейных эпитопов на белке NS3: на участке 1392-1403 а.о. [173] и на участке 1115-1127 [160].
Секвенциальный анализ. Наряду с пептидным картированием, для поиска АД используют секвенциальный анализ. Он заключался во всестороннем изучении свойств а.о., входящих в состав полипептидной цепи белка, и предсказании районов локализации антигенных детерминант. Было разработано множество алгоритмов анализа белковых последовательностей: 1) алгоритмы определения гидрофильности и гидрофобности белка - Kyte and Doolittle [86]; Goldman, Engelman and Steitz (GES) [53]; 2) алгоритм определения подвижности цепи - Karplus and Schulz [80]; 3) алгоритмы предсказания вторичной структуры белков - GOR II method (Gamier and Robson) [62]; Chou and Fasman [40]; 4) алгоритмы предсказания «антигенности» белка - Норр and Woods [75]; Welling [163]. При поиске секвенциальных детерминант белков с помощью вышеуказанных алгоритмов обычно используются следующие критерии: 1) Относительно высокая гидрофильность участка, позволяющая ему быть экспонированным на поверхности белковой молекулы. 2) Слабая вторичная структура, невовлеченность в состав [3-слоев. Признаком антигенности также считается наличие Р-поворотов. 3) Относительно высокая подвижность цепи на участке, содержащем детерминанту. 4) Сходство с известными антигенными детерминантами по аминокислотному составу. Эти алгоритмы позволяют определить локализацию антигенных эпитопов очень приблизительно. Однако, как и в случае пептидного картирования, не позволяют картировать конформационно-зависимые детерминанты. В настоящее время эти алгоритмы применяются в комплексе с другими методами картирования АД. Фаговый дисплей. Первые публикации в 1990 г., описывающие пептидный дисплей на поверхности нитчатых бактериофагов, привлекли внимание многих ученых к этому простому и удобному методу поиска и идентификации лигандов для антител или других молекул [46, 49, 141].
Фаги М13, fl и fd вместе называются Ff фагами из-за их нитчатой формы и зависимости от наличия F-пилей для инфицирования клеток-хозяев Е. coli. Вирион имеет длину 900 нм и диаметр около 7 нм (рис. 7 а). Он состоит из одноцепочечной молекулы ДНК, упакованной в трубку, состоящую из 2700 копий мажорного поверхностного белка pVIII (рис. 7 б), на концах трубку ограничивают 4 или 5 копий каждого из четырех видов минорных поверхностных белков pill, pVI, pVII, рХ (рис. 7 а). В отличие от литических фагов, которые приводят к лизису хозяйской клетки после сборки вирионов в ее цитоплазме, Ff фаги хронически инфицируют клетку, выделяясь через ее оболочку в процессе, объединяющем сборку и экспорт вирионов.
Морфологический анализ
Мооклональные антитела использовали в работе в виде иммуноглобулинов (Ig), выделенных из асцитных жидкостей от мышей. Асцитную жидкость разводили ацетатным буфером (60тМ, рН 4,0), рН доводили до 4,5 с помощью NaOH. Затем добавляли каприловую кислоту 25мкл на мл асцита, перемешивали 30 мин. Центрифугировали 30 мин х 10000g, к надосадку добавляли 10х ФСБ до получения 1х раствора. Доводили рН до 7,4 и фракционировали раствор с (NH SO который постепенно добавляли до 45% насыщения (0,277 г/мл). Перемешивали ночь при 4С, осадок иммуноглобулинов осаждали центрифугированием, ресуспендировали и диализовали против ФСБ [100]. Оптическую плотность растворов Ig измеряли на спектрофотометре ("Beckman", Германия) при длине волны 280 нм. Концентрацию белка определяли по формуле: C=D/1,34, где D - оптическая плотность, С — концентрация белка (мг/мл), 1,34 - оптическая плотность раствора белка с концентрацией 1 мг/мл.
Криостатные срезы печени фиксировали в ацетоне при -20С, затем блокировали эндогенную пероксидазу в смеси метанол/НгОї (37,5%)/вода в соотношении 50/1/12 в течении 20 мин. После промывки стекол фосфатно-солевым буфером (ФСБ), на срез наносили МКА в концентрации 10 мкг/мл. Затем инкубировали срезы с биотинилированными антимышиными антителами и после — со стрептавидином, меченным пероксидазой (Dako LSAB2 System, Дания). В качестве субстрата для проявления пероксидазной реакции использовали диаминобензидин (ДАБ, Sigma, США). Ядра докрашивали гематоксилином Карачи. В качестве отрицательных контролей использовали МКА к белкам ВИЧ-1.
Две фаговые библиотеки случайных эпитопов были сконструированы в лаборатории J.M. Gershoni (Department of Cell Research and Immunology, G.S.Wise Faculty of Life Sciences, Tel Aviv University) на базе вектора Fthl [57] (GeneBank AF362081). Нуклеотидные последовательности, кодирующие двенадцатичленные пептиды, фланкированные цистеиновыми остатками в одной библиотеке (pVIII/CXi2C) и семичленные пептиды (pVIII/X7) - в другой, были встроены в один из двух генов поверхностного белка фага fd — pVIII. В результате, наряду с нативным белком в фаговых частицах присутствовал рекомбинантный белок pVIII, несущий вставку из случайного набора а.о.
В качестве антител-мишеней в аффинном отборе использовали МКА к рекомбинантным белкам вируса гепатита С. К белку core (фрагмент 1-90 а.о.) -МКА lf9, 1а12, к белку core (фрагмент 1-150 а.о.) - МКА 27, D4, 4g5. К белку NS3 (фрагмент 1356-1459 а.о.) - МКА 2h4, 4h8, 5Ь2 и 6е9; к белку NS4 (фрагмент 1677-1756 а.о.) - МКА ldll и 6Ы1; к белку NS5A (фрагмент 2193-2300 а.о.) - МКА 3f4, 1с5, 2с9 и 5а9 (табл. 1, раздел Материалы и методы).
Аффинный отбор проводили по схеме, описанной в работе [56] с небольшими изменениями. На дно лунки 6-луночной культуральной панели (Corning, Costar) сорбировали протеин А из St. Aureus (USBiomedical, США) в концентрации 25-100 мкг/мл в буфере ТБС (0.05М Трис, 0.15М NaCl, рН 7.5) в течение ночи при +4С. Затем 2 раза отмывали ТБС с 0.5% Tween-20 (ТБСТ). Блокировали сайты неспецифического связывания раствором 0.25% желатины в ТБСТ (ТБСЖ) 1 час при комнатной температуре (КТ). Затем вносили МКА к белкам ВГС в концентрации 10 мкг/мл в ТБСЖ и инкубировали в течение ночи при +4С. Отмывали антитела ТБСТ 4 раза. Затем иммобилизованные МКА инкубировали со смесью фагов из фаговой библиотеки в конечной концентрации 1011 фаговых частиц на мл в ТБСЖ и инкубировали 4 часа при КТ. Несвязавшиеся фаговые частицы отмывали 9 раз ТБСТ и 1 раз ТБС. Связавшиеся фаги элюировали в 400 мкл элюирующего буфера (0,1М НС1-глициновый буфер, рН 2,2, 1 мг/мл БСА) дважды по 10 мин при КТ. Элюат нейтрализовали буфером (1М Трис-HCl, рН 9,1) до рН 7,0-7,5. Фаги, связавшиеся с МКА в первом раунде, амплифицировали, заражая ими клетки E.coli. Проводили три раунда аффинного отбора.
Культуру Е. coll (штамм DH5a5F) выращивали в среде LB 4-5 часов на качалке (200 об/мин) при температуре 37С (стандартные условия). Когда концентрация клеток достигала оптической плотности 1.5 при 620 нм, их инкубировали на качалке (60 об/мин) 30 мин для формирования половых F-пилей. К 1,5 мл суспензии клеток добавляли с 500 мкл фагового элюата и инкубировали 30 мин. Затем добавляли 5 мл среды 2TY и инкубировали 1 час при 37С на качалке (200 об/мин). Зараженные клетки засевали в 45 мл среды 2TY с тетрациклином (20 мкг/мл), растили в стандартных условиях для выделения фагов, которые использовали в последующих раундах аффинного отбора. После 3-его раунда аффинного отбора зараженные клетки высевали на 1,6% LB-агар с тетрациклином (20 мкг/мл) для получения отдельных колоний и проведения иммуноскрининга. Концентрацию фагов определяли подсчетом колоний после заражения Е. coli 10 мкл препарата с высевом на 1,6% LB-агар с тетрациклином.
Отдельные колонии засевали в 200 мкл среды ТВ с тетрациклином (20 мкг/мл) в лунку 96-луночной панели с U-образным дном и выращивали в течение ночи в стандартных условиях. Осаждали клетки центрифугированием панелей на центрифуге Beckman J21 (1 час х 2500 об/мин). Супернатант (150 мкл) переносили в плоскодонные панели, содержащие 50 мкл/лунку смеси ПЭГ-NaCl (17% ПЭГ-6000, 3,ЗМ NaCl). Перемешивали пипетированием, инкубировали 2 часа при +4С, и центрифугировали 1 час х 2500 об/мин. Осадок, содержащий фаги, ресуспендировали в 100 мкл ОДМ фосфатно-солевого буфера, рН 7,4 (ФСБ).
Фаги сорбировали на нитроцеллюлозную мембрану (0.45 мкм, Schleicher & Schuell, Германия) с помощью вакуумного насоса в аппарате DOT-apparatus (BioRad, США). После блокирования мембраны в 5% сухом молоке на ФСБ-0,1% Твин 20 (СМ-ФСБТ), мембрану инкубировали с МКА в концентрации 1-5 мкг/мл на СМ-ФСБТ в течение 2 часов. Эту и все последующие инкубации проводили на качалке при КТ. МКА отмывали 4 раза ФСБТ и вносили козьи антитела к IgG мыши, меченные пероксидазой хрена (Сорбент, Россия) в рабочем разведении 1:400. Инкубировали 1 час, после чего отмывали мембрану ФСБТ 7 раз. В качестве субстрата использовали диаминобензидин (Sigma, США) в концентрации 0,5 мг/мл в 0,05М Трис-HCl, рН 7,4 с добавлением 1 мкл/мл 37,5% Н202. В случае положительной реакции мембрана в месте сорбции фага окрашивалась в коричневый цвет. Для секвенирования ДЬЖ отбирали фаговые клоны, наиболее интенсивно реагирующие с МКА, на которых были отобраны, и не реагирующие с МКА другой специфичности. ДЬЖ отобранных в аффинной селекции фаговых клонов выделяли с использованием набора Quagen (Германия) по протоколу производителя и использовали в качестве матрицы для секвенирования с праймером 5ЛTTCACGTTGAAAATCTCC-3\ Секвенирование проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDyeTerminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant на базе центра коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН, организованном при поддержке РФФИ (грант №00-04-55000).
Реакция блаеттрансформации спленоцитов
Отдельные фаговые клоны сорбировали на нитроцеллюлозную мембрану (0,45 мкм, Schleicher & Schuell, Германия) с помощью вакуумного насоса в аппарате DOT-apparatus (BioRad, США). После блокирования неспецифических сайтов связывания в течение 1 часа в 5% СМ, инкубировали мембраны с сыворотками больных ГС в разведении от 1:50 до 1:50000. В качестве блок-раствора на этом этапе применяли 5% СМ, казеин, казеин с 4М мочевиной, лизат E.coli. В каждом случае раствор был приготовлен на ФСБ с 0,05-0,1% Твин-20 (ФСБТ). Время инкубации варьировало от ночной при 4С до двухчасовой при КТ. Инкубацию всегда проводили на качалке. После отмывки несвязавшихся сывороточных Ig 4 раза с ФСБТ, вносили антитела к IgG человека, меченные пероксидазой. Конъюгированные антитела были направлены к Fab-фрагментам IgG человека, к Fc-фрагментам или к целой молекуле. Кроме того, использовался поликлональный и моноклональный конъюгат. Инкубация с конъюгатом проводилась в течение часа при КТ на качалке. Затем мембрану отмывали с ФСБТ 7 раз. Реакцию проявляли, как указано выше.
Для приготовления лизата выращивали бактериальную культуру DH5aF в LB в течение ночи. Затем концентрировали ее в 10 раз и обрабатывали ультразвуком (10 циклов по 10 сек при частоте 70mA). Осаждали крупные частицы клеток центрифугированием 10 мин х 2500 об/мин, надосадок использовали для истощения сывороток и приготовления блок-растворов. 2.4.3 Истощение сывороток больных.
Для отработки ИФА проводили предварительное истощение сывороток больных ГС на фагах без вставки Fth и белках E.coli с использованием лизата клеток штамма DH5aF. Для этого на нитроцеллюлозную мембрану (0,45 мкм, Schleicher & Schuell, Германия) сорбировали по 200 мкл каждого белка, мембрану высушивали и инкубировали с цельными сыворотками 2 часа при КТ на качалке. Затем сыворотки отбирали и использовали в ИФА.
В лунки 96-луночных панелей Dynatech (Германия), или Nunc (Дания) сорбировали фаговые частицы в концентрациях от 10 до 10 TU/мл (рис. 10 б). Время сорбции фагов варьировало от 2 часов при 37С до ночи при КТ или 4С. В качестве буфера для сорбции использовали ФСБ или 0,25М КББ (рН 9,5) или эти же растворы с добавлением денатурирующих агентов — смеси меркаптоэтанола и додецилсульфата Na (конечная концентрация компонентов смеси 1,5%). Затем вносили сыворотки больных ГС или МКА к белкам ВГС. Сыворотки вносили в разведениях 1:100 - 1:10000, а МКА - 5мкг/мл, для разведения использовали блок-растворы 5% СМ-ФСБТ или казеина. Инкубировали 1 час при 37С, затем отмывали ФСБТ 5 раз. После чего вносили мышиные МКА к IgG человека, меченные пероксидазой («Сорбент», Россия), в рабочем разведении 1:3000 в блок-растворе либо козьи поликлональные антитела к IgG мыши («Сорбент», Россия), в рабочем разведении 1:500. Инкубировали 1 час, затем отмывали. Реакцию проявляли субстратом ОФД (Sigma, США) в концентрации 0,5 мг/мл в 0,1М цитратно-фосфатном буфере (рН 5,0) с добавлением 1 мкл/мл 37,5% Н2С 2. Оптические плотности оценивали при длине волны 492 нм.
В лунки 96-луночных панелей Dynatech (Германия) сорбировали кроличьи поликлональные антитела к фагу fd (Sigma) в ФСБ в концентрации 1:3000 в течение ночи при КТ (рис. 10 в). После предварительной блокировки 5% СМ-ФСБТ вносили фаговые клоны в различных концентрациях в блок-растворе. Инкубировали 2 часа при 37С, затем отмывали ФСБТ. Вносили МКА к белкам ВГС в концентрации 5 мкл/мл либо сыворотки больных ГС в разведениях 1:50 - 1:1000 на 5% СМ-ФСБТ или в казеине, либо сыворотки, истощенные на Fth и лизате E.coli. Инкубировали 1 час при 37С, отмывали и проявляли реакцию ОФД, как описано выше.
В лунки 96-луночных панелей Dynatech (Германия) сорбировали МКА к белкам ВГС либо сыворотки больных в разведении 1:10 в течение ночи при КТ в ФСБ (рис. 10 г). Затем блокировали неспецифические сайты связывания раствором казеина 1 час. Вносили смеси фаговых клонов с мимотопами АД белков ВГС в казеине, инкубировали 2 часа. Затем инкубировали фаги с кроличьими поликлональными антителами к бактериофагу fd (Sigma, США) в разведении 1:3000 1 час в казеине. После добавляли козьи антитела к Ig кролика, меченые пероксидазой на 1 час. Все инкубации проводили при 37С, после каждой инкубации отмывали несвязавшиеся молекулы ФСБТ 5 раз. Реакцию проявляли ТМБ (US Biomedical, США). Оптические плотности оценивали в двухволновом режиме при длине волны 450 нм с референсной длной волны 620 нм.
