Содержание к диссертации
Введение
1. Line элементы 10
1.1 Структура и классификация li элементов 10
1.2 Распределение по геному человека 11
1.3 Функциональная активность 12
2 Эндогенные ретровирусы человека 16
2.1 Строение herv 17
2.2 Классификация 19
2.3 Представленность и локализация herv и ltr в геноме 21
2.4 Распределение herv и ltr по хромосомам 22
2.5 Активность herv и одиночных ltr 24
2.6 Факторы, влияющие на экспрессию herv 33
2.7 Возможі юе участие erv в различных нормальных и патофизиологических процессах 35
2. Результаты и обсуждение 47
2.1 Анализ транскрипционной активности иіщивидуальньгх ltr семейства herv-k 47
2.2 Анализ транскрипционной активности индивидуальных ltr herv-k в нормальных и опухолевых тканях человека 58
2.2.1 Чувствительность и репрезентативЕюсть метода SDDIR 65
2.2.2 Варианты SDDIR 68
2.2.3 Транскрипциовніая активность LTR HERV-K 78
2.3 Поиск специфичных длл опухолей интеграции ltr herv-k и line 1 80
2.4 Оценка чувствительности метода TGDA 85
2.5 TGDA опухоль-специфичных интеграции LTR HERV-K и LINE1 90
2.6 Идентификация дифференциальных фрагментов 90
3. Экспериментальная часть 95
3.1 Материалы 95
3.1.1 Ферменты и реактивы 95
3.1.2 Оборудование 96
3.1.3 Расходные материалы 96
3.1.4 Буферные и другие растворы 97
3.1.5 Микробиологические среды 99
3.1.6 Ткани 99
3.1.7 Праймеры, последовательность нуклеотидов 100
3.2 Методы исследования 103
3.2.1 Выделение РНК и геномной ДНК 103
3.2.2 Обработка ДНКазой 104
3.2.3 Синтез первой цепи кДНК 105
3.2.4 PCR 105
3.2.5 Определение первичной струЕстуры клонированных фрагментов ДНК и PCR фрагментов 107
3.2.6 Подбор праймеров для амплификации 107
3.2.7 Поиск гомологии, картирование в геноме человека 107
3.2.S ДиффсрснЕуЕальный дисплей SDDIR (Selective Differential Display of RNAs containing Interspersed Repeats ) 107
3.2.9 Модифицированный TGDA (Targeted Genomic Difference Analysis) 111
3.3 Приготовление вложенного контроля 113
Выводы 118
- Классификация
- Анализ транскрипционной активности индивидуальных ltr herv-k в нормальных и опухолевых тканях человека
- Поиск специфичных длл опухолей интеграции ltr herv-k и line 1
- Методы исследования
Введение к работе
Около 40% генома человека составляют повторяющиеся элементы, представленные в основном ретроэлементами (далее РЭ), такими как короткие диспергированные повторы (Short Interspersed Nuclear Elements, SINEs), длинные диспергированные повторы (Long Interspersed Nuclear Elements, LINEs) и производными эндогенных ретровирусов (Human Endogenous Retroviruses, HERV), содержащими длинные концевые повторы (Long Terminal Repeats, LTRs), в то время как последовательности, кодирующие белки, составляют менее 5% генома [1,2].
Часть повторяющихся элементов генома экспрессионно активна. Большое число повторяющихся элементов могут образовывать собственные трап Скрипты, которые участвуют в функционировании клетки. Ретроэлементы могут образовывать некодирутощие РНК, потенциально способные принимать участие в регуляции генной активности, например при посттранскрипционном сплайсинге генов или участвуя в подавлении экспрессии транспозонов и других повторяющихся элементов [3-5]. РНК, содержащие Alu элементы, составляют 5% от известных мРНК [6]. В 5' и 3' UTR многих генных транскриптов присутствуют последовательности ретроэлементов. Особенно богаты последовательностями РЭ транскрипты эволгоциошю молодых классов генов, таких как гены иммунного ответа или ответа на воздействия внешних факторов [7].
Перемещаясь, РЭ существенно влияют на структуру генетического материала хозяина и имеют фундаментальное значение в формировании генетической изменчивости. Считают, что причиной возникновения спонтанных мутаций может являться транспозиционная активность подвижных элементов генома [8]. Являясь причиной инсерционного мутагенеза, РЭ могут, как изменять последовательность гена, так и изменять его транскрипционную активность, влиять на тканеспецифичность и уровень экспрессии гепа. Для некоторых ретроэлементов показано, что они могут быть промоторами и терминаторами транскрипции близлежащих клеточных генов, участвовать в альтернативном сплайсинге, предполагают участие РЭ в ремоделировании хроматина и других процессах [5, 9, 10].
Методами блот гибридизации и PCR было показано, что активность РЭ может изменяться в зависимости от внешних условий и состояния клетки [10]. Показано увеличение количества Alu транскриптов в клетках при стрессовых условиях [11]. Другим хорошо известным примером является изменение картины экспрессии эндогенных ретро вирусов и LINE1 элементов в процессе опухолевой трансформации [12, 13]. Все эти данные свидетельствуют о том, что, по крайней мере, некоторые ретроэлементы в процессе эволюции сохранили свой биологический потенциал, но не дают возможности ответить на вопрос, каковы функции РЭ в геноме человека. Остается неясным, какие факторы участвуют в регуляции активности ретроэлементов, сколько и какие элементы подвергаются этой регуляции, как и за счет чего при изменениях внешних условий и клеточного состояния изменяется транскрипционная активность индивидуальных РЭ.
Существует большое число работ, исследующих роль повторяющихся элементов в функционировании клетки, но все они сфокусированы на активности отдельных представителей ретроэлементов [5, 9, 10]. На сегодняшний день не проводили полногеномных исследований транскрипционно активных ретроэлементов и исследований изменения их активности в различных нормальных и опухолевых тканях, так как не существует метода для исследования всего пула РНК, содержащих определенный класс повторяющихся элементов, и позволяющего сравнивать спектры РНК в различных типах клеток и тканей.
В данной работе мы разработали методы, которые могут быть полезны для выяснения вклада активности РЭ в функционирование генома хозяина, и использовали их для полногеномного анализа функциональной активности HERV и LINE элементов и ее изменений при переходе от нормальных тканей к опухолевым.
Классификация
Таксономия эндогенных ретровирусов. - одна из нерешенных проблем. Номенклатура экзогенных ретровирусов, как правило, основана на названии организма хозяина или вызываемого ими заболевания. Такой подход сложно применить к эндогенным ретро вирусам. Как правило, они присутствуют в геномах разных видов, и соответствие их какому-либо заболеванию до сих пор не показано. Существует несколько видов систематики ERV. Один из возможных подходов основан на определении типа тРНК, используемой ретровирусом в качестве праймера в процессе инициации обратной транскрипции [10, 45-47J. В соответствии с этим признаком HERV разделяют на несколько семейств - HERV-K (праймер - лизиновая тРНК), HERV-H (гистидиновая тРНК), HERV-E (тРНК глутаминовой кислоты), HERV-W (триптофановая тРНК) и т.д. Поскольку одной аминокислоте может соответствовать несколько кодопов, и, следовательно, используется несколько разных тРНК, то в некоторых случаях в названии группы указывают последовательность соответствующего антикодона - например, HERV-K(CUU). Вместе с тем, совершенно разные по нуклеотидной последовательности ERV могут использовать одну и ту же тРНК для инициации обратной транскрипции, вследствие чего, ввели иные способы классификации эндогенных ретровирусов. Например, создана классификация, за основу в которой берется морфология вирусных частиц - А-, В-, С- и D-вирусы [5, 10, 45, 47, 48]. Другой подход основан на сравнении консервативных районов ERV между собой, а также с соответствующими участками генома экзогенных ретровирусов. Наиболее консервативные последовательности находятся в гене полимеразы, иногда используют ген gag, env или ген prt, хотя они менее консервативны. Классификация основанная на таком анализе делит ретровирусы на семь групп: спумавирусы (spumaviruses), вирусы, родственные мышиной лейкемии (Murine Leukemia Vims-related retroviruses, MLV), лентивирусы (lentiviruses), вирусы родственные HTLV, вирусы птичьего лейкоза (Avian Leukosis Viruses, ALV), вирусы типа D и вирусы млекопитающих типа В [49]. Подобным образом на подклассы разделили практически все вирусы млекопитающих и некоторые вирусы птиц.
Однако, в последнее время появилось много новых ретровирусов из рептилий, амфибий и рыб, которые сложно охарактеризовать с помощью вышеописанной систематики. Недавно была создана классификация, включающая в себя большее количество ретровирусных видов [48]. Авторы изучали представителей всех классов позвоночных и некоторые классы беспозвоночных -Cephalochordata, Tunicata, Mollusca, В основе подобной классификации также лежал метод сравнения консервативных последовательностей генов gag, рої и env, но, в отличие от предыдущей систематики, было выделено 3 группы ретровирусов, а не 7 -группы I, II и III. К группе I относятся спумавирусы, вирусы рептилий (например, SpeV), рыб (SnRV), а также некоторые вирусы амфибий (RV-Painted Frog), птиц (RVinamou) и сумчатых млекопитающих (RV-Common Possum). Группа II включает в себя исключительно вирусы млекопитающих и небольшого количества птиц (лентивирусы, ALV, HTLV, вирусы типа В и D и др.). В третью группу входят представители MLV, большинство вирусов амфибий (например, RV-Leopard Frog) и рыб (WDSV - Walleye Dermal Sarcoma Virus и др.). 2.3 Представленность и локализация HERV и LTR в геноме По современным оценкам полпоразмерные HERV и одиночные LTR составляют около 8% генома человека. Образование одиночных LTR в геноме можно объяснить следующим образом: в процессе вырезания последовательности провируса происходит рекомбинация между 5 LTR и 3 LTR, вследствие чего остается одиночный LTR. Таким образом, одиночный LTR является следом предшествующей интеграции провируса. Число таких одиночных LTR сильно варьирует у различных семейств HERV [50]. Было показано, что для семейства HTDV/HERV-K предполагаемое число полноразмерных провирусов на геном составляет 30-50 копни, в то время как количество одиночных LTR этого семейства составляет около 2 тысяч копий на геном [51]. Для семейства HERV-H число полноразмерных провирусов-100, около 900 копий дефектных провирусов и около 1000 копий одиночных LTR [52, 53]. Для других семейств эндогенных ретровирусов также характерно значительно большее количество одиночных LTR по сравнению с числом полноразмерных копий провирусов соответствующего семейства. Помимо полноразмерных HERV и одиночных LTR в геноме в большом числе присутствуют дефектные провирусы, потерявшие части своего генома различной протяженности. Как показал анализ опубликованных последовательностей эндогенных ретровирусов, обширные делеции чаще всего затрагивают область гена env [54]. Представители семейства HERV-H и ряда других семейств в большинстве своем содержат делеции гена env [52]. Однако провирусы семейства HERV-R (ERV-3) наоборот, содержат мутации в генах gag и рої, а ген env является неповрежденным и экспрессируется [45, 47]. Для семейства HERV-Z69907 показано, что это семейство одно из самых дивергировавших среди ERV, поскольку у таких элементов полностью делетирован 51 LTR с PBS. Кроме того, большие делеции присутствуют и во всех основных генах HERV-269907 [47]. 2.4 Распределение IIERV и LTR по хромосомам Эндогенные ретровирусы человека чаще внедряются в активно транскрибируемые GC- и Alu- богатые участки генома [41], эти элементы встречаются на всех хромосомах, но разные семейства провирусов и их LTR распределены по-разному. Частота встречаемости на одних хромосомах выше, чем на других. Было показано, что некоторые семейства эндогенных ретровирусов человека собраны в кластеры в хромосомных локусах. Например, гаптоглобиновый локус содержит три независимые инсерции HERV-I [46]. HERV часто находятся в кластерах с другими ретроэлементами, особенно с Alu повторами. Около 50% HERV-E последовательностей по результатам in situ гибридизации расположено в дистальных теломерных участках хромосом. Для HERV-H семейства было показано, что эти последовательности локально сконцентрированы на коротком плече хромосомы 1 и длинном плече хромосомы 7 [10, 45].
Одиночные LTR семейства HERV-K неравномерно распределены по хромосомам. Количество последовательностей наЗ и 16 хромосоме больше,чем на 8, 11 и 13 хромосомах [41]. Данные о распределении LTR в геноме человека далеки от полноты. Известно, что LTR встречаются на всех хромосомах, но разные семейства LTR распределены по-разному. Одни хромосомы оказались более густо заселенными, тогда как другие относительно "пустынными". Еще меньше сведений о распределении LTR вдоль хромосом и о взаиморасположение LTR и генов. В настоящее время завершен анализ распределения LTR HERV-K на хромосомах 19 [55, 56] и 22 [57-59]. В первом случае 72 LTR, расположенных на этой хромосоме, оказались равномерно распределенными вдоль ее длины. Во втором - наблюдали увеличение плотности LTR в расчете на единицу длины хромосомы по направлению к ее концам. Важно, что в обоих случаях показана прямая корреляция между распределением LTR и генов вдоль хромосом. Ретровирусы имеют тенденцию внедряться в активно транскрибируемые участки генома. Известно достаточное число примеров локализации LTR вблизи от генов [60-62]. Было исследовано взаиморасположение известных генов и LTR одного из семейств HERV на хромосоме 19 человека [63]. Было обнаружено частое совпадение положений LTR и известных картированных генов. Интересно, что с частотой, значительно превышающей ожидаемую на основе просто статистических совпадений, LTR оказываются сближенными с генами, кодирующими белки, содержащие Zn-фингерные мотивы, а иногда далее располагаются в их интронах. Zn-фингерные белки часто являются регуляторами транскрипции и в геноме человека представлены многочисленными семействами. Известны примеры участия ретро вирусных последовательностей в регуляции экспрессии Zn-фингерных белков [64, 65]. Недавно был найден новый ген человека, кодирующий Zn-фингерный белок и содержащий эндогенный ретровирус [66]. Возможно, участие LTR в регуляции экспрессии Zn-фингерных генов имеет довольно распространенный характер, биологическое значение которого еще предстоит понять. Частое расположение LTR поблизости к генам вполне могло бы приводить к изменению характера экспрессии этих генов. Вопрос заключается в том, способны ли многочисленные LTR принимать участие в регуляции близлежащих генов. Выше уже упоминалось, что в ряде случаев такую регуляторную активность обнаруживали [67-69]. Но неясно, какая доля LTR обладает этой активностью.
Анализ транскрипционной активности индивидуальных ltr herv-k в нормальных и опухолевых тканях человека
Ранее была показана специфическая экспрессия генов HERV в плаценте и для таких видов рака, как рак легких и крови, семинома, а также для клеточной линии тератокарциномы [81, 82, 118, 146]. Известно, что при раковых заболеваниях повышается уровень транскрипции LTR HERV-KL, причем, по-видимому, наряду с LTR, входящими в состав лровируса, активируются и одиночные LTR [149]. Однако все полученные на сегодняшний день данные об участии LTR HERV в канцерогенезе не дают представления о транскрипционной активности индивидуальных LTR. Мы исследовали транскрипционную активность четырех индивидальных LTR HERV-K на панели нормальных и опухолевых тканей и клеточных линиях и показали, что все исследованные LTR обладают транскрипционной активностью и в различных типах клеток эта активность различна (см, глава 2, пункт 2.1). Поэтому остается открытым вопрос, как изменяется транскрипционная активность индивидуальных LTR семейства HERV-K при переходе от нормальной ткани к опухолевой. Для ответа на этот вопрос необходимо было провести сравнение всего пула траснкрипционно активных LTR HERV-K в нормальной и опухолевой тканях. Для решения поставленной нами задачи неотъемлемым этапом работы было создание метода, позволяющего проводить подобное сравнение целевой выборки транскриптов, а именно всего пула транскриптов, обладающих общими структурными особенностями: - наличием в составе последовательности РЭ. Существует ряд современных методов, позволяющих идентифицировать транскрипты дифференциально экспрессирующихся генов (то есть мРНК, представленные в разной концентрации в сравниваемых образцах), такие как создание и сравнительный анализ библиотек кДНК, исследования с использованием чипов (Array), субграктивпая гибридизация, дифференциальный дисплей и последовательный анализ экспрессии генов (Serial Analysis of Gene Expression, SAGE). Все эти методы получили широкое применение в наши дни и выбор того или иного из них определяется объектом исследования и поставленной задачей. Нашей задачей было сравнение всего пула LTR-содержащих транкриптов в нормальной и опухолевой тканях, при этом необходимо было учесть, что LTR может по-разному входить в состав траенкриптов (как в 3 , так и в 5 часть траенкрипта). Проведение вычитающей гибридизации РЭ-содержащих транскриптов или исследование их методом микрочипов представлялось затруднительным в силу того, что все анализируемые последовательности содержат общую последовательность -последовательность РЭ - что может исказить результаты гибридизации. Метод SAGE также неприменим для решения нашей задачи, так как он нацелен на анализ 3 фрагментов траснкриптов и не позволит обнаружить транскрипты, отличающиеся по 5 последовательностям.
Преимуществом метода дифференциального дисплея (ДД) для решения поставленной задачи является возможность сравнения одновременно нескольких образцов, возможность идентификации как up- так и down- регулируемых транскриптов и то, что для данного метода является несущественным наличие общих для всех анализируемых транскриптов последовательностей РЭ. Принципиально, ДД состоит из следующих стадий: (а) для каждого из сравниваемых образцов РНК производят упрощенные пулы фрагментов кДНК; (б) аналогичные пулы, полученные из сравниваемых РНК, разделяют на соседних дорожках полиакриламидного геля, дифференциальные фрагменты вырезают из геля и анализируют. Метод получил широкое применение, однако недостатком метода является использование случайных (arbitrary) прайм еров для амплификации кДНК [152], что приводит к тому, что проводят анализ не всего пула транскриптов, а лишь случайной выборки и каждый транскрипт может быть представлен на дисплее несколькими фрагментами разной длины. Так как мы планировали проводить сравнение всего пула LTR-содержащих траснкриптов, более удобной является модификация ДД - систематический ДД. В отличие от обычного варианта ДД, в этой модификации используют альтернативную стратегию получения пулов кДНК для сравнения и проводят анализ всего пула транскриптов, в котором каждый транскрипт представлен одним фрагментом кДНК [63, 153, 154]. Так как мы планировали анализировать определенный класс транскриптов (содержащие РЭ) наиболее оптимальным подходом для решения поставленной задачи являлся Target ДД. В этом варианте ДД за счет использования эффекта PCR супрессии и амплификации с праймером, комплементарным целевой последовательности, получают целевой пул фрагментов кДНК (содержащих РЭ в нашем случае) [155]. Для идентификации транскриптов, содержащих последовательности ретроэлемептов и сравнения спектров их экспрессии в нормальных и опухолевых тканях была разработана техника селективного дифференциального дисплея РНК, содержащих повторяющиеся последовательности генома (Selective Differential Display of RNAs containing Interspersed Repeats, SDDIR). Метод состоит из двух частей: I) селективной RT-PCR амплификации той части тотальной клеточной РНК, которая содержит РЭ; II) получения ампликонов из разных тканей для сравнения их в параллельных дорожках при помощи гель-электрофореза. Схема метода приведена на рис 2.3. Метод включает в себя следующие стадии: 1) Выделение суммарной РНК из тканей. 2) Синтез первой цепи с затравлением с праймером, комплементарным последовательности LTR HERV-K ферментом Superscript II. Этот фермент обладает способностью строить длинную кДНК, так как в нем отсутствует активность РНКазы Н, поэтому длины кДНК, получаемых в результате синтеза, определяются только качеством исходной РНК. Другой особенностью этого фермента является его способность после окончания синтеза кДНК на матрице РНК достраивать еще три нуклеотида, преимущественно С. Если в реакциоппой смеси присутствует прайм ер, несущий па 3 -конце последовательность rGrGrG, комплементарную трем достроенным нуклеотидам, то праймер отжигается, и фермент достраивает кДНК, используя праймер как матрицу. Таким образом, полученные при синтезе первые цепи кДНК имеют на концах известные последовательности, которые могут быть использованы для построения второй цепи и дальнейшей амплификации продукта. 3) Синтез второй цепи кДНК и наработка продукта полимеразой Advantage в присутствии праймера SMR22, комплементарного 5 -концу первой цепи кДНК, и праймера, комплементарного З -концу первой цепи кДНК (рис 2.3. стадия 1). 4) Обработка кДНК эндонуклеазой рестрикции. Как правило, в дифференциальном дисплее, используют рестриктазы, узнающие 4 нуклеотида (частота встречаемости таких сайтов рестрикции — 1 на 256 п.о.), чтобы получить достаточно короткие рестриктные фрагменты, которые можно разделить в полнакриламидном геле.
При выборе той или иной эндонуклеазы рестрикции необходимо, чтобы последовательности, к которым комплементарны используемые в работе праймеры, не содержали сайтов рестрикции, так как в обратном случае такие последовательности будут рестрицированы, фрагменты кДНК не будут амгогафицироваться и не будут участвовать в анализе. Был проведен анализ первичной структуры известных на сегодняшний день LTR семейства HERV-K, который показал, что все доступные рестриктазы, узнающие последовательности из четырех нуклеотидов, имеют сайты рестрикции в концевых участках 5 - или З -областей LTR. Рестриктазой, не имеющей сайтов рестрикции в LTR HERV-K, была Alul. (Сайт малочисленных старых групп). Таким образом, в результате рестрикции получали набор фрагментов, длина которых определялась расстоянием от LTR до сайта рестрикции А/н I в последовательности, прилегающей к LTR (рис. 2.3 стадия 2). 5) Репарация концов фрагментом Кленова ДНК полимеразы I Е.соН. 6) Лигирование супрессионных адаптеров (рис. 2.3 стадия 3). Для отбора LTR-содержащих рестриктньгх фрагментов проводили PCR, используя LTR-специфический праймер и праймер, комплементарный внешней части адаптора. При этом была подавлена амплификация тех фрагментов, которые не содержали последовательность LTR, и амплифицировались только LTR-содержащие фрагменты. Этот эффект называется PCR-супрессией [156] и позволяет амплифицировать из сложной смеси продуктов только целевые последовательности. В нашем случае это были фрагменты рестрикции кДНК, содержащие последовательность LTR (рис. 2.3 стадии 4а и 4Ь). Для повышения специфичности продуктов амплификации проводили дополнительный раунд PCR с праймером, комплементарным внутренней части адаптора и радиоактивно меченным внутренним праймером к LTR. 7) Денатурирующий электрофорез в 5% лолиакриламидном геле с 7М мочевиной (рис. 2.3 стадия 5). Идентификация дифференциальных полос и элюция фрагментов кДНК из геля (рис. 2.3 стадия 6).
Поиск специфичных длл опухолей интеграции ltr herv-k и line 1
Полученные данные о высокой транскрипционной активности LTR HERV-K. позволили нам предположить, что эти повторяющиеся элементы могли сохранить и свою транспозиционную активность, неотъемлемым условием которой является транскрипция. На сегодняшний день данные об участии ретроэлемептов в геномной нестабильности, возникающей при опухолевой прогрессии, очень скудны. Образование и развитие опухолей - сложный и многостадийный процесс, одним из важнейших элементов которого является возникновение на той или иной стадии нестабильности генома опухолевых клеток. Известно два типа нестабильности, связанных с опухолевой прогрессией: значительно увеличивающаяся скорость мутаций в опухолевых клетках по сравнению с нормальными аналогами [166]; хромосомные перестройки, представленные транслокациями, амгошфикациями, делециями и заменами протяженных фрагментов хромосом [27, 28, 167-172]. Причины подобной нестабильности для геномов раковых клеток до сих пор малопонятны и являются предметом активного изучения. Анализ литературных и наших собственных данных, связанных с этой проблемой, побудил нас выдвинуть гипотезу о том, что существенным фактором нестабильности может быть функциональная активность ретроэлемептов и, в частности, LTR эндогенных ретровирусов и LINE элементов. Для поиска LTR семейства HERV-K и LINE1, присутствующих в геноме опухоли и отсутствующих в геноме нормальной ткани, мы применили метод вычитающей гибридизации Targeted Genomic Difference Analysis, (TGDA) разработанный в нашей лаборатории [173], модифицировав его для поиска редких (1 на 10 клеток) перестроек геномной ДНК, Упрощенная схема метода приведена на рис. 2.9. Метод включает в себя ряд стадий: А) Селективная амплификация последовательностей, фланкирующих РЭ. (рис. 2.9 стадии 1-3) 1) Выделение геномной ДНК и рестрикция. Для рестрикции выделенной геномной ДНК использовали частощепящую рестриктазу, для которой показано отсутствие сайтов рестрикции в последовательности РЭ. 2) Лигирование супрессиошгых адаптеров А1А2. PCR амплификация с праймером, комплементарным внешней части адаптора (АР и праймером, комплементарным последовательности РЭ (ТІ). При этом за счет PCR супрессии амплификация тех фрагментов, которые не содержали последовательность РЭ, была подавлена и амплифицировались только РЭ-содержащие фрагменты (см. подробнее в главе 2, раздел 2.2). 3) Второй раунд амплификации с заглубленными праймерами (nested PCR). Один из праймеров (Т2) был комплементарен последовательности РЭ, но заглублен вовнутрь по отношению к праймеру ТІ, использованному на предыдущей стадии, другой праймер был комплементарен внутренней части адаптора (А2). Такой PCR позволяет повысить селективность амплификации целевых последовательностей. 4) Приготовление трейсера и драйвера.
В качестве драйвера для вычитающей гибридизации использовали продукты амплификации, полученные на предыдущей стадии. Для приготовления трейсера продукты амплификации разделяли на две части - трейсер А и трейсер В. Для приготовления трейсера А амплификацию проводили с праймером, комплементарным последовательности РЭ - Т2, и праймером А1А2. Для приготовления трейсера В амплификацию проводили с Рис. 2.9 Схема метода TGDA. На схеме приведены стадии TGDA, подробное описание см. в тексте, праймером, комплементарным внутренней части последовательности адаптора - А2, и праймером Т2А1 (рис. 2.9 стадия 4). Таким образом, после амплификации получали два варианта треисера, несущие последовательность прайм ера А1 только с одной стороны и на разных концах. Это позволит отбирать гомодуплексы треисера после вычитающей гибридизации амплификацией с А1 праймером, 5) Обработка треисера и драйвера экзонуклеазой III (рис, 2.9. стадия 5\ Для удаления 3 концевых последовательностей полученные трейсер и драйвер обрабатывали экзонулеазой III. В использованных нами условиях экзонуклеаза III гидролизует 60 нуклеотидов с З1 конца. Эта стадия необходима для получения 5 выступающих концов и удаления последовательностей ретроэлементов из ампликонов (наличие гомологичных последовательностей во всех молекулах ампликона мешает проведению вычитающей гибридизации и отбору гомодуплексов треисера). Таким образом получали последовательности, в которых на 51 концах были последовательности праймеров А2 и Т2, и только на 5 концах молекул треисера присутствовали последовательности праймера А1. Б) Вычитающая гибридизация (рис.2.9 стадия Б). Метод вычитающей гибридизации (Subtractive Hybridization, SH) позволяет сразу, не имея никакой предварительной информации о геномной последовательности, получать последовательности, присутствующие только в одном из сравниваемых геномов (называемые мишенями). Вычитающая гибридизация основана па реассоциации сравниваемых геномных ДНК. Сравниваемые геномные ДНК расщепляли на короткие фрагменты и смешивали, причем одну ДНК (называемую драйвером) брали в избытке по отношению к другой ДНК (называемой трейсером), денатурировали и ренатурировали, понижая температуру, В процессе реассоциации большая часть ДНК трейсера гибридизовалась с ДНК драйвера, находящейся в избытке, кроме последовательностей мишеней, которые образовывали гомодуплексы. Таким образом, реассоциировшая сама на себя часть ДНК трейсера, была обогащена последовательностями мишеней по сравнению с исходной ДНК трейсера.
Амплификацию продуктов гибридизации проводили с праймером А1, при этом экспоненциальной амплификации подвергались только гомодуплексы трейсера. Оценка чувствительности метода TGDA Важнейшими параметрами, определяющими эффективность работы методов, основанных на процессах диссоциации-реассоциации, являются кинетические. Поэтому были проведены теоретические расчеты для определения оптимальных параметров гибридизации, а именно: соотношение количеств трейсер/драйвер, концентрация трейсера и драйвера, время гибридизации (расчеты не приводятся). Исходя из теоретических положений и реальных возможностей эксперимента, было рассчитано оптимальное время гибридизации, которое меняется в зависимости от частоты встречаемости различий в анализируемых геномах (например, 1 копия па геном, 0.1 копия на геном и 0,01 копия на геном). Для количественной оценки чувствительности разработанного метода и проверки теоретических расчетов в эксперимент был введена "искусственная", отсутствующая в геноме человека, последовательность, так называемый вложенный контроль. Вложенный контроль состоял из короткого фрагмента последовательности РЭ (LTR HERV-K или LINE1) и фрагмента последовательности вектора pGEM, аналогичную схему). На схеме стрелками обозначены праймеры для амплификации, цветными прямоугольниками последовательности супрессионных адаптеров, белыми прямоугольником и -последовательность LTR, Схема включает следующие стадии: 1) Лигирование амплифицир о ванного фрагмента LTR из локуса 47334 в вектор pGEM. 2) Амплификация с праймерами, один из которых комплементарен области LTR - Т2, а второй последовательности вектора M13Rev (таким образом, в результате амплификации в поледовательность контроля входила такая же часть последовательности LTR, что и в геномных образцах). 3) Лигирование супрессионных адапторов А1А2 и амплификация фрагментов с праймерами, один из которых комплементарен последовательности LTR -Т2, а второй -внешней части адаптора — А1. 4) PCRc двумя наборами прайм еров: А1А2, А1,Т2и А1Т2, Al, А2, Концентрацию вложенного контроля можно было определять по результатам PCR с праймерами, комплементарными уникальной поледовательности вектора pGEM, присутствующей только в молекулах вложенного контроля (праймеры М13 rev М13 for2, глава 3, табл. 3). Вложенный контроль добавляли только во фракцию трейсера и, в результате вычитания, его удельная концентрация должна была возрастать. Оценивая увеличение удельной концентрации вложенного контроля, мы могли судить об эффективности вычитающей гибридизации.
Методы исследования
Выделение РНК: Отбирали часть замороженного в азоте тканевого порошка, добавляли 2 мл раствора гуанидин изотиоционата (4М гуанидин тиоционат, 0,1% саркозил, 120 мМ В-меркаптоэтанол, 25 мМ NaOAc рН 7.0). Суспендировали при помощи гомогенизатора Downs до полной гомогенности материала. Проводили центрифугирование (4С, 12000g, 2 мин.) для удаления негомогенизированных частиц. Супернатант отбирали, добавляли 5/6 объема фенола и 1/6 объема хлороформа. Раствор тщательно перемешивали па Vortex в течение 2 мин., центрифугировали (4С, 12000g, 20 мин,). Все дальнейшие операции проводили на льду. Отбирали супернатант, повторяли фенол-хлороформную экстракцию (несколько раз, до ИСЧЄЗПОВЄЕІИЯ интерфазы). При экстракции в последний раз использовали смесь фенол-хлороформ 1:1, Высаживание: К супернатанту добавляли 2.5 объема этанола и проводили высаживание при -20СС в течение ночи. Осадок собирали центрифугированием, дважды промывали 80 % EtOH, высушивали. РНК растворяли в воде. (20-40 мкл) Определение концентрации РНК. Аликвоту раствора РНК разводили в 100 раз. Полученный раствор использовали для определения количества РНК спектрофотометрическим методом. (1 о.е. соответствует 40 мкг/мл РНК), Концентрациию РНК в образце доводили до рабочей-1мкг/мкл. Анализ выделенной РНК методом гель электрофореза. Для анализа иитактности выделенной РНК, аликвоту препарата РНК (5мкг) смешивали с 3 мкл раствора для нанесения на э/ф (10% бромфенолового синего, 10 % ксилепцианола, 30 % глицерина в воде). Гель-электрофорез проводили в 2% агарозе, содержащей бромистый этидий. В качества маркера длин РНК использовался 1 т.п.о. маркер (SibEnzyme) Выделение геномной ДНК Выделение геномной ДНК из тканей человека проводили с помощью набора реактивов и протокола для выделения геномной ДНК "Wizard Genomic DNA Purification Kit" (Promega, США). 3.2.2 Обработка ДНКазой. Для удаления примесей геномной ДНК препараты выделенной РНК обрабатывали ДНКазой I. К 20 мкг РНК, растворенной в 1х ДНКазном буфере, добавляли 5 ед. акт. ДНКазы, инкубировали 10 мин. при 37С. Объем реакционной смеси - 30 мкл. Затем смесь прогревали, дважды экстрагировали смесью фенол-хлороформ для полного удаления ДНКазы, высаживали этанолом. Осадок растворяли в 20 мкл воды. 3.2.3 Синтез первой цепи кДНК. . Денатурация РНК и отжиг праймеров: К 2 мкг РНК, обработанной ДНКазой, добавляли 0.5 мкг олиго(с1Т)і5 и 0.2 мкг статистической затравки, Объем смеси для отжига был 12 мкл. Режим: денатурация 70С-3 мин,, отжиг 50 -10С (4/мин.), затем смесь переносили в лед. К 12 мкл реакционной смеси после отжига праймеров {РНК + праймеры) добавляли 15 ед. обратной транскриптазы RT (USB), 40 ед. РНазипа, 0.45 мМ dNTPs, 0.0ЇМ DTT в їх буфере RT (USB). Объем реакционной смеси- 22мют. Режим реакции: 20С- 10 мин., 37С- 30 мин., 42 С- 30 мин. Для остановки реакции добавляли 2 мкл 0.5 М ЭДТА.
Объем пробы доводили до 100 мкл, хранили препараты при-20С. Контроль па наличие примесей ДНК, «-RT» контроль Для всех образцов выделенной РНК ставили контроль на присутствие ДНК в пробе, так называемый «-RT» контроль. Для этого, 2 мкг контрольной РНК проводят через все стадии реакции, за одним исключением - в пробу не добавляют обратную транскриптазу. 3.2.4 PCR. RT-PCR PCR реакцию проводили в реакционной смеси (50 мкл), содержащей: 2.4 мкл реакционной смеси Tag DNA полимеразы и TaqStart антител, 1х буфер для PCR, 2.5 мМ MgCb, 0.125 мМ dNTPs, по 0.4 мМ праймеров for и rev, в качестве матрицы использовали кДНК в количестве, эквивалентном 20 нг тотальной РНК. Во избежание образования неспецифических продуктов реакции использовали TaqStart моноклональные антитела к Taq-полимеразе, образующие прочный комплекс с ферментом, который разрушается только при 70С. На 10 PCR реакций (объем 50 мкл) использовали следующую реакционную смесь (24мкл): 20ед Tag DNA полимеразы, 4,4 мкг TaqStart антител в lx dillution буфере. Смесь инкубировали при комнатной температуре 5-30 мин. Сверху на реакционную смесь наслаивали 25 мкл минерального масла и проводили PCR реакцию. Для дополнительного контроля чистоты реактивов и работы проводили контрольную реакцию, в которой присутствовали все компоненты, кроме ДНК. Все манипуляции проводили в перчатках и под ламинаром во избежание загрязнения. Стандартную PCR реакцию проводили в режиме: 94С - Юсек.; отжиг праймеров - температура индивидуальная для каждой пары праймеров -Юсек.; 72С -20сек. В зависимости от уровня экспрессии проводили от 27 до 36 циклов амплификации. На этих циклах из реакционной смеси отбирали аликвоты по 10 мкл для анализа на агарозном геле методом электрофореза. Геномный PCR Амплифицировали 40 нг матрицы геномной ДНК с использованием уникальных геномных праймеров (концентрация 0.2 мкМ). Стандартными условиями проведения PCR являлись: (95С - 25 сек., 60С - 25 сек., 72С - I мин. 30 сек.), х 30 циклов, в некоторых случаях температуру отжига праймеров подбирали индивидуально и варьировали количество циклов амплификации. Электрофорез ; . После проведения реакции продукты PCR амплификации (10 мкл) смешивали с 3 мкл раствора для нанесения на электрофорез. Электрофорез проводили в 1.5% агарозе, содержащей бромистый этидий. Результаты фиксировали при помощи UVP трансиллюминатора и компьютерной программы Grabbit. 3.2.5 Определение первичной структуры клонированных фрагментов ДНК и PCR фрагментов. Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили с помощью автоматического секвенатора ДНК Applied Biosystems 373 automatic DNA sequencer. 3.2.6 Подбор праймеров для амплификации. Праймеры для амплификации дифференциальных фрагментов, для которых была обнаружена гомология с известными геномными последовательностями и не содержавших повторяющиеся последовательности, подбирали с помощью компьютерных программ GeneRunner и РгітегЗ (http://frodo.wi.mit.edu/cgi- bin/primer3/primer3_www.cgi). 3.2.7 Поиск гомологии, картирование в геноме человека. Поиск гомологии в базах данных GenBank проводился с помощью сервера BLAST NCBI (http://www,ncbi.n1m.nih.gov/BLAST). картирование последовательностей в геноме человека и анализ генного окружения проводили, используя программное обеспечение UCSC Human Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/goldenPath/hgTracks.html), Идентификацию геномных повторов в исследуемых последовательностях проводили при помощи программы RepeatMasker (http://ftp.genome.washington.edu/cgi- Ып/RepeatMasker; A.F.A. Smit & Р, Green, неопубликованные данные).
Консенсусные последовательности повторяющихся элементов генома человека брали из базы данных RepBase Update (http://www.girinst.org/server/RepBase/). 5.2.5 Дифференциальный дисплей SDDIR (Selective Differential Display of RNAs containing Interspersed Repeats ). 1) Подготовку тканей, выделение РНК и высаживание РНК проводили по методике подробно описанной выше в разделе 3.2.1. 2) Обработку РНК ДНКазоЙ проводили по методике описанной выше в разделе 3.2.2. 3) Синтез 1-ой цепи кДНК проводили как описано в разделе 3.2.3, за исключением того, что использовали обратную транскриптазу Superscript II и два варианта затравления синтеза — с праймером, комплементарным последовательности LTR и праймером, комплементарным poly(A) тракту (SmrOligo (dT)) (табл. 3), в присутствии праймера SMRT#4RDh. К 2 мкг РНК, обработанной ДНКазой, добавляли 10 пм праймера PL-1 (или Smr4oligo) (табл. 3, 4), Объем смеси для отжига был 3 мкл. Денатурацию проводили 70С - 2 мин., отжиг 60С - 3 мин. Синтез первой цепи проводили в реакционной смеси объемом 11 мкл, содержащей 3 мкл реакционной смеси после отжига праймеров (РНК + праймер), 200 ед. акт. Superscript II, 2 мкМ DTT, 1 мкМ dNTPs, 1 пМ праймера SMRT#4RDh (табл. 3) при 42 С полтора часа. 4) Построение второй цепи кДНК полимеразой Advantage и амплификация кДНК с праймерами SMR22 и праймера, комплементарного последовательности LTR HERV-K, проводили как описано в разделе 3.2.4 RT-PCR, за исключением состава реакционной смеси. Реакционная смесь для PCR (объем 50 мкл) содержала: XI Advantage 2 PCR буфер, 0.25 мМ dNTPs, по 0.4 мМ праймера SMR22 и PL-1, в качестве матрицы использовали кДНК в количестве, эквивалентном 20 нг тотальной РНК. Режим реакции: 94 С — 20 сек., 60 С -30с, 72С - 2мин, Амплификацию прекращали, когда в 3 мкл реакционной смеси нарабатывали 200 нг продукта. 5) Обработка кДНК эндонуклеазой рестрикции Alul.
