Содержание к диссертации
Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
2.1. Характеристика онкогенов 6
2.2. Продукты онкогенов 23
2.3. Большие концевые повторы 33
2.4. Химический и радиационный канцерогенез в свете концепции онкогена *... 35
2.5. Экспрессия онкогенов в человеческих опухолях... 37
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 48
3.1. Выделение РНК 48
3.1.1. Центрифугирование в хлористом цезии 49
3.1.2. Метод экстракции горячим фенолом 49
3.2. Денатурирующий электрофорез РНК в агарозном геле.
3.3. Перенос денатурированной РНК на нитроцеллкшозный фильтр 51
3.4. Гибридизация РНК 51
3.5. Выделение ДНК 52
3.6. Электрофорез ДНК 52
3.7. Перенос фрагментов ДНК из геля на нитроцеллкшозный фильтр 52
3.8. Гибридизация ДНК 53
3.9. Экспозиция фильтров 53
3.10. Выделение плазмидной ДНК 53
3.11. Клонирование ДНК 55
3. II. I. Приготовление векторной ДНК 55
3.II.2. Приготовление вставки 55
З.II.З. Лигирование 55
З.ІІ.4. Трансформация клеток E.coli 56
3.12. Рестрикционный анализ ДНК 57
3.13. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей 57
3.14. Введение метки в ДНК 57
3.15. Трансформация НІН ЗТЗ клеток 58
3.16. Получение опухолей на бестимусных мышах 58
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 60
4.1. Анализ РНК опухолевых и нормальных клеток человека.. . 60
4.1.1. Получение онк-специфических зондов 61
4.1.2. Транскрипция онкогенов в клетках различных опухолей и нормальных тканей 64
4.1.3. Изменения размеров транскриптов и уровня экспрессии при опухолевом росте 74
4.1.4. Анализ экспрессии онкогена ras в клетках нормальной и опухолевой ткани молочной железы 78
4.2. Трансформация НШ ЗТЗ клеток ДНК из опухолей человека и дальнейшее получение опухолей на бестимусных мышах 81
4.3. Гибридизация онк-зондов с ДНК, выделенной из крови больных разными формами лейкозов 85
5. ВЫВОДЫ 90
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 92
Характеристика онкогенов
В середине 70-х годов D.Baltimore обобщив полученные к тому времени данные о структуре и биологии онкогенных ретровирусов, вызывающих трансформацию клеток, постулировал существование генов, входящих в состав этих вирусов - gag,pol,env и one /20/. Первые три гена необходимы для репликации ретровирусов в клетках. Ген one (онкоген) определяет трансформирующий потенциал. В настоящее время эти положения полностью подтверждены экспериментально и являются общепризнанными.
Одним из первых важнейших экспериментов доказательств существования онкогена, то есть определенного дискретного фрагмента . вирусного генома, обуславливающего трансформированный фенотип зараженной клетки, была работа .G.Martin который получил "условный" температурочувствительный мутант вируса саркомы Рауса ( ts RSV ). Культивирование трансформированных ts RSV клеток при непермес-сивной температуре в течение нескольких часов приводило к исчезновению трансформации - клетки возвращались к нормальному фенотипу. При этом изменение температуры не влияло на репродукцию вируса /112/. Дополнительные данные по доказательству существования онкогена были получены в работах по сравнительному анализу геномной РЖ Rsv и дефектного по трансформации делеционного мутанта этого вируса ( td RSV ), который образуется при длительном пассировании дикого штамма RSV in vitro. РНК td RSV оказалась на 1500 оснований короче РНК дикого варианта. Методом фингерпринтно-го анализа было показано, что отсутствующий в td -варианте фрагмент локализован в 3»-области РНК Rsv /60, 98, 168/.
В более поздних работах по трансфекции клонированных участков провируса саркомы мышей было показано, что трансформирующим действием обладает лишь вектор, несущий онкоген /39/. Аналогичные данные получены при введении клонированных онкогенов в клетки методом микроинъекции /77/. Даже прямое введение клонированного онкогена RSV цыплятам приводило к образованию опухолей в течение 4-х недель. При этом наблюдалось увеличение синтеза мРНК, специфичной для онкогена. Введенный онкоген интегрировал в ДНК генома клеток хозяина независимо от остальных эндогенных вирусных последовательностей, а опухоли имели моно- или поликлональное происхождение /77/. Следовательно, попадание онкогена в геном клетки и его экспрессии необходимы и достаточны для образования опухоли.
Выделение РНК
Все растворы, исключая буфера, содержащие гуанидин тиоциояат, освобождались от РНКазы обработкой 0,02$ диэтилпирокарбонатом и последующим автоклавированием. Вся посуда стерилизовалась 4 часа, 180С.
Операционный материал в течение 10-30 минут после удаления у больных подвергался глубокому замораживанию (жидкий азот, сухой лед), затем ткань измельчалась растиранием в ступке с жидким азотом и гомогенизировалась с помощью гомогенизатора Davens в буфере (рН 7,0), содержащем 4М гуанилин тиоционат, 0,5% лаурил-саркозил, 0,1 М маркаптоэтанол, 0,025 М цитрат натрия (рН - 7,0) и 0,1% антифоам А. На I г ткани бралось около 5 мл буфера. Для последующей обработки применялось 2 различные методики.
Гомогенат в объеме 8 мл наслаивался на подушку из 3,5 мл 5,7 М хлорида цезия в 0,025 М ацетате натрия (рН - 5,0) в нитро-целлюлозную пробирку и подвергался центрифугированию на центрифуге "Spineо" в течение 20 часов, 36 тыс. об/мин, 20С в роторе SW4I.
После центрифугирования супернатант осторожно сливался, пробирка споласкивалась этанолом и осадок РНК суспендировался в 0,4 мл стерильной воды. Добавлялся буфер в объеме 2,6 мл, содержащий 7,5 М гуанидин гидрохлорид, 0,005 М дитиотриэтол и 0,025 М цитрат натрия (рН - 7,0). Затем рН понижали добавлением 75 мкл I М уксусной кислоты примерно до 5,0 и осаждали РНК 0,5 объема холодного этанола в течение 4 часов при -20С. Центрифугировали 15 минут, 10 тыс.об/мин на центрифуге К-23. Осадок растворялся в воде, добавлялся ацетат натрия до 0,2 М, 2,5 объема этанола и оставлялся на ночь -20С. Затем осаждался центрифугированием в течение 15 минут на 10 тыс. об/мин, растворялся в воде, и после измерения концентрации на спектрофотометре, РНК хранилась под спиртом на -70С.
Анализ РНК опухолевых и нормальных клеток человека
Работы последних лет, связанные с пониманием механизма вирусного канцерогенеза (см.обзор литературы) поставили на повестку дня вопрос о роли клеточных онкогенов в процессах неопластической трансформации у высших организмов, включая и человека. Высокая степень консервативности, позволяет использовать вирусные онкогены в качестве специфических зондов для выявления гомологичных последовательностей в клетках нормальных и опухолевых тканей человека. Это делает возможным скрининг различных тканей на уровень экспрессии в них исследуемых онкогенов. Кажущаяся простота поставленной задачи осложняется рядом методологических проблем, возникающих при постановке эксперимента. Так, высокий уровень содержания в опухолевых клетках различных эндонуклеаз, затрудняет использование в качестве источника нуклеиновых кислот первичных клеток опухолей, операционного материала, без культивирования их in vitro. Это, по-видимому, явилось основной причиной для использования только культивируемого материала в экспериментах подобного характера, ПРОВОДИМЫХ В лаборатории R.Gailо И S.Aaronson /II/, В другой работе, проведенной в лаборатории Ф.Л.Киселева /10/, удалось выделить недеградированную РНК из некультивируемых клеток, однако в ней так же ставилась задача сравнительного анализа экспрессии онкогенов в клетках различных опухолей человека.
В данной работе была поставлена цель проанализировать экспрессию онкогенов в клетках нормальных и опухолевых тканей человека, причем принципиальными являлись два момента - РНК выделялась только из первичного (операционного) материала, без предварительногокультивирования in vitro , и, второе, что нормальная ткань в каждом конкретном случае, принадлежала тому же больному, у которого была удалена опухоль и была с ней однотипна. Такая постановка эксперимента дала возможность рассматривать полученные результаты с принципиально новой позиции.
