Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 15
1.1 Генетическая изменчивость 15
1.1.1 Классификация мутаций. Мутации и генетический полиморфизм 15
1.1.2 Основные методы выявления мутаций 16
1.1.3. Идентификация новых мутаций 18
1.1.4 Идентификация известных мутаций 20
1.2 Биологические микрочипы как метод анализа генома 21
1.2.1 История создания биологических микрочипов 21
1.2.2 Различные технологические платформы 22
1.2.3 Микрочипы высокой плотности в исследованиях генома человека 24
1.2.4 Диагностические микрочипы низкой плотности 26
1.2.5 Биологические микрочипы на основе трехмерных ячеек геля 27
1.3 Генетические изменения при онкологических заболеваниях 30
1.3.1 Хромосомные аберрации при лейкозах 30
1.3.1.1 Классификация лейкозов 30
1.3.1.2 Хромосомные перестройки в бластных клетках больных лейкозами 32
1.3.1.3 Методы генодиагностики лейкозов 39
1.3.1.3.1 Цитогенетический метод 39
1.3.1.3.2 FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) 40
1.3.1.3.3 Обратная транскрипция с полимеразной цепной реакцией 41
1.3.2 Структурные перестройки генов Т-клеточных рецепторов и определение Т- клональности 42
1.3.2.1 Строение генов Т-клеточных рецепторов 42
1.3.2.2 Основные методы диагностики Т-клеточной клональности 45
1.3.3 Мутации в генах BRCA1/2 и СНЕК2 и наследственные формы РМЖ иРЯ 48
1.3.3.1 Факторы риска развития РМЖ и РЯ 49
1.3.3.2 Наследственные синдромы предрасположенности к РМЖ и РЯ 50
1.3.3.3 Гены предрасположенности к РМЖ и РЯ ...51
1.3.3.3.1 TenhiBRCAl uBRCA2, их структураи функция 52
1.3.3.3.2 Ген СНЕК2, его структураи функция 56
1.3.3.4 Основные типы мутаций в генах BRCA1, BRCA2 и СНЕК2, ассоциированные с риском развития РМЖ и РЯ 58
1.3.3.4.1 Спектр мутаций генов BRCA1, BRCA2 и СНЕК2 в различных популяциях 59
1.3.3.4.2 Риск развития рака для носителей BRCA1, BRCA2 и СНЕК2 мутаций 62
1.3.3.5 Диагностика мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 64
1.4 Генетические маркеры многофакторных заболеваний 65
1.4.1 Гены ферментов системы биотрансформации 66
1.4.1.1 Генетический полиморфизм тиопурин-в-метилтрансферазы (ТРМТ) ...68
1.4.1.1.1 Метаболизм тиопуриновых препаратов в организме человека 68
1. 4.1.1.2 Фермент ТРМТ, его основные свойства и функции в клетке 70
1.4.1.1.3 Полиморфизм гена ТРМТ 71
1.4.1.2 Полиморфизм генов ферментов 1 и 2 фазы биотрансформации 74
1.4.1.2.1 Гены цитохромов Р450 74
1.4.1.2.1.1 ЦитохромР450СУР1А1 75
1.4.1.2.1.2 Подсемейство цитохромов CYPIIC 77
1.4.1.2.1.3 Цитохром Р450 CYP2D6 79
1.4.1.2.2 Гены, кодирующие ферменты фазы 2 биотрансформации 81
1.4.1.2.2.1 Суперсемейство GST 82
1.4.1.2.2.2 Ариламин-М-ацетилтрансферазы (NAT) 84
1.4.1.2.3 Гены системы фолатного метаболизма 86
1.4.1.2.3.1 Метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR) 87
1.4.1.2.3.2 Метионинсинтазаредуктаза (MTRR) 89
1. 4.1.2.4 Гены системы биотрансформации и онкологические заболевания 91
1.4.2 Генетическая предрасположенность к сердечно-сосудистым заболеваниям 93
1.4.2.1 Генетические факторы риска развития сердечно-сосудистых заболеваний...93
1.4.2.1.1 Артериальная гипертензия 93
1.4.2.1.2 Ренин-ангиотензиновая и кинин-брадикининовая системы 94
1.4.2.2.1 Характеристика генов 96
1.5 Генетический полиморфизм как основа идентификации личности на молекулярном уровне 99
1.5.1 Молекулярно-генетический анализ в судебно-медицинской экспертизе 99
1.5.2 SNP как мишень для идентификации личности 100
1.5.2Л Локус HLA-DQAI 101
1.5.2.2 Локус ABO 103
1.5.2.3 Локус AMELXY 104
2 Материалы и методы 105
2.1 Клинический материал 105
2.2 Анализ последовательностей, дизайн и синтез праймеров и зондов ..108
2.3 Технология производства биочипов 117
2.4 Выделение РНК 118
2.5 Выделение ДНК 118
2.6 Цитогенетическое исследование 119
2.7 Обратная транскрипция 120
2.8 Полимеразная цепная реакция (ПНР) 121
2.10 Флуоресцентное мечение ПЦР-продукта 131
2.9 Гибридизация на биочипе 132
2.10 Анализ изображения 132
2.11 Другие методы определения мутаций 133
2.12 Статистические методы 133
3 Результаты и обсуждение 136
3.1 Анализ генетических изменений при онкологических заболеваниях с использованием биочипов 136
3.1.1 Выявление и идентификация хромосомных транслокаций 136
3.1.1.1 Выбор транслокаций для анализа на биочипе 136
3.1.1.2 Выбор последовательностей праймеров и зондов 137
3.1.1.3 Разработка процедуры анализа транслокаций 140
3.1.1.4 Скрининг клинических образцов 142
3.1.1.5 Новое место перестройки t(l 1; 19) MLL/ELL 145
3.1.1.6 Сравнение с цитогенетическим методом 146
3.1.1.7 Клиническое значение транслокаций 148
3.1.1.8 Развитие подходов к анализу хромосомных транслокаций 150
3.1.2 Определение Т-клеточной клональности 152
3.1.2.1 Разработка биочипа для анализа перестроенных генов гамма-локуса Т-клеточного рецептора 153
3.1.2.2 Разработка процедуры анализа 154
3.1.2.3 Определение аналитической чувствительности метода 156
3.1.2.4 Апробация метода определения Т-клональности с использованием биочипа 156
3.1.3 Анализ мутаций в генах BRCA1, BRCA2 и СНЕК2, ассоциированных с наследственной формой РМЖ и РЯ 162
3.1.3.1 Разработка биочипа и процедуры генотипирования для анализа мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 163
3.1.3.2. Анализ частоты мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 в группах больных РМЖ,РЯиПМЗН 165
3.1.3.3 Клиническое значение мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 169
3.2 Анализ многофакторных заболеваний и фармакогенетические исследования с использованием биочипов.. 172
3.2.1 Анализ полиморфизма генов системы биотрансформации 172
3.2.1.1 Анализ полиморфизма гена ТРМТ. 172
3.2.1.2 Анализ полиморфизма других генов системы биотрансформации 176
3.2.1.2.1 Создание биочипа для анализа полиморфизма генов 1 и 2 фазы биотрансформации 176
3.2.1.2.2 Полиморфизм генов системы биотрансформации и риск развития
лейкозов и лимфом у жителей европейской части России 182
3.2.1.2.2.1 Распределение генотипов у взрослых пациентов с НХЛ, В-ХЛЛ
и здоровых доноров 182
3.2.1.2.2.2 Распределение генотипов у детей, больных лейкозом, и здоровых доноров 188
3.2.1.2.3 Распределение генотипов генов системы биотрансформации у здоровых жителей европейской части России 200
3.2.1.2.4 Полиморфизм генов системы биотрансформации и риск развития рецидива острого лейкоза у детей 203
3.2.1.2.4.1 Распределение генотипов у первичных больных и у больных в рецидиве заболевания 203
3.2.1.2.4.2 Роль полиморфизма генов системы биотрансформации в развитии рецидива при лейкозах 207
3.2.1.3 Анализ полиморфизма гена NAT2 210
3.2.2 Анализ полиморфизма генов ренин-ангнотензиновой системы 214
3.2.2.1 Разработка биочипа для анализа полиморфизма геновренин-ангиотензиновой системы 214
3.3 Генетическая идентификация личности на основе анализа полиморфных локусов HLADQA1, АВО И AMEL 218
3.3.1 Разработка биочипа для анализа локусов HLADQA1, АВО И AMEL 219
3.3.2 Генотипирование с использованием ИЛ-биочипа 222
3.3.3 Возможность применения ИЛ-биочипа в идентификационных исследованиях 223
3.4 Сравнение метода гибридизации на гидрогелевых биочипах с другими методами анализа мутаций 226
Заключение 228
Выводы 231
Список литературы 233
- Биологические микрочипы как метод анализа генома
- Структурные перестройки генов Т-клеточных рецепторов и определение Т- клональности
- Генетический полиморфизм как основа идентификации личности на молекулярном уровне
- Гибридизация на биочипе
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Секвенирование генома человека и пост-геномный анализ открыли новую эру в биомедицинских исследованиях. Все чаще в различных областях медицины используются данные о геноме конкретного человека. Это диагностика наследственных заболеваний, анализ генетических изменений в опухолевых клетках при уточнении диагноза и выборе терапии в онкологии. Получила развитие персонализированная медицина, которая изучает генетические особенности человека, его предрасположенность к различным заболеваниям и разрабатывает профилактические меры для их предупреждения. При лечении заболеваний с помощью современных лекарственных средств остро встает вопрос о переносимости лекарственных препаратов и предупреждении развития побочных реакций, что также может определяться генетическими характеристиками пациента. Этими проблемами занимается фармакогенетика, как одно из направлений персонализированной медицины. Также все чаще приходится прибегать к генетическому анализу при решении задач в области криминалистики и судебной медицины. Широкое использование молекулярно-генетических методов в практике невозможно без создания новых технологий, позволяющих проводить одновременный анализ множества генетических изменений. Одним из наиболее перспективных подходов являются биологические микрочипы.
Биологические микрочипы (biological microarrays), как метод анализа генома, широко используют в самых разных областях молекулярной биологии, генетики, биомедицины, онкологии. Различные технологические платформы, используемые при создании биологических микрочипов, описаны в многочисленных статьях и подробных обзорах (Lee and Saeed, 2007; Hardiman, 2006). Одной из наиболее известных является технология Affymetrix GeneChip (Santa Clara, США). Микрочипы Affymetrix содержат до 10 индивидуальных элементов (зондов) и используются для параллельного анализа более 200 000 полиморфных ДНК маркеров. Особенностью этого типа микрочипов является синтез олигонуклеотидных зондов прямо на поверхности кварцевых стекол с использованием метода фотолитографии. Также используют микрочипы, в которых на твердой подложке иммобилизованы предварительно синтезированные или выделенные фрагменты ДНК. Микрочипы, содержащие большое количество элементов, относятся к так называемым «микрочипам высокой плотности» и применяются, как правило, в исследовательских целях. Выявление ограниченного набора генетических маркеров, являющихся мишенью в диагностике, делает обоснованным переход к «микрочипам низкой плотности», содержащим десятки или одну - две сотни элементов. Как правило, в этих случаях используют микроскопические стекла с нанесенными и ковалентно пришитыми зондами. Особенностью технологии гидрогелевых биочипов является трехмерная структура ячеек геля, в которых иммобилизованы зонды (фрагменты ДНК или белки). Технология гидрогелевых биочипов развивается в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН с 1989 г. и является одной из наиболее востребованных платформ для разработки биочипов диагностической направленности.
В настоящем исследовании разработаны и апробированы следующие биочипы: ЛК-биочип для выявления и идентификации хромосомных транслокаций; ТКЛ-биочип для определения Т-клеточной клональности; РМЖ-биочип для определения мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2, ассоциированных с наследственной формой рака молочной железы; ПФ-биочип для определения полиморфизма в генах системы биотрансформации; ПФ-биочип (NAT2) для определения полиморфизма в гене NAT2; ПФ-биочип (Кардио) для определения полиморфизма в генах ренин-ангиотензиновой
системы и ИЛ-биочип для генетической идентификации личности на основе анализа однонуклеотидного полиморфизма генома человека.
Необходимость анализа транслокаций при лейкозах связана с тем, что это
заболевание занимает ведущее место среди онкологических заболеваний у детей. Всего
лишь 20 лет назад выживаемость при детских лейкозах составляла 5-10%, тогда как в
настоящее время она составляет 60-80% (по данным 5-летней оценки). Такой успех в
лечении достигнут благодаря использованию наиболее эффективных комбинаций
различных цитостатических препаратов, а также рационализации терапии, основанной
на углубленной диагностике заболевания, в том числе и с использованием молекулярно-
генетических методов (Алейникова, 2002; Карачунский и др., 2007). В настоящей работе
при создании биочипа были выбраны 13 наиболее клинически значимых и часто
встречающихся при лейкозах транслокаций: t(9;22)BCR/ABL р190 и р210,
t(\2;2\)TEL/AML, t(\;\9)E2A/PBX, t(\5;\l)PML/RARA, t(Z;2\)AML/ETO,
invl6 CBFB/MYH, t(4A\)MLL/AF4 и другие транслокации с участием reHaMLL. Каждая из этих транслокаций определяет вариант лейкоза с определенными клиническими характеристиками, характером течения заболевания, прогнозом и важна для выбора стратегии лечения (Pui С.Н. et ah, 2003).
Определение Т-клеточной клональности важно при диагностике Т-клеточных лимфом. Традиционные методы диагностики: цитология, гистология, иммунофенотипирование и иммуногистохимия во многих случаях не позволяют провести дифференциальный диагноз между опухолевой и реактивной Т-клеточной пролиферацией (Spagnolo et al., 2004). Методы молекулярной диагностики Т-клеточной клональности основаны на наличии одинаково перестроенных генов вариабельного региона Т-клеточных рецепторов (TCR) в опухолевых Т-лимфоцитах. Появление клона Т-лимфоцитов при опухоли сопровождается появлением и развитием популяции клеток с одинаковой перестройкой генов TCR, что может быть зарегистрировано по гибридизации с соответствующими зондами на биочипе.
Наличие мутаций в высоко пенентрантных генах-супрессорах BRCA1 и BRCA2 ассоциируется с повышенным риском развития рака молочной железы (РМЖ) и рака яичников (РЯ) у женщин (Miki et al, 1994; Wooster et al, 1995). Эта модель уже является объектом генетического тестирования в странах Западной Европы и в Америке. Было показано, что в России распространен ряд терминальных мутаций ("germ-line founder mutations"), анализ которых позволяет эффективно выявлять лиц с высокой предрасположенностью к развитию заболевания (Gayther et al, 1997, Tereschenko et al, 2001; Loginova et al, 2003; Sokolenko et al, 2007). Однако эти работы были выполнены на сравнительно небольших выборках. Поэтому представляло интерес проведение масштабных исследований для получения более полной картины о частоте различных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 у российских пациентов с диагнозом РМЖ и РЯ в смешанной по возрасту и семейной истории заболевания выборке, и также для выявления доли наследственных форм в общей структуре заболеваемости.
За последнее время накоплено большое число данных о том, что генетический полиморфизм лежит в основе индивидуальной чувствительности к лекарственным препаратам, а также определяет наследственную предрасположенность к многофакторным заболеваниям. Именно поэтому анализ генетического полиморфизма является чрезвычайно актуальной задачей. Одними их наиболее широко исследуемых генов являются гены системы биотрансформации, белковые продукты которых принимают участие в метаболизме всех ксенобиотиков, поступающих в организм. Выявление ассоциаций различных аллелей этих генов с конкретным заболеванием и ответом на лекарственную терапию позволяет не только выявлять механизмы заболевания и исследовать его природу, но и разрабатывать подходы к персонализированной медицине, т.е. лечению, учитывающему генетическую
индивидуальность каждого пациента. Так, наследственная недостаточность фермента
тиопурин-Б-метилтрансферазы (ТРМТ), обусловленная инактивирующими
однонуклеотидными заменами в гене ТРМТ, приводит к плохой переносимости лекарственных препаратов тиопуриновой группы (6-меркаптопурин, 6-тиогуанин и азатиоприн) (Lennard et ah, 1992). Стандартные дозы этих лекарств высоко токсичны для больных с недостаточностью фермента, причем токсический эффект может быть фатальным (Lennard et ah, 1987). В состав биочипа для определения индивидуальной переносимости лекарств также включены гены основных ферментов биотрансформации CYP1A1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, MTHFR, MTRR, NQOl, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2, участвующие в метаболизме широкого спектра лекарственных препаратов. Имеются данные, что полиморфизм в генах системы биотрансформации вносит вклад в формирование некоторых онкологических заболеваний, например, таких как лимфомы и лейкозы, а также влияет на частоту и особенности развития рецидивов при лейкозах у детей (Skibola et ah, 1999; Krajinovic et ah, 2000; Krajinovic et ah, 2002; Gemmati et ah, 2004). Исследование частоты аллелей указанных генов в российской популяции у больных и здоровых доноров позволяет выявить генетические факторы риска развития этих заболеваний или рецидива заболевания.
Дальнейшее развитие этот подход к оценке полиморфизма генома при многофакторных заболеваниях получил при создании ПФ-биочипа (Кардио), предназначенного для анализа полиморфизма некоторых генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем, участвующих в регуляции кровяного давления. Показано, что такие заболевания, как артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца и др. могут возникать вследствие неблагоприятного сочетанного эффекта многих (нескольких) аллелей полиморфных генов (Naber and Siffert, 2004). Именно поэтому, разработка подхода для одновременного анализа полиморфизма нескольких генов имеет большое значение также и в изучении сердечно-сосудистой патологии.
ИЛ-биочип разработан для применения в другой области современной медицины - судебно-генетической экспертизы. Задачи идентификации личности встают не только при поиске преступника, оставившего следы на месте преступления, но и при опознании тел погибших при природных или техногенных катастрофах, при террористических актах. В настоящее время основными методами анализа при идентификации личности остаются серологический анализ крови, и молекулярно-генетический анализ полиморфных локусов генома, известных как тандемные повторы с изменяющимся числом копий, в частности микросателлитов или STR (shot tandem repeats) (Gill, et al., 1985). Однако серологический анализ часто не эффективен при исследовании малых количеств биологических следов, а также деградированных образцов. STR-анализ требует пока еще дорогого импортного оборудования. Поэтому актуальна разработка новых недорогих подходов, обеспечивающих скрининг большого количества образцов, но в тоже время обладающих высокой специфичностью и чувствительностью.
Таким образом, биочипы могут служить удобным инструментом при анализе различных генетических изменений, включая как точечные мутации, так и некоторые хромосомные перестройки. Изучение генетических изменений человека в норме и при различных заболеваниях и разработка биочипов различной диагностической направленности для наиболее актуальных областей медицины позволяют поднять на более высокотехнологичный уровень, как современную клиническую диагностику, так и биомедицинские исследования в целом.
Цель исследования:
Целью диссертационной работы является разработка метода многопараметрического анализа различных генетических изменений у человека на основе технологии гидрогелевых биочипов для проведения эффективных молекулярно-биологических и биомедицинских исследований, а также решения задач медицинской диагностики.
Задачи работы:
-
Выбрать наиболее клинически значимые хромосомные перестройки при лейкозах у детей и разработать биочип для их выявления и идентификации. Определить частоту встречаемости хромосомных перестроек у детей, жителей России, больных различными формами лейкозов, и создать на основе биочипа диагностическую тест-систему.
-
Разработать подход для анализа структурных перестроек локуса гамма-цепи Т-клеточного рецептора с использованием биочипа и апробировать его для определения Т-клеточной клональности при диагностике Т-клеточных лимфом.
-
Разработать биочип для диагностики точечных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2, ассоциированных с наследственными формами РМЖ и РЯ, и определить частоты данных мутаций у пациентов с РМЖ и/или РЯ, жителей европейской части России.
-
Разработать методические подходы для определения генетической предрасположенности к многофакторным заболеваниям на примере биочипа для определения полиморфизма в основных генах системы биотрансформации и биочипа для анализа полиморфизма в генах ренин-ангиотензиновой системы.
-
Определить частоты аллелей генов системы биотрансформации у здоровых жителей европейской части России и у больных лейкозами и лимфомами заболеваниями. Создать на основе биочипа диагностическую тест-систему.
-
Определить частоты аллелей, приводящих к дефициту ферментной активности ТРМТ, у жителей европейской части России. Изучить значение полиморфизма гена ТРМТ при лечении детей, больных лейкозами, препаратами тиопуринового ряда (6-меркаптопурин).
-
Разработать методические походы для генетической идентификации личности по анализу генетического полиморфизма на примере локусов HLA-DQAJ, АВО и AMEL. Определить частоты аллелей генов HLA-DQA1 и АВО, а также идентификационную информативность этих локусов для жителей европейской части России.
Научная новизна результатов.
Разработаны методические подходы для выявления различных изменений в геноме человека (хромосомных перестроек и точечных мутаций) на основе технологии гидрогелевых биочипов. Создан метод диагностики 13 транслокаций при острых и хронических лейкозах с использованием гибридизации на олигонуклеотидном биочипе. Впервые в России определены частоты этих транслокаций у детей, больных лейкозом. Разработан метод определения Т-клеточной клональности на основе гибридизации на биочипе. Показана возможность применения этого подхода в клинической диагностике Т-клеточных лимфом.
Разработан метод диагностики семи наиболее распространенных точечных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 (185delAG, 300T>G, 4153delA и 5382insC в гене BRCAl, 695insT и 6174delT в гене BRCA2, и llOOdelC в гене СНЕК2). Определены
частоты этих мутаций у пациентов с РМЖ, РЯ и первично-множественными злокачественными новообразованиями (ПМЗН), жителей европейской части России, что представляет интерес для клинической онкологии.
Разработан биочип для определения полиморфизма в генах системы биотрансформации. Определены частоты полиморфных вариантов генов CYP1A1 (48870А, 4889A>G, 6235Т>С), CYP2D6 (1934G>A, 2637delA), GSTT1 (делеция), GSTM1 (делеция), MTHFR (6770Т, 1298А>С), MTRR (66A>G), NQOl (609OT), CYP2C9 (430OT, 1075C>T), CYP2C19 (681G>A) и NAT2 (341T>C, 481C>T, 590G>A, 857G>A) у взрослых, больных НХЛ или В-ХЛЛ, жителей европейской части России, и проведено сравнение с группой здоровых лиц. Показано, что полиморфные варианты гена CYP1A1 (48870А, 4889A>G, 6235Т>С) и «нулевой» GSTM1 генотип чаще встречаются у больных НХЛ и В-ХЛЛ, чем у здоровых индивидов и, таким образом, могут рассматриваться как факторы риска развития этих заболеваний.
Проведен сравнительный анализ частот генотипов и аллелей генов CYP1A1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, MTHFR, MTRR, NQOl, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2 у детей, больных острыми лейкозами, и здоровых индивидов. Впервые показано, что генотип NAT2 341Т/Т,481C/C,590G/G, а также сочетание данного генотипа с «нулевым» GSTT1 генотипом, «нулевым» GSTM1 генотипом и двойным «нулевым» GSTT1IGSTM1 генотипом встречается чаще у больных лейкозами, чем у здоровых доноров и, таким образом, может рассматриваться, как фактор риска развития лейкозов у детей. Также обнаружено, что генотип MTRR 66G/G встречается реже у девочек, больных острыми лейкозами, по сравнению с группой здоровых доноров женского пола и, таким образом, может рассматриваться как фактор, предотвращающий развитие лейкозов у девочек.
Определены частоты аллелей генов CYP1A1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, MTHFR, MTRR, NQOl, CYP2C9, CYP2C19 nNAT2 у детей с первично диагностированным острым лейкозом и в рецидиве заболевания. Показана ассоциация генотипа CYP1A1 *1/*2А и «ненулевого» GSTT1 генотипа с развитием рецидива ОЛЛ. При анализе частот аллелей гена NAT2 впервые обнаружено, что у пациентов с рецидивом ОЛЛ чаще встречается генотип NAT2 341С/-, 481T/-,590G/G,857G/G, тогда как у пациентов с рецидивом ОМЛ -генотип 341Т/Т,481С/С,590А/- (по сравнению с пациентами с первично диагностированным ОЛЛ и ОМЛ, соответственно).
Разработан ПФ-биочип (NAT2) для анализа полного спектра полиморфных замен в гене NAT2 и впервые у представителей российской популяции проведен детальный анализ полиморфизма гена NAT2.
Впервые на большой выборке определены частоты аллелей и генотипов гена ТРМТ у детей с онкогематологическими заболеваниями и здоровых доноров в европейской части России. Проведено сравнение этих данных с частотами аллелей и генотипов, полученными для других популяций. Показано, что самым частым аллелем, связанным с дефицитом ферментной активности, является ТРМТ*ЗА (85,7% от всех исследованных аллелей), а более редкими аллелями ТРМТ*ЗС (9,5%) и ТРМТ*2 (4,8%). Это согласуется с ранее полученными данными для популяций Европы и Америки.
Разработан и апробирован биочип для определения полиморфизма в генах ренин-ангиотензиновой системы - ПФ-биочип(Кардио).
Разработан биочип для идентификации личности (ИЛ-биочип), позволяющий анализировать 9 аллелей гена HLA-DQA1, 5 аллей АБО и 2 аллеля renaAMEL. Проведено исследование основных параметров информативности локусов HLA-DQA1 и АВО и показано, что средняя вероятность идентификации личности с помощью ИЛ-биочипа составляет 99,6%.
Практическая значимость работы.
Диагностическая тест-система ЛК-биочип для анализа хромосомных транслокаций при лейкозах зарегистрирована Федеральной службой Росздравнадзора (регистрационное удостоверение № ФС 01262006/4756-06 от 28 декабря 2006 г.) и разрешена к применению в клинической диагностике. ЛК-Биочип используется в гематологических клиниках для уточнения диагноза, определения прогноза заболевания и выбора терапии. РМЖ-биочип позволяет быстро и с высокой степенью достоверности диагностировать мутации в генах BRCA1/2 и СНЕК2 и также используется в онкологической практике. Выявление носителей мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 помогает выбрать эффективную стратегию лечения уже имеющегося онкологического заболевания. У здоровых носителей это позволяет выбрать тактику проведения клинического мониторинга за состоянием здоровья и профилактику онкозаболеваний.
Диагностическая тест-система ПФ-биочип для анализа полиморфизма в генах системы биотрансформации зарегистрирована Федеральной службой Росздравнадзора и разрешена к применению в клинической диагностике (регистрационное удостоверение № ФС 01262006/5317-06 от 28 декабря 2006 г.). ПФ-биочип используется в ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН и в ГУ Научном центре здоровья детей РАМН для определения индивидуальной чувствительности к некоторым лекарственным препаратам, в том числе тиопуринам, а также риска развития некоторых многофакторных заболеваний и составления генетического паспорта. ПФ-биочип (Кардио), определяющий полиморфизм в генах ренин-ангиотензиновой системы, также используется в ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН для анализа генетической предрасположенности к развитию осложнений при беременности у женщин.
Разработанный ИЛ-биочип позволяет проводить идентификацию биологических следов, содержащих ДНК со средней вероятностью идентификации 99,6%. При такой вероятности идентификации ИЛ-биочип может быть использован в судебно-медицинской практике при экспертизах, позволяющих сузить круг подозреваемых или при опознании тел погибших. При этом ИЛ-биочип позволяет определять группу крови АВ0 (заменяет серологический анализ крови) и пол индивида, что является важной информацией для следователя при поиске преступника.
Личный вклад автора.
Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Апробация работы.
Основные результаты работы были представлены на Российских симпозиумах с международным участием "Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний" (Москва, 2002, 2007, 2008, 2009), 14-й Всемирной конференции по семейным формам РМЖ и РЯ (Мадрид, 2003), Европейских конференциях по генетике человека (Бирмингем, 2003; Мюнхен, 2004; Прага, 2005; Амстердам, 2006; Ницца, 2007; Барселона, 2008), 6-ой Международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток (Звенигород, 2005), конференции Европейского совета по медицинской онкологии (Будапешт, 2005), 7-ой Международной конференции молодых онкологов "Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии" (Киев, Украина, 2006), Международной конференции "Генетика в России и мире", посвященной 40-летию ИОГен РАН (Москва, 2006), 3-ей Международной конференции "Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии в медицине" (Новосибирск, 2006), 11-ом Конгрессе педиатров России "Актуальные проблемы педиатрии" (Москва,
2007), Международной конференции по геному человека (Хельсинки, 2006), международной конференции «Генетика в России и в мире» (Москва, 2006), 10-м Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2006), Международном симпозиуме "Advanced Microarray Technologies" (Барселона, 2008). Отдельные фрагменты диссертационной работы докладывались на научных семинарах Лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН, в ГНЦ РАМН, РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН, МНИОИ им. П.А.Герцена.
По теме диссертации, помимо тезисов конференций, опубликовано 33 статьи, одна глава в зарубежном сборнике и два патента. 12 статей опубликованы в зарубежных рецензируемых журналах, 21 - в отечественных реферируемых журналах. Из числа опубликованных статей - 28 (12 зарубежных и 16 в изданиях, выпускаемых в Российской Федерации) напечатаны в журналах, рекомендуемых ВАК.
Структура и объем диссертации.
Биологические микрочипы как метод анализа генома
С конца 80-х годов началось развитие биологических микрочипов. В.ИМБ РАН под руководством Андрея Дариевича Мирзабекова работа над созданием-микрочипов велась с самых истоков этой технологии. Первая публикация А.Д. Мирзабекова и соавт. по этой теме вышла в свет в 1988 году [27]. С самого начала микрочипы предполагалось использовать для секвенирования ДНК. А.Д. Мирзабеков предложил иммобилизовать набор коротких олигонуклеотидов, содержащий все возможные последовательности определенной длины. Анализируемый с помощью гибридизации образец - фрагмент меченой ДНК с неизвестной последовательностью - находил в растворе. Частичное перекрывание последовательностей иммобилизованных олигонуклеотидов, которые гибридизовали с данным образцом, должно было дать результат. В 1988-1989 гг. независимо начали работу над идеей секвенирования с помощью гибридизации Дрманач и Чрквеняков. Они предложили иммобилизовать на двумерной поверхности анализируемую ДНК и проводить ряд последовательных гибридизаций с олигонуклеотидными зондами по аналогии с уже запатентованным к тому времени методом дот-гибридизации. Каждый раунд гибридизации должен был выявить фрагменты, где содержалась соответствующая последовательность. Предполагали, что последующая компьютерная обработка полученной базы данных позволит определить последовательности всех нанесенных на подложку фрагментов. Как выяснилось впоследствии, разработкой секвенирующих микрочипов занималась также британская компания Isis и ее сотрудник Саузерн [28]. История создания биочипов подобно изложена в обзоре Колчинского и соавт. [29]. За последние несколько лет микрочипы превратились в целое направление биологической науки и биотехнологии - десятки фирм предлагают биологические микрочипы, содержащие массивы из тысяч, десятков и сотен тысяч зондов [30-32]. Существуют различные виды биологических микрочипов, которые применяются во всем мире для широкого спектра приложений: анализ генных и хромосомных мутаций, анализ генетического полиморфизма различных организмов, выявление возбудителей инфекционных заболеваний, изучение уровня экспрессии генов, изучение ДНК-белкового взаимодействия и другие. По числу элементов, входящих в состав микрочипа, их принято подразделять на микрочипы «высокой плотности» (high-density microarrays) и микрочипы «низкой плотности» (low-density microarrays), содержащие менее 1000 элементов.
Наиболее известными платформами для создания микрочипов высокой плотности являются технологии фирм Affymetrix и Illumina. Технология Affymetrix GeneChip была изобретена в конце 1980-х группой ученых под руководством Стефана Фодора. Особенностью этой технологии является синтез олигонуклеотидов, служащих зондами при гибридизации, непосредственно на поверхности микрочипа (in situ) (рис.1) [33, 34]. Микрочипы для анализа SNP содержат до 500 000 олигонуклеотидных зондов. При подготовке пробы используются специальные протоколы, включающие серию различных ферментативных реакций. Для амплификации сразу многих фрагментов генома используют универсальные праймеры-адапторы, присоединяющиеся к участкам геномной ДНК посредством лигазной реакции. Технологическая платформа Illumina представляет собой олигонуклеотидные зонды, закрепленные на шариках размером 3 мкм. Каждый шарик со специфическим зондом содержит также кодирующие элементы, позволяющие однозначно его распознавать. Имеются различные модификации этого подхода. Шарики могут иметь голографическую кодировку, в этом случае декодирование осуществляется с помощью специального лазерного устройства. Технология позволяет анализировать одновременно до 1 000 000 SNP, точность анализа составляет 95-97% [35, 36]. При подготовке ДНК-мишенн при работе с микрочипами также используется APEX (arrayed primer extension) технология [36,37]. В основе этого метода лежит комбинация метода гибридизации и полимеразной реакции. Олигонуклеотиды, соответствующие области ДНК, примыкающей к SNP, закреплены на микрочипе. Амплифицированную геномную ДНК гибридизуют с олигонуклеотидами, а затем проводят реакцию с использованием ДНК-полимеразы и меченных различными флуорохромами ддНТФ. В этой реакции каждый олигонуклеотид, закрепленный на подложке, выступает в качестве праймера. Полимеразная реакция начинается и заканчивается присоединением к олигонуклеотиду-праймеру единственного меченого дидезоксинуклеотидтрифосфата, соответствующего нуклеотиду в матрице. По цвету флуоресценции определяется, какой именно из четырех нуклеотидов вступил в реакцию, таким образом, определяется SNP в данном сайте. Широкое применение микрочипы нашли в исследованиях природы рака, при анализе свойств опухолевых клеток, в классификации опухолей. Чрезвычайно широко используются экспрессионные микрочипы, позволяющие анализировать изменения профилей генной экспрессии в опухолевых клетках [38]. Развитие рака сопровождается также многочисленными генетическими изменениями, включая структурные перестройки генома. Генетический анализ является основным способом выявить ключевые генетические события такие, как активация онкогенов и инасктивация генов-супрессоров опухоли в развитии и прогрессии заболевания. Для пол но геномного анализа генетических изменений при раке в 1992 г. был предложен подход, получивший название сравнительной геномной гибридизации (CGH -comparative genomic hybridization) [39]. Первоначально метод CGH применялся на метафазных хромосомах и определял изменение числа копий ДНК в отдельных участках хромосом. Для этого ДНК, выделенная из опухолевой ткани, метится одним красителем, ДНК из нормальной ткани - другим красителем, далее образы смешивают и гибридизуют одновременно на метафазньтх пластинках. По соотношению гибридизационных сигналов от двух разных флуорохромов в каждом конкретном участке хромосомы делают вывод о том, происходит делеция, либо амплификация последовательностей ДНК, либо не происходит никаких изменений. Разрешающая способность этого метода невелика: метод не позволяет определять изменения менее 2 МЬр. В 1998, Пинкел и соавт., [40] применили для CGH-анализа подход, в котором метафазные хромосомы были заменены клонированными фрагментами ДНК с известной геномной локализацией. Используя CGH- чипы, изготовленные на основе ВАС (bacterial artificial сЬгото5оте)-клонов, можно определять изменения в геноме размером 1-2 МЬр, что является большим разрешением по сравнению с методом флуоресцентной гибридизации FISH (fluorescence in situ hybridization). С использованием CGH-чипов обнаружены многие потери и добавления ДНК в геноме опухолевых клеток, особенно в случаях с множественными перестройками генома. Например, при анализе генома опухолевых клеток у пациентов с острым нелимфобластным лейкозом (ОНЛЛ) были выявлены некоторые гены как потенциальные мишени для последующей направленной или «таргетной» (от target - мишень) терапии [41]. Например, при анализе с помощью CGH-чипов образцов диффузной крупноклеточной В-лимфомы (DLBCL, diffuse large B-cell lymphoma) было показано, что изменения копийности происходили в 9 участках генома, 6 из них имели размер 10 МЬр или меньше [42]. Потеря участков хромосом 2 (2.4-4.1 МЬр) и 16 (33.8-35.6 МЬр) были определены, как индикаторы плохого прогноза, в то время, как утрата участков хромосомы 1 (78.2-79.1 МЬр), напротив, ассоциировалась с хорошим прогнозом. SNP-микрочипы содержат до 1000 000 олигонуклеотидных последовательностей, позволяющих анализировать точечные замены в последовательности ДНК. Наиболее широко такие микрочипы используются для полногеномного сканирования, то есть определения большого числа (200 000- 500 000) вариаций последовательностей ДНК по всему геному [43, 44]. Такие исследования позволяют обнаружить новые гены-мишени, ассоциированные с самими различными заболеваниями. В первую очередь такой подход оказался эффективен при анализе многофакторных заболеваний, таких как сердечнососудистые заболевания [45], диабет [46], болезнь Альцгеймера [47] и др. SNP-микрочипы также используют для определения копийности участков генома. Поскольку SNP встречаются в геноме с частотой 1 на 300 нуклеотидов, становится
Структурные перестройки генов Т-клеточных рецепторов и определение Т- клональности
Все физиологические функции Т-клеток реализуются в результате взаимодействия Т клеточного рецептора (TCR) с соответствующим антигеном. По своей структуре и способности распознавать антиген TCR напоминают иммуноглобулины В-клеток, но представляют собой мембрансвязанные гетеродимеры, состоящие из двух цепей. Большинство Т лимфоцитов несут на своей поверхности сфCR, которые состоят соответственно из двух цепей, аир. Небольшая часть Т лимфоцитов (у5-лимфоциты) несут TCR, который состоит из других цепей - у и 5. Каждая цепь TCR содержит вариабельный (V) участок, который выступает из мембраны, и константный (С) участок, заякоренный в мембране (Рис. 10). Уникальная структура TCR формируется на генном уровне. Когда предшественники Т-клеток мигрируют из костного мозга в тимус, они еще не несут на своей поверхности TCR, а все TCR- локусы имеют структуру, свойственную клеткам зародышевой линии [101]. Сегменты (гены), из которых состоят локусы, можно разделить на четыре группы V (variable, вариабельные), D (diversity, определяющие разнообразие), J (joining, Гены 5 цепи и а цепи располагаются вперемежку, и этот локус носит название а/5 локуса, располагается на 14 хромосоме (14qll.2). Протяженность локуса 1000 т.п.о.. В этом локусе к а цепи относятся 49 V генов, 61 J ген и 1 С ген. К 5 цепи относятся 3V, 3D, 4J, 1С. Пять V генов в этом локусе могут участвовать в перестройках как а, так и 5 цепи. Длина V генов в среднем составляет 400-700 п.о., J генов - 50-70 п.о., D генов 15-20 п.о. Все гены расположены на хромосоме кластерами, при этом расстояние между ними и между кластерами в сотни раз превышает длину самих генов [100-102]. В тимусе в клетке-предшественнице Т-лимфоцита происходят перестройки генных локусов TCR: сначала во всех тимоцитах происходит перестройка 5 локуса, а затем у локуса, затем последовательно локусов В- и а- цепи. Перестройка локусов происходит в определенной последовательности. Сначала один из D сегментов соединяется с одним из J генов, а затем к DJ сегменту присоединяется один из V генов. Если D сегмент отсутствует (например, в локусе у цепи), то соединяются один из V и J генов. Соединение генов (сегментов) происходит в результате механизма сайт-специфической рекомбинации, т.е. на конце любого сегмента находится специфический сайт, по которому происходит соединение.
Сайт состоит из двух олигонуклеотидных последовательностей длиной 7 п.о. (гептамер) и 9 п.о. (нонамер). Специальные ферменты участвуют в распознавании этих сайтов, сближении участков, и последующем разрезании ДНК [102]. Показано, что не все гены участвуют в перестройках, некоторые гены используются в перестройках чаще, а другие совсем редко. В локусе TCRy перестраиваются гены: V2,V3,V4,V5,V7,V8,V9,V10,V11. Наиболее часто в перестройках участвуют V гены 1 семейства (V2,V3,V4,V5,V7,V8) -80%, на V9, V10 и VII приходится менее 20% перестроек, причем частота использования V генов снижается в ряду Vy9-Vyl0-Vyll. На перестройки Jy2 приходится 72% случаев, на перестройки JyP2 - около 16%, a Jyl, JyP, JyPl используются редко (менее 10% случаев) [103]. В результат реарранжировки образуется новый ген, с которого считывается мРНК, а затем и белок Т клеточного рецептора (Рис. 12). На стыке V-D-J или V-J генов формируется уникальный сайт CDR3: в месте соединения может встраиваться или удаляться небольшое число, от 1 до 10, нуклеотидов (N), что на белковом уровне приводит к сдвигу рамки считывания и изменению аминокислотной последовательности. нуклеотидов (соединительное разнообразие). Таким образом, разнообразие Т клеточных рецепторов и их антигенсвязывающих сайтов формируется благодаря тому, что 1) в перестройках участвует большое количество V-, D-, J-генов, (герминальное разнообразие); 2) соединение генов происходит случайным образом (комбинационное разнообразие) и 3) в месте соединения генов происходит добавление или удаление небольшого числа нуклеотидов. В процессе развития в тимоцитах последовательно происходят перестройки TCR локусов: 5— у— р— сс. При этом перестройка у локуса происходит, как правило, чуть раньше перестройки р локуса. Перестройка каждого локуса TCR может пройти на одной хромосоме (моноаллельная перестройка) или на двух гомологичных хромосомах (биаллельная перестройка). Молекулярные методы определения Т-клеточной клональности основаны на том, что в норме в каждом Т-лимфоците гены Т-клеточного рецептора (TCR) перестроены уникально, и появление клональных Т-лимфоцитов, например при Т-клеточной лимфоме, означает появление лимфоцитов с одинаковой перестройкой генов TCR. На сегодняшний день существует два основных метода для определения Т-клеточной клональности: Саузерн блоттинг и ПЦР анализ. Молекулярный анализ обычно осуществляется по TCRy и TCRP локусам [104-106]. В TCR5 локусе слишком мало генов
Генетический полиморфизм как основа идентификации личности на молекулярном уровне
Около 20-ти лет назад молекулярно-генетический анализ впервые был применен в области судебно-медицинской экспертизы. В июле 1985 года Джефрисом с соавторами была опубликована работа "Individual-specific "fingerprints" of human DNA", а уже в декабре вышла статья об использовании геномной «дактилоскопии» в судебной экспертизе [426, 427]. В нашей стране первая экспертиза такого рода, позволившая изобличить особо опасного преступника, была проведена в 1988 году на базе Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН и Бюро Главной судебно-медицинской экспертизы Минздрава России [428]. В основе идентификации личности молекулярно-генетическими методами лежит высокая полиморфность (изменчивость) генома человека. В процессе развития методической базы менялись мишени, на которые был направлен анализ. Так первыми маркерами стали минисателитные тандемные повторы [426, 427]. Типичный VNTR (variable number of tandem repeats) регион представляет собой фрагмент ДНК длиной несколько тысяч оснований, содержащий огромное количество идентичных тандемно повторяющихся последовательностей. Длина повторяющейся единицы VNTR региона обычно составляет 8-80 оснований. В ходе анализа VNTR-региона геномную ДНК подвергают рестрикции, далее VNTR- фрагменты разделяют электрофоретически в геле и проводят блот-гибридизацию по Саузерну на нейлоновой мембране, при этом используют радиоактивную или флуоресцентную метку. Этот метод стал настоящим прорывом в криминалистике, хотя и имел ряд серьезных ограничений. Разница в протяженности соседних аллелей, отличающихся друг от друга на один повтор, мала и их приходится объединять в мультиплексные «блоки» или «пулы», что сильно затрудняет статистический анализ. Кроме этого метод относительно затратный по времени и требует большого количества не деградированной геномной ДНК (50-100 нг) [429]. В середине 90-ых годов появился другой метод, так же основанный на анализе тандемных повторов. Однако этот метод использует короткие тандемные повторы STR (shot tandem repeats) или микросателитные последовательности. Микросателиты имеют повторяющуюся единицу размером 2-7 оснований, общая их длина составляет обычно 100-450 оснований, поэтому степень деградации ДНК не так критична, как при анализе VNTR последовательностей. Так как STR метод основан на полиморфизме длин амплифицированных продуктов, то он не требует большого количества ДНК (обычно около 1 нг). Раньше амплифицированные STR фрагменты разделяли электрофорезом в геле и визуализировали, окрашивая серебром. Эта технология стала более чувствительной с использованием флуоресцентных меток. Еще больше повысить чувствительность удалось, используя метки инфракрасной области флуоресценции (на реакцию требуется всего 10 пкг геномной ДНК).
В настоящее время, при STR-анализе используют несколько флуоресцентных меток в мультиплексной ПЦР и визуализацию при помощи капиллярного электрофореза [429]. Бесспорно, микросателитные последовательности очень удачная мишень для идентификационного анализа, так как они, во-первых, мультиаллельны, и, следовательно, достаточно информативны, во-вторых, расположены в не кодирующих областях ДНК и не могут давать никакой диагностической информации, касающейся, например, предрасположенности к различным заболеваниям. По современным представлениям любая информация о здоровье, в том числе и генетическом, человека, об особенностях его организма не может быть общедоступной без согласия этого человека. Однако все больший интерес у судебно-медицинских экспертов вызывают полиморфные участки кодирующей части ДНК (обычно это SNP, делеции и инверсии) так как возможность предсказания некоторых фенотипических признаков разыскиваемого преступника, например, расовой принадлежности, цвета глаз, волос, примерного роста представляется очень перспективной. Однако при подборе локусов для такого генетического анализа важно следить за тем, чтобы результаты не несли никакой диагностической информации о состоянии здоровья [430]. В настоящее время уже доступны два коммерческих продукта для анализа фенотипических признаков. Компания «DNAPrint genomics» (США) выпустила набор DNAWitness, позволяющий определять расовую принадлежность и набор RETINOME, позволяющий анализировать гены пигментации и предсказывать цвет глаз [431, 432]. Была проведена оценка количества биаллельных локусов, которое бы позволило достичь такой вероятности идентификации как при анализе стандартными наборами для STR анализа [433]. Оказалось, что 50 биаллельных локусов с частотой встречаемости аллелей в диапазоне 0,2-0,8 обладают таким же потенциалом идентификации, как 12 STR-локусов. Анализ мультиаллельных локусов значительно уменьшает необходимый минимум анализируемых локусов без потери информативности. Для анализа SNP в целях идентификации в настоящее время предлагаются различные методы, например, прямое секвенирование, генотипирование по кривым плавления ДНК, масс спектрометрия [434, 435]. Так же анализ SNP может быть реализован и на биологическом микрочипе. В нашем исследовании были выбраны три полиморфных локуса для создания пилотного варианта биочипа, который мог бы быть использован для идентификации личности. Гены главного комплекса гистосовместимости, кодирующие антигены лейкоцитов человека (HLA-human leukocyte antigens) характеризуются высокой степенью полиморфности. Эти гены связаны с отторжением трансплантатов у реципиента в случае пересадки органов или клеток от донора с отличными вариантами HLA генов. Локус HLA-DQA1 относится ко второму классу генов гистосовместимости и экспрессируется в клетках иммунной системы или в тканях, связанных с ее формированием и функционированием. Ген DQA1 кодирует а-цепь антигена лейкоцитов и вместе с продуктом гена DQB-1 ((3-цепь) экспрессирует гетеродимер HLA-DQ. Гены кодирующие а- и р-цепи полиморфны и могут продуцировать четыре гибридные молекулы у одного индивида, образуя цис- и транс- комплексы. Так как локус HLA-DQA1 контролирует иммунный ответ, выявлена ассоциация некоторых вариантов этого гена с заболеваниями связанными с иммунитетом, например множественный склероз, аллергии, псориаз, нехватка иммуноглобулина А, диабет первого типа и другие. Ген HLA-DOA1 расположен на 6 хромосоме (6р21.3), состоит из 6 экзонов и 5 интронов, и имеет протяженность 6233 п.о. В настоящее время известно 34 аллеля гена DQA1. Анализируя только 2 экзон, кодирующий внеклеточный домен, можно разделить все описанные аллели на 9 групп (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla). На рис. 28 представлен участок второго экзона со всеми известными SNP, который будет рассмотрен в данной работе [436]. Основными методами генотипирования локуса HLA-DOA1 в настоящее время остается прямое секвенирование [436] и аллель-специфичная ПЦР (наборы производства компании ЗАО «НПФ ДНК-технология», Москва) (http://www.dnaechnology.ru/). Однако секвенирование - это достаточно дорогой и трудоемкий метод, а основным недостатком аллель-специфичной ПЦР, как уже отмечалось, является невозможность параллельного анализа нескольких локусов одновременно.
Гибридизация на биочипе
Флуоресцентное мечение проводили на втором этапе ПЦР двумя способами. В первом случае использовали праймер, содержащий на 5 -конце флуоресцентную метку. При этом меченый праймер добавляли в ПЦР-смесь в более высокой концентрации (5-20 раз), чем немеченый праймер, таким образом, чтобы преимущественно нарабатывалась одна меченая цепь. В качестве флуоресцентной метки использовали оригинальный индодикарбоцианиновый краситель, разработанный в ИМБ РАН [446], структурно относящийся к ряду пентаметиновых цианиновых красителей, известных под коммерческим названием Су 5. Краситель характеризуется высокой яркостью флуоресценции и обеспечивает высокую чувствительность регистрации результатов анализа, не влияет на результаты ПЦР и на термодинамику образования дуплексов при гибридизации на чипе. При другом подходе оба праймера на втором этапе были немечеными, но концентрация одного из них была в 5-20 раз больше, так чтобы нарабатывалась преимущественно одна цепь ДНК, при этом флуоресцентную метку содержал один из дезоксинуклеотидтрифосфатов, встраивающихся в de novo синтезируемую цепь ДНК. Использовали разработанный в ИМБ РАН, дезоксиуридинтрифосфат флуоресцентно-меченый индодикарбоцианиновым красителем (Су5-дУТФ). Строение флуоресцентно-меченого дезоксиуридинтрифосфата обеспечивает эффективное его встраивание Taq -полимеразой, не влияет на термодинамику образования дуплексов при гибридизации и характеризуется высокой яркостью флуоресценции. Применение флуоресцентно меченого дезоксиуридинтрифосфатов по сравнению с методом флуоресцентно меченых праймеров позволяет в несколько раз увеличить чувствительность регистрации результатов анализа. 2.9 Гибридизация на биочипе Для гибридизация меченого продукта на биочипе использовали смесь с общим объемом 30-35 мкл, которая состояла из 6xSSPE (Promega, США), 10-25% формамида (Serva, США) и флуоресцентно меченного амплификата. Гибридизационную смесь полностью денатурировали в течение 5 минут при 95С, быстро охлаждали во льду, наносили на биочип под крышку гибридизационной камеры и инкубировали в течение 10-12 часов при 37С. Использовали также гибридизационную смесь, содержащую 1,0-1,5 моль гуанидин-изотиоцианата, 1 ммоль Hepes (Sigma, США) и 10 ммоль ЭДТА. После завершения инкубации гибридизационную смесь удаляли. Биочип отмывали в lxSSPE буфере (Promega, США) в течение 10 мин при комнатной температуре. После этого поверхность биочипа высушивали сжатым воздухом и проводили регистрацию флуоресцентных сигналов. Флуоресцентный сигнал от ячеек микрочипа регистрировали с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного прибором с зарядовой связью (ПЗС) и программным обеспечением Imageware (ИМБ РАН, Россия). На изображение биочипа накладывали сетку из окружностей, соответствующих размеру ячеек. В качестве исходных данных использовали нормированные сигналы флуоресценции Jm = (lm - Io)/(Bm - Io), где Im -интенсивность сигнала на единицу площади внутри соответствующей ячейки, Вт -интенсивность сигнала на единицу площади вне ячеек, отражающая распределение освещенности микрочипа, 1о - темновой ток ПЗС матрицы, am- номер ячейки чипа. Алгоритм дальнейшей обработки сигналов зависел от конкретной исследовательской задачи.
Программа ImageWare позволяет автоматизировать процесс получения и обработки флуоресцентных картин гибридизации. проводили на базе Центра коллективного пользования «Геном» ИМБ РАН с помощью набора реактивов BigDye Terminator Version 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100-Avant (Applied Biosystems, США). SSCP-анализ. SSCP-анализ был выполнен в Гематологическом научном центре РАМН. ДНК денатурировали в растворе с низкой ионной силой. 5 мкл ПЦР продукта разводили в 15 мкл LIS-раствора (10% раствор сахарозы + 0,01% бромфеноловый синий), полученную смесь инкубировали в течение 5 минут при температуре 99, а охлаждали во льду до 0 в течении 2-х минут и наносили на гель. Электрофорез проводили в 8% полиакриламидном геле (соотношение акриламид/бисакриламид - 39/1) размером 20 на 20 см в 0,5х ТВЕ (Tris 45мМ, борная кислота 45мМ, ЭДТА 1мМ) буфере при 50 V в течение 18 часов при 4С на приборе Electrophoresis Constant Power Supply (ECPS 3000/150). Гель окрашивали серебром с помощью набора Silver staining kit (Promega, США) [447]. Определение событий. У детей, больных лейкозом, результаты терапии определялись. по проценту достижения полной ремиссии, количеству рецидивов, летальных исходов в ремиссии, количеству детей в полной продолжительной ремиссии и по кривым бессобытийной выживаемости. Регистрация ремиссии проводилась при наличии в костно-мозговом пунктате менее 5% бластных клеток при полиморфной цитологической картине костного мозга, нормальном анализе крови и отсутствии экстрамедулярных проявлений лейкемии. Диагноз костномозгового рецидива устанавливали при наличии более 25% бластных клеток в костном мозге для пациентов с ОЛЛ; и более 10% бластных клеток в костном мозге или любое экстрамедуллярное поражение- не менее чем через 1 месяц после установления первой клинико-гематологической ремиссии. При отсутствии информации о пациенте в течение 6 месяцев, он считался выбывшим из-под наблюдения (LFU, losto-follow-up). Определение информативности локуса. Для описания идентификационного потенциала локуса в судебно-генетических экспертизах использовали параметры, определяемые из частот встречаемости аллелей и генотипов. Считают информативность локуса при Р1С 0.5 высокой, при 0.25 Р1С 0.5 средней и при Р1С 0.25 низкой [448]. Для оценки эффективности применения определенного локуса в судебно-медицинской экспертизе так же оценивают потенциал исключения отцовства (РЕ - power of exclusion) и усредненный индекс отцовства (PI - Typical Paternity Index). Эти два параметра могут быть оценены через значения гетерозиготности (отношение количества гетерозигот к общему числу индивидов в выборке) и гомозиготности (отношение количества гомозигот к общему числу индивидов в выборке). PE = h2(\-2 h H2) PI = (Н + h)/ 2Н, где Н-значение гомозиготности, h-значение гетерозиготности [449]. В экспертизе спорного отцовства используется величина статистической частоты аллеля q, которая является мерой распространенности в популяции индивидуализирующего признака, присущего сравниваемым субъектам (ребенку и предполагаемому отцу). q = —-, где qj- статистическая частота і-го аллеля, Nj-число генотипов в выборке, в которых N присутствует данный аллель, N- количество всех генотипов в выборке. Если определение отцовства осуществляется по нескольким независимым (несцепленным) локусам можно получить общую статистическую частоту всех отцовских аллелей q = Y[ Чі і Индекс отцовства PI связан с величиной q следующим соотношением: PI = —. Ч Вероятность отцовства (РР - parternity probability), величина, которая является результатом проводимой экспертизы, вычисляется по формуле Байеса: Определение частот аллелей и генотипов, анализ ассоциаций. Для проверки соответствия распределения генотипов ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга использовали стандартный метод х [450]. При сравнении частот аллелей и генотипов и оценке связи аллелей генов с риском развития злокачественных лимфом и лейкозов использовали двусторонний точный тест Фишера (программа GraphPad InStat). Относительный риск развития заболевания при определенном генотипе (OR - odds ratio) рассчитывался по формуле:
![Конструирование нового многокомпонентного пробиотика и использование его в комплексной терапии хеликобактер-ассоциированных заболеваний [Электронный ресурс]](/i/i/4271/187546.png "Конструирование нового многокомпонентного пробиотика и использование его в комплексной терапии хеликобактер-ассоциированных заболеваний [Электронный ресурс] Белова Ирина Викторовна")
