Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Церулоплазмин: строение и функции 13
1.1. Структура молекулы церулоплазмина 13
1.2. Функции церулоплазмина, его физиологическая роль 21
ГЛАВА 2. Современные представления о механизмах действия оптического излучения на биосистемы 33
2.1. Влияние УФ-излучения на белковые макромолекулы и имунокомпетентные клетки 33
2.2. Воздействие лазерного излучения на биообъекты 42
ГЛАВА 3. Объекты и методы исследования 51
3.1. Объекты исследования 51
3.2. Методы исследования 51
3.2.1. Лазерное облучение исследуемых образцов 51
3.2.2. Облучение объектов ультрафиолетовым излучением 53
3.2.3. Регистрация электронных спектров поглощения растворов церулоплазмина человека 53
3.2.4. Методика проведения гель-фильтрации 54
3.2.5. Методика проведения качественной реакции на гексозы 54
3.2.6. Методика проведения электрофореза 55
3.2.7. Хемилюминесцентный метод определения супероксиддисмутазной активности плазмы крови 57
3.2.8. Методика дефибринирования крови 58
3.2.9. Получение лимфоцитов 58
3.2.10. Определение чистоты клеточных суспензий 59
3.2.И. Определение жизнеспособности лимфоидных клеток 60
3.2.12. Метод люминолзависимой хемилюминесценции 60
3.2.13. Определение естественной пероксидазной активности лимфоцитов 61
3.2.14. Определение оксидазной активности растворов церулоплазмина 62
3.2.15. Определение ферроксидазной активности церулоплазмина в плазме крови 63
3.2.16. Определение супероксиддисмутазной активности церулоплазмина 64
3.2.17. Определение ферментативной активности каталазы и супероксиддисмутазы эритроцитов крови человека 66
3.2.18. Статистическая обработка результатов 67
Результаты экспериментов и их обсуждение 68
ГЛАВА 4. Влияние УФ-излучения на структурные характеристики и функциональные свойства молекул церулоплазмина человека 68
4.1. Влияние УФ-излучения на спектральные свойства растворов церулоплазмина 68
4.2. Гель-хроматографические свойства церулоплазмина человека, модифицированного УФ-излучением 73
4.3. Электрофоретические свойства нативного и УФ-облученного церулоплазмина человека 77
4.4. Активность церулоплазмина в норме и при патологии (гломерулонефрит) 83
4.5. Воздействие УФ-света на функциональные свойства церулоплазмина и кинетику оксидазной реакции 85
4.6. Влияние УФ-облучения на супероксиддисмутазную активность плазмы крови 92 CLASS ГЛАВА 5. Проявление защитных свойств церулоплазмина по отношению к лимфоцитам и его модификация аскорбиновой кислотой в условиях УФ-облучения 95 CLASS
5.1. Проявление лимфоцитами естественной пероксидазной активности в условиях УФ-облучения 95
5.2. Влияние церулоплазмина на уровень ПОЛ в мембранах
нативных и УФ-модифицированных лимфоцитов 96
5.3. Сочетанное действие УФ-излучения и аскорбиновой кислоты на спектральные свойства церулоплазмина человека 100
ГЛАВА 6. Изменение структурно-функциональных свойств церулоплазмина при действии лазерного излучения 110
6.1. Спектральные характеристики растворов церулоплазмина, модифицированного излучением гелий-неонового лазера 110
6.2. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на гель- хроматографические свойства церулоплазмина человека 113
6.3. Действие излучения гелий-неонового лазера на электрофоретические характеристики церулоплазмина 116
6.4. Действие излучения гелий-неонового лазера на функциональную активность церулоплазмина 120
Заключение 124
Выводы 128
Список литературы
- Функции церулоплазмина, его физиологическая роль
- Воздействие лазерного излучения на биообъекты
- Регистрация электронных спектров поглощения растворов церулоплазмина человека
- Гель-хроматографические свойства церулоплазмина человека, модифицированного УФ-излучением
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время не ослабевает внимание ученых к изучению влияния оптического излучения на биообъекты. Напротив, в последние годы в этой области исследований возросла доля теоретических работ по сравнению с прикладными. Это связано, в первую очередь, с тем, что в медицинской практике накоплен уже достаточно большой объем данных об успешном применении ультрафиолетового и видимого излучений. Для достижения терапевтического эффекта при лечении различных заболеваний наиболее часто применяют метод аутотрансфузии УФ-облученной крови (АУФОК) и эндоваскулярное лазерное облучение крови (ЭЛОК). В связи с этим остро стоит вопрос о необходимости раскрытия закономерностей и механизмов действия оптических излучений с целью прогнозирования возможности и эффективности применения данных методов для лечения более широкого спектра заболеваний.
Актуальность проблемы диктует необходимость глубокого и целенаправленного изучения действия низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) и ультрафиолетового излучения на молекулярно-клеточном уровне для выяснения ключевых механизмов, лежащих в основе лечебного действия света на живые организмы.
К настоящему времени накоплены экспериментальные данные о влиянии на биообъекты различных диапазонов длин волн электромагнитных излучений. Для терапевтических целей в основном используют НИЛИ с длинами волн 632 нм и 830-888 им, которое дают гелий-неоновые и углекислот-ные лазеры. Низкоинтенсивное лазерное излучение не вызывает видимых деструктивных изменений в тканях, однако, поглощаясь биологическими структурами, оказывает на них фотохимическое действие. Разнообразные биологические эффекты, проявляющиеся при действии НИЛИ на молекулярном, клеточном, тканевом и организменном уровнях, обусловливают ши-
7 рокий диапазон медицинских эффектов: противоотечный, противовоспалительный, обезболивающий, бактерицидный, иммуномодулирующий и др. [48, 55, 66]. Биологический эффект связан в первую очередь с акцепцией квантов света ферментами, имеющими в составе металлосодержащие про-стетические группы. Акцепторами НИЛИ, запускающими клеточный ответ, являются церулоплазмин, супероксиддисмутаза [17, 31, 103], каталаза, глута-тионпероксидаза, дегидрогеназы, фосфатазы и др. [13,44, 106, 158].
Аутотрансфузия УФ-облученной крови в настоящее время также широко используется при лечении гнойно-септических, сердечно-сосудистых и других заболеваний [51]. При проведении экспериментальных и клинических исследований выявлен противовоспалительный, дезинтоксикационный, иммуномодулирующий эффект действия УФ-света [83, 93], его роль в структурно-функциональных модификациях ферментов антиоксидантной системы защиты организма: супероксиддисмутазы, каталазы, пероксидазы и др. [4, 10,76].
Характерной особенностью механизмов действия видимого и длинноволнового УФ-света на молекулярно-клеточном уровне является их зависимость от присутствия кислорода, что указывает на ведущую роль реакций фотоокисления [46, 222]. Механизм "кислородной зависимости" эффектов УФ-облучения связан со способностью ( выступать в роли акцептора первичных восстановительных радикалов реакций фотолиза Н20 с образованием активированных кислородных метаболитов (АКМ), в частности, синглетного
кислорода ('СЪ), супероксидного анион-радикала (Ог)> гидроксильного радикала (ОН*) и пероксида водорода (Н202). Кроме того, АКМ могут образовываться в результате поглощения квантов света белками. Эти реакционно-способные продукты зарегистрированы при облучении видимым монохроматическим (лазерным) и полихроматическим светом различных клеток человека и животных in vitro [144, 153, 212]. В связи с этим большой интерес
8 представляют данные о состоянии антиоксидантной системы в условиях лазерного и УФ-облучения.
В литературе практически отсутствуют сведения о влиявши низкоинтенсивного лазерного и ультрафиолетового излучений на один из важнейших глобулинов крови - церулоплазмин (ЦП), который, во-первых, является основным белковым антиоксидантом плазмы крови, проявляя как специфическую, так и неспецифическую активность, связанную со снижением уровня АКМ; во-вторых, обладает оксидазной активностью, окисляя различные суб-страты, в том числе и Fe (ферроксидазная активность); в-третьих, является основным медь-транспортным белком и, в-четвертых, относится к "белкам острой фазы", поэтому уровень его активности в плазме крови служит критерием при диагностике и прогнозе течения воспалительных заболеваний.
С целью выявления механизмов действия оптического излучения представляется необходимым изучение влияния ультрафиолетового и низкоинтенсивного лазерного излучений на структурно-функциональные свойства церулоплазмина. Исследование фотоиндуцированных процессов на биофизическом и биохимическом уровнях способствует выявлению молекулярных механизмов, лежащих в основе эффектов биологического действия излучения на организм. Это позволит теоретически обосновать практическое применение методов АУФОК и ЭЛОК в клинической практике.
Цель и задачи диссертационной работы. Целью настоящей работы явилось изучение структурно-функциональных свойств церулоплазмина человека в условиях лазерного и УФ-облучения.
В связи с этим перед нами стояли следующие задачи:
Изучить влияние УФ-света (240-390 нм) на спектральные, хромато-графические и электрофоретические свойства церулоплазмина человека.
Исследовать функциональную (оксидазную и супероксиддисмутаз-ную) активность церулоплазмина в условиях УФ-облучения.
Изучить действие низкоинтенсивного лазерного излучения (632,8 нм) на структурно-функциональные характеристики церулоплазмина.
Проанализировать сочетанное действие УФ-света и церулоплазмина на состояние мембран лимфоцитов крови человека.
Научная новизна. Работа является комплексным исследованием, посвященным изучению структурных свойств и функциональных особенностей церулоплазмина в условиях УФ- и лазерного облучения.
Впервые исследовано влияние широкого диапазона доз (151 + 4530 Дж/м ) интегрального потока (240-390 нм) УФ-излучения на спектральные, хроматографические и электрофоретические свойства церулоплазмина человека. Наблюдаемые изменения спектральных характеристик ЦП свидетельствуют о значительных структурных перестройках молекулы глико-протеида. Зарегистрированное методом гель-хроматографии снижение кажущейся молекулярной массы ЦП после действия максимальных доз УФ-света позволяет высказать предположение о возможных нарушениях структуры молекулы, затрагивающих микроокружение активного центра фермента, что приводит к снижению оксидазной активности вследствие затруднения кон-формационных взаимодействий субстрата (донора электронов) и атомов меди в составе активного центра ЦП.
Показано повышение супероксиддисмутазной активности церулоплазмина после УФ-облучения его растворов; УФ-модификация плазмы крови приводит к аналогичному, но менее выраженному эффекту.
Исследования, посвященные изучению влияния видимого света (632,8 нм), подтверждают обратимый характер процессов разворачивания и сворачивания молекул гликопротеида, о чем свидетельствуют фотоиндуци-рованные изменения хроматографических и спектральных свойств ЦП. Изменения электрофоретических свойств указывают на потерю холоцеруло-плазмином меди и переходом части молекул белка в форму апоЦП, что со-
10 провождается разворачиванием глобулы вследствие разрыва водородных связей между доменами 1 и 6.
Показано увеличение функциональной активности ЦП при облучении светом гелий-неонового лазера, причем более фоточувствителыюй оказалась супероксиддисмутазная активность.
Выявлено, что инкубация лимфоцитов с церулоплазмином приводит к понижению уровня пероксидного окисления липидов (ПОЛ) мембран клеток, при УФ-модификации клеточных суспензий защитный эффект фермента понижается.
Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы расширяют современные представления о структурно-функциональных изменениях одного из антиоксидантных ферментов- церулоплазмина при действии на него излучения ультрафиолетовой и видимой областей спектра электромагнитных колебаний.
Эксперименты с применением широкого диапазона доз низкоинтенсивного лазерного и УФ-излучения выявляют динамику фотоиндуцирован-ных превращений молекул ЦП и позволяют установить закономерности связи между дозой облучения и наблюдаемым эффектом. Полученные результаты дополняют представления о механизмах, лежащих в основе модифицирующего действия оптического излучения на сложные белки. Это вносит вклад в раскрытие сущности процессов, обусловливающих положительные эффекты ЭЛОК и АУФОК или других видов фототерапии. Результаты проведенных модельных экспериментов можно использовать для подбора оптимальных доз облучения при лечении различных заболеваний.
Данные, полученные при исследовании фотоиндуцированных процессов на поверхности лимфоцитов (уровень процессов ПОЛ, изменение естественной пероксидазной активности), позволяют понять пути изменения состояния мембран изолированных лимфоцитов в условиях УФ-облучения.
Предложенная схема событий, протекающих при УФ- и лазерном облучении растворов церулоплазмина, помогает раскрыть совокупность процессов, инициированных излучением, что может быть полезно для понимания молекулярных аспектов действия различных методов фототерапии.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены: на IV Съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2001); IV Международной конференции "Циклы природы и общества" (Ставрополь, 2002); Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2002); III Международном Конгрессе "Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине" (Санкт-Петербург, 2003); 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003); Междисциплинарной конференции с международным участием "Новые биокибернетические и телемедицинские технологии 21 века для диагностики и лечения заболеваний человека" (Петрозаводск, 2003); III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 6 тезисов.
На защиту выносятся следующие положения:
УФ-излучение (240-390 нм) в дозах 151-^4530 Дж/м индуцирует модификацию спектральных, хроматографических, электрофоретических и функциональных свойств церулоплазмина человека, обусловленную обратимыми процессами восстановления и реокисления Си I типа.
Воздействие аскорбиновой кислоты на нативный и предварительно облученный УФ-светом в дозах 15К4530 Дж/м церулоплазмин способствует обратимому восстановлению Си I типа. Аскорбат проявляет фотопротекторные свойства по отношению к церулоплазмину, более выраженные при предварительной инкубации с гликопротеидом.
Низкоинтенсивное лазерное излучение (632,8 нм) приводит к процессам разворачивания или компактизации белковой глобулы; наблюдается обратимый переход части молекул холоцерулоплазмина в апоформу.
Схема возможных процессов в молекуле церулоплазмина, приводящих к изменению структуры и основных функциональных свойств глико-протеида при его фотомодификации УФ-светом и низкоинтенсивным лазерным излучением.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает 153 страницы машинописного текста, 10 таблиц, 51 рисунок. Состоит из введения, шести глав, заключения, выводов. Список литературы содержит 228 источников, из них 109 - отечественных и 119 - зарубежных.
Функции церулоплазмина, его физиологическая роль
Церулоплазмин относится к немногочисленному классу ферментов, катализирующих восстановление кислорода до воды, минуя стадию образования пероксида водорода: 2DH+l/202- 2D + H20, где D—окисленная форма донора электронов [122, 184]. Во время каталитического акта ионы меди фермента восстанавливаются субстратом.
Молекулярный кислород реокисляет медь и восстанавливается до воды, присоединяя четыре электрона от энзима. В случае ЦП множество субстратов, включая фенолы и ароматические амины, могут быть окислены белком [139, 146]; р-фенилендиамин является классическим веществом для определения ферментативной активности ЦП [214], однако, Fe(II) - лучший донор электронов по сравнению с другими субстратами in vitro [228]. В настоящее время ферроксидазная активность церулоплазмина рассматривается как одна из основных функций белка in vivo, так как именно благодаря ей ЦП играет важную роль в метаболизме и гомеостазе железа, обеспечивая окисление Fe до Fe3+, и, следовательно, встраивание Fe3+ в апотрансферрин, который может присоединять только окисленную форму металла [148, 185].
В работе [166] показано ингибирующее действие аскорбата на ферро-ксидазную активность ЦП в области кислых значений рН. При рН 7,4 не наблюдается существенного ингибирующего эффекта, следовательно, аскорбат не является ингибитором церулоплазмина в физиологических условиях, но этот факт необходимо принимать во внимание, если соотношение аскорбат -церулоплазмин в плазме высокое (например, у новорожденных). Действие ингибитора основано не на взаимодействии с ЦП, а на конкуренции с апотрансферрином за ионы Fe3+, образующиеся в результате ферроксидазной реакции церулоплазмина. Аскорбат восстанавливает Fe до Fe , препятствуя встраиванию окисленных ионов в апотрансферрин. Аффинность транс-ферринов к ионам Fe(III) снижается с уменьшением рН [175], это объясняет, почему степень ингибирования аскорбатом увеличивается при снижении значения рН.
Анионы известны как сильные ингибиторы церулоплазмина. В частности, широко представлено в литературе влияние N3 на ферментативные свойства ЦП [129, 130, 145]. В области кислых значений рН и в присутствии избытка Nf по отношению к белку отмечается снижение оптической плотности полосы поглощения ЦП при 610 нм и связанная с этим потеря окси дазной активности. Существует несколько гипотез относительно молекулярных причин этого явления, включающих прямое взаимодействие N3 с ионами меди первого типа и аллостерические изменения одного или более "голубых" центров, индуцированные присоединением аниона к трехядерному кластеру.
В случае меньших концентраций анионов (N3 и СГ) и рН 7,0 наблюдается противоположный эффект: возрастание поглощения при 610 нм и снижение оптической плотности при 330 нм, что может быть обусловлено внутримолекулярным переносом электрона от восстановленного Си 1С к ионам меди III типа. Ферроксидазная активность ЦП при этом существенно не изменяется, в то время как оксидазная увеличивается [177].
Молекула ЦП состоит из одной полипептидной цепи, имеющей несколько особо уязвимых для действия протеаз пептидных связей. Под действием протеазы полипептидная цепь ЦП расщепляется на фрагменты с разными величинами молекулярной массы, которые обладают оксидазной активностью по отношению к о-дианизидину и L-цистеину [14]. Интактная молекула ЦП и два наиболее крупных ее фрагмента окисляют о-дианизидин и L-цистеин, а более низкомолекулярные - только L-цистеин. Для окисления таких субстратов, как о-дианизидин, фермент использует многоступенчатый перенос электронов по цепи, составленной из пространственно сближенных ионов Си2+. В то же время окисление других субстратов, например, L-цистеина, может происходить без участия всего каталитического центра. Скорее всего, оно катализируется одиночными ионами меди I типа, удален ными от активного центра. Не исключено, что и ионы Си из состава каталитического центра, оказавшись в разобщенных малых фрагментах полипептидной цепи ЦП, способны к самостоятельному окислению субстратов типа L-цистеина.
Е.Л.Саенко и др. (1986) провели изучение кинетики реакций окисления, катализируемых церулоплазмином. Экспериментальные исследования показали, что ионная сила раствора не оказывает существенного влияния на вид кинетической кривой и активность ЦП; при 37 С оксидазная активность фермента оставалась неизменной в течение трех суток. Ферментативный характер реакций окисления, происходящих в присутствии ЦП, подтверждается линейным характером зависимости начальной скорости реакции от концентрации фермента. Для реакций окисления пирокатехина, и-фенилендиа-мина и адреналина оптимальными оказались значения рН 5,0-5,7, для реакции окисления Fe(II) - рН в интервале 5,0+7,5. Также было выявлено, что двухсубстратная реакция окисления Fe(II) подчиняется механизму с образованием тройного комплекса.
Воздействие лазерного излучения на биообъекты
Лазер представляет собой источник монохроматического когерентного света с высокой направленностью светового луча. Слово "лазер" составлено из первых букв английского словосочетания, означающего "усиление света в результате вынужденного излучения".
Одним из важнейших свойств лазерного излучения является возможность получения чрезвычайно высокой степени его монохроматичности, недостижимой в излучении нелазерных источников. Это и другие уникальные свойства лазерного излучения возникают в результате согласованного испускания световых квантов многими атомами рабочего вещества.
В 1954 г. русские физики Н.Г. Басов и A.M. Прохоров и независимо от них американский ученый Ч. Таунс использовали явление индуцированного испускания для создания микроволнового генератора радиоволн с длиной волны X, = 1,27 см. Спустя несколько лет, в 1960 г., американским физиком Т. Мейманом был создан первый действующий квантовый генератор оптического диапазона - лазер. Первый гелий-неоновый лазер был создан в 1961 г., он стал широко доступным источником когерентного света.
Лазерное излучение характеризуется такими свойствами, как временная и пространственная когерентность, поляризованность, монохроматичность, плотность мощности и энергии излучения.
В настоящее время существует множество способов и вариантов проведения лазеротерапии, которые разделяют в зависимости: - от мощности излучения (высокоинтенсивное и низкоинтенсивное (терапевтическое)); - от точек приложения (непосредственное воздействие на органы и ткани, фотодинамическая терапия, применение облученных инфузионных жидкостей и медикаментов); - от способа доставки лазерного излучения к тканям и органам пациентов (внутривенное лазерное облучение крови (ВЛОК), экстракорпоральное облучение крови, подведение лазерного излучения к патологическому очагу с помощью эндоскопической техники, воздействие на болевую точку или проекцию органа через кожу, надвенное воздействие на кровь); - в комбинации с другими физиотерапевтическими факторами (магни-тотерапией, ультразвуком и др.) [38].
В последние годы в результате создания современных лазеров в клиническую практику внедряются новые способы применения низкоэнергетического лазерного излучения, которое используется в медицине в двух ос новных направлениях: при лечении лазеротерапией широкого круга различных воспалительных заболеваний, где проявляется стимулирующий эффект НИЛИ [47, 55, 99 221] и при фотодинамической терапии опухолей, где проявляется поражающий эффект НИЛИ [101, 132, 149, 188].
Для терапевтических целей в основном используют НИЛИ с длинами волн 632 нм и 830-888 нм (красной и инфракрасной области спектра электромагнитных волн), которое дают гелий-неоновые и углекислотные лазеры. Низкоинтенсивное лазерное излучение лежит в пределах плотности потока излучения от 0,1 до 100 мВт/см и не вызывает видимых деструктивных изменений в тканях. При этом излучение, будучи поглощенным теми или иными биологическими структурами, оказывает на них фотохимическое действие.
В основе механизма поражающего действия НИЛИ при фотодинамической терапии опухолей лежит инициация фотосенсибилизированных сво-боднорадикальных реакций, возникающих в результате взаимодействия квантов лазерного излучения с молекулами фотосенсибилизатора (гемато-порфирин, фталоцианин) в присутствии кислорода, что приводит к избирательному разрушению клеток опухоли [192].
Для НИЛИ характерна резкая зависимость величины и даже знака эффекта от дозы облучения и функционального состояния биологического объекта, что значительно затрудняет применение лазеротерапии. Установлено, что с увеличением дозы характер биоэффекта изменяется от стимулирующего до летального исхода. Позитивное, стимулирующее действие проявляется, как правило, в узком интервале доз облучения, а затем исчезает или даже сменяется угнетающим действием. Однако следует учитывать, что при одной и той же дозе, но с увеличением плотности мощности и с уменьшением экспозиции биоэффект усиливается [41, 94, 136].
Регистрация электронных спектров поглощения растворов церулоплазмина человека
Для оценки СОД-активности использовали ранее разработанную на кафедре биофизики и биотехнологии Воронежского госуниверситета методику, основанную на реакции генерации Ог системой рибофлавин-тетраметилэтилендиамин, которая сопровождается хемилюминесценциеи (ХЛ) [83]. Основными факторами, инициирующими протекание хемилюми-несценции в биологических системах, считают образование активных форм кислорода и последующие свободно-радикальные реакции липидов и других клеточных составляющих. Однако такие реакции характеризуются низкой интенсивностью свечения и ее зависимостью от случайных примесей, что заставляет использовать различные хемилюминесцентные зонды - вещества, которые обладают свечением, вступая в химические реакции с определенными промежуточными соединениями изучаемых реакций и образуя продукт в возбужденном состоянии. Наиболее известный химический активатор хемилюминесценции - 3-аминофталевый гидразид - люминол [19].
СОД-активность определяли по ингибированию ХЛ в присутствии опытных образцов. Среда инкубации содержала 0,1 мл образца, 0,1 мл раствора тетраметилэтилендиамина (0,05 моль/л) в этилендиаминтетраацетате Na (0,2 моль/л), 0,5 мл дистиллированной воды, 0,1 мл Na-фосфатного буфера (0,05 моль/л, рН 7,4), 0,2 мл рибофлавина (0,034 ммоль/л). Реакцию инициировали облучением лампой видимого света (100 Вт) на расстоянии 20 см в течение 60 с. За 10 с до истечения времени облучения для усиления ХЛ вносили 0,1 мл люминола (0,25 ммоль/л). После облучения кюветное отделение перемещали в рабочее положение перед фотокатодом фотоэлектроум-ножителя в биохемилюминометре БХЛ-06М и регистрировали интенсивность ХЛ. СОД-активность (А) оценивали в относительных единицах по формуле: где Ік - интенсивность ХЛ в контрольной кювете; 10 - интенсивность ХЛ в опытной кювете, содержащей 0,1 мл опытного образца (супернатанта исследуемых лимфоцитов или плазму, разведенную Na-фосфатным буфером (0,05 моль/л, рН 7,4) 1:9).
Подчеркивая перспективность хемилюминесцентного метода, хотелось бы отметить его преимущество при исследовании плазмы крови. Метод характеризуется оптимальной экспрессностью (малые объемы проб, быстрота регистрации (1 мин), простотой подготовки образцов к исследованию) и высокой чувствительностью. Кроме того, благодаря небольшой толщине слоя реакционной смеси при облучении и при регистрации вспышки ХЛ метод позволяет проводить определение супероксиддисмутазной активности в сложных системах, таких как плазма, что невозможно при использовании спектрофотометрического метода. Регистрация и обработка результатов полностью автоматизированы, а используемый прибор совместим с персональным компьютером.
Венозную кровь доноров в количестве 20 мл (без антикоагулянтов и консервантов) помещали в колбу объемом 50 мл со стеклянными шариками диаметром 6-7 мм. Колбу встряхивали в течение 7-Ю минут, в результате чего фибрин крови переходил в сгусток. Дефибринированную кровь переносили в другой сосуд и разбавляли раствором Хенкса в соотношении 1:1.
Выделение лимфоцитов из дефибринированной крови доноров проводили с помощью седиментации в градиенте плотности фиколл-урографина по методу A.Boyum [2]. В центрифужную пробирку на 1 мл раствора фиколл урографина (р= 1,077 г/мл) наслаивали 3 мл разведенной крови. Центрифугирование осуществляли на центрифуге типа MPW-340 в течение 15 мин при 1500 об/мин. В результате кровь разделялась на отдельные фракции клеток в зависимости от их плавучей плотности: лимфоциты оставались на поверхности градиента, а эритроциты и гранулоциты проникали в него и оседали на дно пробирки. Слой лимфоцитов собирали по всей площади сечения пробирки, переносили в чистую, сухую центрифужную пробирку и разбавляли раствором Хенкса в соотношении 1:4. Пробу центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин. Затем надосадочную жидкость удаляли, а полученный осадок ресуспендировали в растворе Хенкса, доводя концентрацию лимфоцитов до рабочей с помощью камеры Горяева.
Гель-хроматографические свойства церулоплазмина человека, модифицированного УФ-излучением
Анализ данных табл. 1 и рис. 13 и 14 показывает, что растворы натив-ного церулоплазмина человека в условиях эксперимента элюируют из хрома-тографической колонки одной фракцией с кажущейся молекулярной массой 123,5+3,7 кДа, что соответствует литературным данным: молекулярная масса молекулы ЦП составляет 120-140 кДа [71], по данным исследования кристаллов ЦП 132+4 кДа [168].
УФ-облучение приводит к некоторым изменениям величин молекулярных масс церулоплазмина, количество фракций при этом не изменяется.
УФ-свет в дозах 151 4-1359 Дж/м не вызывает статистически достоверных изменений величины молекулярной массы фракции УФ-облученного гли-копротеида по сравнению с контролем. Увеличение дозы УФ-излучения до 2265 Дж/м приводит к достоверному уменьшению исследуемого параметра до величины 102,2±5,9 кДа. Воздействие максимальной экспозиции УФ-света (4530 Дж/м ) вызывает дальнейшее изменение кажущейся молекулярной массы белка до 98,2+7,2 кДа. Наблюдаемое снижение тестируемого параметра может быть обусловлено тремя возможными причинами: компактизацией белковой глобулы вследствие фотоиндуцированных процессов ее сворачивания, отрывом углеводных компонентов от молекулы ЦП и/или фрагментацией полипептидной цепи.
В литературе имеются сведения о том, что полипептидная цепь церулоплазмина легко фрагментируется в реакции ограниченного протеолиза [202, 204], причем ее разрыв происходит всегда по определенным пептидным связям, что приводит к образованию одних и тех же фрагментов; на рис. 15 приведена схема протеолитического расщепления молекулы ЦП [183].
Анализ полученных нами данных позволяет сделать заключение о том, что УФ-облучение растворов церулоплазмина человека не приводит к образованию полипептидов с молекулярной массой около 19 или 28 кДа, о чем свидетельствует наличие только одного пика, соответствующего церуло-плазмину, на кривой профиля элюции; следовательно, разрывы связей в полипептидной цепи, приводящие к фрагментации молекул, отсутствуют.
Уменьшение кажущейся молекулярной массы молекул ЦП может быть связано с отрывом олигосахаридных цепей от белковой глобулы. Для выявления наличия углеводного компонента церулоплазмина, не связанного с белком, после облучения раствора ЦП в дозе 4530 Дж/м , мы провели исследование гель-хроматографических свойств фотомодифицированного белка, направленное на разделение углеводной части ЦП и собственно ЦП в случае разрыва связи между ними. Гель-фильтрацию проводили на сефадексе G-50, при этом церулоплазмин выходил в свободном объеме колонки.
Известно, что углеводный компонент ЦП содержит большое количество гексоз (см. рис. 5), поэтому нами была выбрана реакция, направленная на определение именно этих углеводов. Положительная реакция на углеводы во фракциях, содержащих ЦП, и отсутствие таковой во всех остальных пробах говорит о том, что все углеводы полностью связаны с белком (рис. 16).
Таким образом, было установлено, что уменьшение кажущейся молекулярной массы белка на 23,9 % при воздействии УФ-света в дозе 4530 Дж/м2 не связано с отрывом углеводного компонента церулоплазмина.
На основании изложенных фактов можно сделать следующие обобщения. Интактный церулоплазмин представляет собой гомогенную смесь молекул; низкомолекулярные белковые компоненты в нативных и УФ-модифицированных образцах отсутствуют. После облучения растворов ЦП не наблюдается образования межмолекулярных сшивок белка. Снижение величин кажущихся молекулярных масс хроматографических фракций белка,
Зарегистрированное методом гель-хроматографии снижение кажущейся молекулярной массы ЦП после действия максимальных доз УФ-света, свидетельствующее об уменьшении объема молекулы белка, позволяет высказать предположение о возможных перестройках в микроокружении активного центра фермента, приводящих к изменению ферментативной активности вследствие затруднения конформационных взаимодействий субстрата (донора электронов) и атомов меди в составе активного центра ЦП.
Для изучения структуры и полиморфизма биологических макромолекул, наблюдения за их конформационными превращениями под воздействи ем различных физико-химических факторов в молекулярной биологии и биофизике наряду с хроматографическим анализом широкое распространение получили многочисленные разновидности электрофоретических методов исследования биосистем.
В наших экспериментах был использован метод вертикального диск-электрофореза с применением в качестве носителя полиакриламидного геля. Нами были изучены электрофоретические свойства и проведена количественная оценка фракционного состава, электрофоретической подвижности и соотношения отдельных компонентов церулоплазмина человека до и после его УФ-модификации.
