Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Роли пигментов в защите растений от фотоокислительного повреждения (обзор литературы) 15
1.1. Специфика фотозащитных пигментов 15
1.2. Эволюция фотозащитных пигментов 17
1.3. Фотозащитные пигменты растений 19
1.3.1. Микоспорин-подобные аминокислоты 20
1.3.2. Фенольные соединения 21
1.3.3. Беталаины 28
1.3.4. Каротиноиды 29
1.4. Распределение фотозащитных пигментов в клетках и тканях растений 33
1.5. Накопление фотозащитных пигментов и оптические свойства растении 38
1.5.1. Особенности спектров фотозащитных пигментов in vivo 39
1.5.2. Методология недеструктивного анализа фотозащитных пигментов с использованием спектроскопии отражения 43
1.6. Механизмы фотоокислительиого повреждения и защиты от него у растений 57
1.6.1. Образование АФК в растениях 57
1.6.2. УФ-индуцировашюе повреждение растений 62
1.6.3. Механизмы элиминации АФК и возбужденных состояний Хл 65
1.7. Индукция синтеза фотозащитных пигментов 70
1.7.1. Индукция каротиногенеза у одноклеточных водорослей 70
1.7.2. Каротиногенез и его индукция у высших растений 74
1.7.3. Индукция синтеза фенольных соединений 76
1.8. Фотозащитные пигменты и устойчивость к фотоповреждению 78
1.9. Некоторые подходы к оценке эффективности действия фотозащитных пигментов 84
1.10. Задачи исследования 88
ГЛАВА II. Объекты и методы исследования 91
2.1. Объекты исследования 91
2.1.1. Одноклеточные водоросли 92
2.1.2. Высшие растения 94
2.2. Условия облучения 99
2.2.1. Солнечное УФ излучение 99
2.2.2. Искусственное облучение 99
2.3. Выделение тилакоидов и липидных глобул из клеток водорослей 99
2.4. Анализ жирных кислот 100
2.5. Выделение кутикулы плодов 101
2.6. Микроскопия 102
2.6.1. Световая микроскопия 102
2.6.2. Электронная микроскопия 102
2.7. Экстракция и анализ пигментов 103
2.8. Хроматография 105
2.8.1. Тонкослойная хроматография 105
2.8.2. ВЭЖХ 105
2.9. Измерение параметров переменной флуоресценции хлорофилла 107
2.10. Спектральные измерения и обработка спектральных данных 107
2.10.1. Обработка спектров поглощения 108
2.10.2. Обработка спектров отражения и пропускания 109
2.10.3. Микроспектрофотометрия 112
2.11. Использованные реагенты и материалы 113
2.12. Статистическая обработка результатов 113
ГЛАВА III. Изменения оптических свойств растений под влиянием фотозащитных пигментов и разработка недеструктивных методов их анализа 115
3.1. Оптические свойства суспензий P. incisa при адаптации к сильному свету и отсутствию азота 115
3.1.1. Спектры поглощения суспензий P. incisa при действии сильного света и азотном голодании 116
3.1.2. Связь изменений оптических свойств с накоплением липидов у P. incisa 118
3.1.3. Спектры поглощения хлоропластов P. incisa 122
3.2. Влияние накопления родоксантина на оптические свойства листьев и пластид Aloe arborescens 126
3.2.1. Спектры поглощения пластид 127
3.2.2. Оптические свойства листьев 129
3.3. Влияние антоцнанов на оптические свойства листьев на уровне целых органов и отдельных клеток 135
3.4. Влияние адаптации к сильному солнечному свету на оптические свойства плодов 140
3.4.1. Общие особенности спектроскопии плодов 140
3.4.2. Изменение спектров отражения плодов под действием сильного солнечного света 144
3.4.3. Влияние солнечного УФ излучения на спектры отражения плодов 151
3.4.4. Оптические свойства поверхностных структур плодов в связи с
адаптацией к действию УФ излучения 152
3.5. Разработка методов недеструктивного анализа пигментов в плодах яблони
по спектрам отражения 163
3.6. Особенности изменения оптических свойств растений при фотоадаптации в связи с
накоплением фотозащитных пигментов (обсуждение результатов) 185
ГЛАВА IV. Изменения оптических свойств растений при фотоповреждении 190
4.1. Фотоповреждение водоросли P. incisa 191
4.2. Влияние фотоповреждения на оптические свойства плодов яблони 196
4.2.1. Изменение оптических свойств плодов яблони при солнечном ожоге 196
4.2.2. Изменение спектров отражения при облучении сильным видимым светом 200
4.3. Изменение спектров отражения на терминальных стадиях повреждения плодов 207
4.4. Общие особенности растительных объектов при фотоповреждении (обсуждение результатов) 218
ГЛАВА V. Изменения пигментного состава растений при фотоадаптации и фотоповреждении 225
5.1. Динамика содержания каротиноидов, хлорофиллов и жирных кислот при фотоадаптации P. incisa 226
5.1.1. Рост P. incisa в различных условиях культивирования 226
5.1.2. Динамика содержания каротиноидов и хлорофиллов в культурах P. incisa 228
5.1.3. Изменения состава каротиноидов в культурах P. incisa при различной освещенности 232
5.1.4. Динамика содержания жирных кислот у P. incisa при высокой освещенности и недостатке азота 234
5.1.5. Связь между содержанием жирных кислот и пигментов у P. incisa при высокой освещенности и дефиците азота 238
5.2. Изменения пигментного состава созревающих плодов яблони при действии сильного солнечного света 239
5.2.1. Содержание общих каротиноидов, хлорофиллов и флавоноидов в плодах яблони 240
5.2.2. Закономерности изменения содержания пигментов при созревании плодов яблони 244
5.2.3. Влияние сильного солнечного света на динамику содержания пигментов в созревающих плодах яблони 255
5.2.4. Влияние солнечного излучения на трансформацию каротиноидов при созревании плодов яблони 257
5.3. Кетокаротинонды в листьях алоэ при адаптации к сильному солнечному свету 262
5.4. Содержание антоцианов и флавонолов при адаптации к солнечному свету 264
5.4.1. Облученность солнечным УФ и динамика содержания Фл 270
5.4.2. Необходимость солнечного УФ для индукции синтеза флавонолов 272
5.4.3. Исключение солнечного УФ и динамика фотосинтетических пигментов в плодах яблони. 272
5.5. Разрушение хлорофиллов и каротнноиодов при фотоповреждении растений 275
5.5.1. Деструкция пигментов при искусственном облучении созревающих плодов яблони 276
5.5.2. Деструкция хлорофиллов и каротиноидов при солнечном ожоге яблок 280
5.6. Особенности изменения пигментного состава растений при фотоадаптации и
фотоповреждении (обсуждение результатов) 283
5.6.1. Адаптивное значение изменений пигментного и липидного состава P. incisa 283
5.6.2. Влияние фотоадаптации на трансформацию пигментов при созревании плодов яблони 289
5.6.3. Роль солнечного УФ в индукции адаптивных изменений пигментного состава плодов яблони 293
5.6.4. Особенности изменений пигментного состава при фотоадаптации и фотоповрежденин плодов яблони 296
5.6.5. Родоксантин как альтернатива антоцианам 298
ГЛАВА VI. Локализация фотозащитных пигментов 301
6.1. Сайты локализации фотозащитных каротиноидов 301
6.1.1. Локализация Р-каротинау P. incisa 301
6.1.2. Локализация родоксантина у алоэ древовидного 305
6.1.3. Анатомия кожицы и ультраструктура пластид плодов яблони 309
6.2. Локализация фенольных соединений 312
6.2.1. Антоцианы в листьях 312
6.2.2. Флавонолы и антоцианы в кожице плодов яблони 314
6.3. Общие закономерности локализации пигментов, экранирующих видимое и УФ излучение (обсуждение результатов) 315
ГЛАВА VII. Накопление фотозащитных пигментов и устойчивость фса к фотодеструкции 321
7.1. Каротииоиды и фотоингибирование P. incisa на сильном свету и прн дефиците азота 322
7.2. Значение различных групп фенольных соединений в формировании устойчивости плодов яблони к УФ-В излучению 324
7.2.1. Флавонолы и устойчивость к УФ-индуцированному повреждению 325
7.2.2. Сравнительная оценка роли антоцианов и флавонолов в формировании
устойчивости к УФ 327
7.3. Влияние фотозащитных пигментов на устойчивость ФСА к повреждению
видимым светом 332
7.4. Влияние изменений пигментного состава при фотоадаптции на функционирование и
устойчивость ФСА (обсуждение результатов) 334
Заключение 340
Основные выводы 348
Литература
- Фотозащитные пигменты растений
- Выделение тилакоидов и липидных глобул из клеток водорослей
- Влияние антоцнанов на оптические свойства листьев на уровне целых органов и отдельных клеток
- Изменение оптических свойств плодов яблони при солнечном ожоге
Введение к работе
Существование растений как фотоавтотрофов теснейшим образом связано с поглощением и утилизацией ими энергии солнечного излучения в ходе фотосинтеза. Основные пигменты растений, локализованные в ти-лакоидных мембранах хлоропластов, способны эффективно улавливать кванты света и передавать их энергию другим компонентам фотосинтетического аппарата (ФСА) для синтеза АТФ, НАДФ-Н и фиксации С02 [Ладыгин, 2000, 2002; Ort, 2001; Бухов, 2001].
Наряду с избыточным излучением в видимой части спектра (фото-синтетически активной радиации, ФАР), повреждение растений может вызывать УФ излучение, совокупная доля которого в солнечном излучении на поверхности Земли достигает 7—9% [Bjorn, Murphy, 1985; Jansen et al, 1998; Caldwell et al, 2003]. Коротковолновое УФ излучение (УФ-С, длина волны меньше 280 нм) практически полностью поглощается в верхних слоях атмосферы. Излучение в более длинноволновых областях спектра, УФ-В (280-315 нм) и УФ-А (315-400 нм), составляет соответственно 5 и 90% общей энергии в УФ диапазоне [Bjorn, Murphy, 1985; Caldwell et al, 2003]. Кванты УФ-В, обладающие высокой энергией, могут оказывать прямое повреждающее действие на клетки растений. Деструктивные эффекты более длинноволнового УФ-А излучения, как правило, опосредованы АФК [Bornman et al, 1997].
Необходимость защиты от повреждения солнечной радиацией обусловила возникновение у растений ряда адаптационных систем, вклю чающих регуляторные и фотозащитные механизмы (рис. 2) [Бухов, 2001; Nyogi, 1999]. Поскольку первые фототрофные организмы подвергались действию более жесткого УФ излучения, чем современные, считается, что ферментативные механизмы репарации УФ-индуцированного повреждения нуклеиновых кислот и важных белков ФСА возникли в процессе эволюции одними из первых [Jansen et al, 1998; Cockell, Knowland, 1999]. Универсальными и важнейшими для растений являются ферментативные и не ферментативные системы дезактивации АФК, играющие важнейшую роль в предотвращении фотоповреждений окислительного характера [Мерзляк, 1989; Foyer et al, 1994; Foyer, Noctor, 2000; Asada, 2006; Logan et al, 2006].
Упомянутые выше защитные механизмы характеризуются рядом общих особенностей. Во-первых, они ориентированы на устранение последствий вредоносного действия УФ и видимого излучения на клетку: репарацию поврежденных макромолекул, устранение образовавшихся в клетке АФК, продуктов их реакций и вызванных ими повреждений (рис. 2). Во-вторых, эти механизмы активно функционируют только при достаточном уровне макроэргических молекул и восстановительных эквивалентов, необходимых для репарации ДНК, ресинтеза белков и ли-пидов мембран, а также регенерации пулов восстановленного глутатио-на и аскорбиновой кислоты — важных низкомолекулярных антиокси-дантов (см. раздел 8, [Мерзляк, 1989; Niyogi, 1999; Foyer, Noctor, 2000]).
Сравнительно недавно был выделен и охарактеризован иной тип фотозащитных механизмов, основанный на ослаблении вредоносного УФ и избытка ФАР [Caldwell, 1968, 1981; Caldwell et al, 2003; Ben-Amotz et al, 1982-1999; Strack et al, 2003; Day et al, 1992-1995; Bur-chard et al, 2000; Merzlyak, Chivkunova, 2000; Cerovic et al, 2002; Close, MacArthur, 2002; Hoch et al, 2001, 2003]. Механизмы этого типа отличаются направленностью на устранение причины фотоповреждения — поглощения избыточных количеств радиации (рис. 1) пигментным аппаратом, эндогенными фотосенсибилизаторами и фоточувствительными компонентами клетки, а не на борьбу с его последствиями (детоксика-цию АФК, репарацию биомакромолекул и пр., см. рис. 2). В основе этих механизмов лежит способность растений синтезировать и накапливать под действием сильного излучения в различных компартментах клеток и структурах тканей соединений, селективно поглощающих излучение в УФ и видимом диапазоне спектра [Cockell, Knowland, 1999; Smillie, Hetherington, 1999; Barnes et al, 2000; Cerovic et al, 2002]. У растений такие вещества могут быть сосредоточены в покровных структурах, либо, распределены в объеме клеток и тканей (подробнее о локализации фотозащитных пигментов см. в разделе 1.4 и гл. 6).
В ходе эволюции число и разнообразие молекул, способных выполнять фотозащитные функции в растениях, постоянно увеличивались, а сложность их строения возрастала (см. раздел 1.4, а также работы [Cockell, 1998; Harborne, 1976, 1980; Harborne, Williams, 2000; Cockell, Know-land, 1999]). Подавляющее большинство обнаруженных у современных видов растений фотозащитных пигментов принадлежит к четырем основным группам соединений, различающихся по химической структуре и путям биосинтеза. К ним относятся микоспорин-подобные аминокислоты (МПА) [Cockell, Knowland, 1999; Shick, Dunlap, 2002], экстратила-коидные Кар, не участвующие в поглощении и передаче энергии света на молекулы Хл, называемые также вторичными Кар [Ben-Amotz et al, 1989; Hagen et al, 1993; Pick, 1998; Boussiba, 2000; Han et al, 2003, 2004; Hormaetxe, 2005]; беталаины [Mabry, 1980; Strack, Vogt, 2003; Ibdah et al, 2002] и фенольные соединения (ФеС) [Cockell, Knowland, 1999; Caldwell et al, 2003]. Необходимо заметить, что все перечисленные выше механизмы, предотвращающие фотоповреждение ФСА и обеспечивающие его стабильную работу в широком диапазоне условий окружающей среды, могут рассматриваться как фотозащитные. Однако в нашей работе основное внимание уделяется экстратилакоидным Кар и другим соединениям, ослабляющим достигающее тилакоидов излучение. В данном контексте мы рассматриваем в качестве фотозащитных механизмы, основанные на экранировании УФ и избытка ФАР [Caldwell et al, 1983; Ben-Amotz et al, 1989; Boussiba, Vonshak, 1991; Hagen et al, 1993; Day et al, 1994, Pick, 1986, 1998; Boussiba, 2000; Han et al, 2003; Hormaetxe et al, 2005].
Наряду с Кар фотозащитные функции у растений выполняет целый ряд ФеС [Запрометов, 1987, 1993; Gould et al, 1995, 2002; Chancer-Skott, 1999; Field et al, 2001; Caldwell et al, 2003] и отдельные гетероциклические соединения (беталаины) [Mabry, 1980; Cai et al, 2003]. У некоторых видов обнаружено одновременное присутствие несколько классов дополняющих друг друга фотозащитных пигментов, отличающихся по химической структуре, спектральным свойствам и локализации, например, ФеС и Кар [Havaux, Kloppstech, 2001], либо ФеС и беталаинов [Strack, Vogt, 2003; Ibdah et al, 2002]. Полученные к настоящему времени сведения позволяют полагать, что фотозащитные соединения обладают высокой фотостабильностью [Caldwell et al, 1983; Day et al, 1993, 1994; Merzlyak, Chivkunova, 2000; Boussiba, 2000; Wang et al, 2003]. Поэтому после формирования «фотозащитного экрана» для поддержания его функционирования достаточно минимальных затрат энергетических и пластических ресурсов; это обстоятельство обеспечивает растениям длительную защиту от фотоповреждения без истощения ресурсов клеток [Dixon, Pavia, 1995; Steyn et al, 2002; Hoch et al, 2003].
Эффективность функционирования такого механизма в меньшей степени снижается неблагоприятными внешними условиями (например, экстремальными температурами), когда ферментативные системы не способны обеспечить адекватный уровень защиты [Мерзляк, 1989; Pierini, Masacci, 1998; Pietrini et al, 2002; Hoch et al, 2003; Ensminger et al, 2006]. В то же время, первоначальное накопление фотозащитных соединений требует существенных затрат пластического материала и энергетических ресурсов [Saure, 1990; Steyn et al, 2002; Hoch et al, 2003], a индукция синтеза и накопление пигментов в количествах, достаточных для выполнения фотозащитной функции, занимает сравнительно продолжительное время [Gitz et al, 1998; Burchard et al, 2000; Lee, 1979-2002]. Таким образом, подобные механизмы оказываются целесообразными, главным образом, при защите от длительных воздействий стрессоров [Pietrini et al, 2002] и потому играют особо важную роль в долговременной адаптации [Bornman et al, 1983-1997; Cockell, Knowland, 1999; Соловченко, Мерзляк, 2008].
К настоящему времени отдельные классы фотозащитных пигментов обнаружены практически у всех растений [Strack, Vogt, 2003; Harborne, Williams, 2000; Запрометов, 1993; Cockell, Knowland, 1999], и во многих случаях была доказана и описана их фотозащитная функция. Получен значительный объем данных о механизмах их действия и охарактеризованы спектральные свойства in vivo для большого числа фотозащитных соединений. Наиболее подробно были исследованы вещества, участвующие в защите от УФ излучения [Beggs et al, 1986; Beggs, Wellman, 1994; Bornman et al, 1997; Cockell, Knowland, 1999; Barnes et al, 2000; Caldwell et al, 2003]. Также в последние 15 лет значительно увеличилось число публикаций, посвященных функциям Ант и вторичных Кар. Тем не менее, несмотря на достигнутые успехи, приходится признать, что основанные на экранировании видимого и УФ излучения фотозащитные механизмы у растений исследованы далеко не полно. Наряду с выяснением химической природы и встречаемости фотозащитных пигментов в природе, анализ спектральных свойств фотозащитных пигментов, прежде всего их спектроскопии в клетках и тканях растений in vivo, имеет большое значение для изучения фотозащитных механизмов. Однако таких данных на сегодняшний момент явно недостаточно, особенно это касается сведений о пигментах, поглощающих излучение в видимой области спектра. Кроме того, в мировой литературе очень мало работ, систематизирующих сведения о различных классах фотозащитных пигментов у растений, а в отечественной литературе они просто отсутствуют.
В связи со сказанным выше целью нашей работы явилось изучение фотозащитных механизмов, основанных на экранировании видимого и УФ излучения с участием фотозащитных пигментов (Кар и ФеС). При этом особое внимание предполагалось уделить исследованию оптических свойств растений при становлении и функционировании этих механизмов, а также разработке и усовершенствованию методов недструк-тивного анализа фотозащитных пигментов.
Фотозащитные пигменты растений
До появления и широкого распространения оксигенного фотосинтеза спектральный состав солнечного излучения у земной поверхности существенно отличался от современного, главным образом, более высокой долей жесткого УФ, проникающего через атмосферу при отсутствии в ней кислорода и озонового слоя [Cockell, 1998; Cockell, Knowland, 1999]. Предполагается, что в подобных условиях эволюционным преимуществом обладали фотохемотрофы, экскретировавшие в среду продукты метаболизма (например, элементарную серу и ионы железа) в виде взвесей и растворов, способных ослаблять падающее излучение [Cockell, 1998]. Однако мелкодисперсные неорганические частицы обладают значительным светорассеянием, вследствие чего они существенно ослабляют не только УФ, но и ФАР, необходимую для фотосинтеза. Кроме того, фото-трофным микроорганизмам, особенно планктонным формам, не всегда доступны в достаточных количествах минеральные субстраты, подхо 18 дящие для создания первичных неорганических «экранов». По-видимому, это обстоятельство стало основной причиной перехода в процессе эволюции к синтезу органических фотозащитных пигментов, селективно поглощающих излучение в определенных спектральных диапазонах. Фототрофные организмы — обладатели фотозащитных экранов, сформированных из органических соединений, оказались более конкурентоспособными. Они смогли освоить такие прежде недоступные экологические ниши, как верхние слои океана, а в дальнейшем — и открытые пространства суши, что в итоге позволило им занять в биосфере доминирующее положение [Cockell, 1998].
По данным сравнительной биохимии, первыми органическими фотозащитными соединениями, вероятно, стали конститутивные метаболиты, которые постепенно приобрели функцию защиты от фотоповреждения. В пользу этой гипотезы свидетельствует многообразие функций фотозащитных пигментов у современных организмов, ярким примером которого могут служить ФеС [Hahlbrock, Scheel, 1989; Harborne, Williams, 2000; Запрометов, 1993]. Разнообразие метаболических путей у фототрофов, по-видимому, служило богатым источником веществ, способных к поглощению в видимой и УФ областях спектра. Наиболее эффективно поглощают УФ излучение органические вещества, обладающие СИСТеМОЙ СОПрЯЖеННЫХ ДВОЙНЫХ СВЯЗеЙ И Обобщенной СИСТеМОЙ 71 электронов с линейной либо циклической структурой, которая присутствует в том или ином виде у всех известных в настоящее время природных фотозащитных пигментов [Cockell, Knowland, 1999].
Можно полагать, что древние фототрофы синтезировали довольно ограниченный набор соединений с простой химической структурой, поглощающих в УФ области спектра и представленных соединениями, близкими по структуре к МПА [Cockell, 1998]. У современных растений разнообразие фотозащитных веществ существенно больше, и синтези 19 руемые ими пигменты широко варьируют как по химической структуре, так и по спектральным свойствам [Markham, 1989; Strack, Vray, 1989; Britton, 1985, 1995]. Завоевание растениями новых сред обитания, характеризующихся более суровыми по сравнению с водной средой условиями, в том числе более высокими потоками солнечной радиации, сопровождалось значительными изменениями в составе и локализации фотозащитных пигментов. У современных высших растений они в значительной степени представлены ФеС — продуктами вторичного метаболизма [Hahlbrock, Scheell, 1989; Harbome, Williams, 2000; Запрометов, 1993], выполняющими защитные функции [Caldwell et ah, 1983; Barnes et ah, 2000; Close, McArthur, 2002; Lee, 2002], в том числе функцию защиты от фотоповреждения [Close, McArthur, 2002].
Особый интерес с точки зрения эволюции фотозащитных пигментов у высших растений, представляют причины приобретения или утраты у некоторых семейств способности к синтезу отдельных классов фотозащитных пигментов, таких как Ант [Stafford, 1994]. В этих случаях функции Ант переходят к другой группе соединений, отличающихся по химической структуре, но обладающих сходными спектральными свойствами [Mabry, 1980], например, к кетокаротиноидам у видов из родов Aloe и Cryptomeria или беталаинам — у представителей порядка Сагуо-phyllales [Mabry, 1980; Strack, Vogt, 2003]. Причины замещения отдельных классов фотозащитных пигментов у некоторых групп растений до сих пор не установлены.
Выделение тилакоидов и липидных глобул из клеток водорослей
Целые плоды и экстракты облучали, используя в качестве источника излучения диапроектор «Свитязь», оснащенный галогенной лампой накаливания КГМ 150/24 (НПО «Светотехника», Саранск) мощностью 150 Вт, через 5-см водный фильтр и 5-мм граничный светофильтр БС-8. Плотность мощности светового потока, измеренная термоэлементом РТН-ЗОС (ВНИИОФИ), в условиях наших экспериментов составляла 2500 Вт/м . Экстракты и растворы Хл а и Кар в я-гексадекане облучали в кюветах с длиной оптического пути 1 см.
Источником УФ-В служил осветитель с 10 флуоресцентными лампами Phillips TL-100 (Германия) мощностью по 100 Вт. Плотность мощности УФ-В излучения измеряли спектрорадиометром Grobel (фирма «Grobel С», Германия), максимальная плотность мощности УФ-В у объекта составляла 40 Вт/м .
Липидные глобулы и тилакоиды выделяли из 14-дневных культур P. incisa. Клетки осаждали центрифугированием (5 мин при 1500 g), замораживали жидким азотом и гомогенизировали в 50 ммоль буфере CHES-NaOH (pH 9,0), содержащем 5 ммоль ЭДТА, 1 ммоль ЭГТА, 1% БСА (вес : объем), 20 ммоль КС1, 2 ммоль MgCb, 10% глицерина (объем : объем), 0,6 М сахарозы, 0,005% Triton Х-100 (вес : объем) и 2 ммоль ДТТ. Для удаления клеточных обломков и целых клеток гомогенат центрифугировали 15 мин при 1500 g. Затем супернатант отбирали и помещали в центрифужные пробирки, наслаивая на 12 мл супернатанта по 10 мл сахарозных буферов с концентрацией 0,6, 0,4 и 0,2 М, содержащих 50 ммоль CHES, рН 9,0; 1 ммоль ЭДТА, 20 ммоль КС1, 1 ммоль MgCl2 и 1 ммоль ДТТ. После этого проводили центрифугирование в течение 1 ч при 25000 g. По завершении центрифугирования собирали флотирующие ЛГ и, на границе фаз между слоями 0,4 и 0,6 М буферов, фракцию тилакоидов. Собранные ЛГ немедленно экстрагировали 4 мл диэтилово-го эфира, а тилакоиды — смесью хлороформа и метанола (2:1, объем : объем; 5 мл смеси на 2 мл фракции). Экстракт тилакоидов затем центрифугировали 10 мин при 1500 g до полного разделения фаз, после чего отбирали хлороформную фракцию. Экстракты ЛГ и хлороформную фракцию экстракта тилакоидов упаривали в токе азота и для дальнейшего анализа растворяли в ацетоне. Все процедуры проводили при температуре 4 С и освещении слабым рассеянным светом.
Жирные кислоты (ЖК) анализировали с использованием ГЖХ на хроматографе Hewlett-Packard НР5890 (США) с капиллярной колонкой согласно Cohen et al. [Cohen et ah, 1993]. При подготовке пробы лиофили-зированную биомассу водорослей инкубировали с добавлением 5% концентрированной H2SO4 и смеси метанола и толуола (9 : 1, по объему) в течение 1,5 ч при 80 С. Эфиры экстрагировали гексаном [Kates, 1986]. Метиловые эфиры ЖК идентифицировали путем ко-хроматографии со свидетелями (Sigma, США) и по эквивалентной длине углеродной цепи [Ackman, 1969]. Анализ проводили в трехкратной биологической по-вторности, для каждой биологической повторности делали две аналитические ПОВТОрНОСТИ.
В отдельных экспериментах метиловые эфиры ЖК разделяли на хроматографе Chrom 5 (Чехия) с пламенно-ионизационным детектором с использованием стеклянных колонок 4 мм х 2 м, заполненных полярной фазой (10% SP-2330 на 100/120 Supelcoport (Supelco Inc., USA). Газ-носитель — азот (30 мл/мин). Измерения проводили в изотермическом режиме при 190 С. В обоих случаях в качестве внутреннего стандарта к пробам добавляли известное количества гептадекановой (маргариновой) кислоты.
Выделение кутикулы проводили по методу, описанному Ju и Bramlage [1999] с некоторыми модификациями [Solovchenko, Merzlyak, 2003]. С поверхности плода срезали фрагмент кожицы, достаточно большой для закрепления в интегрирующей сфере спектрофотометра (диаметр — 22 мм). С кожицы осторожно счищали мякоть при помощи скальпеля. После этого фрагменты кожицы инкубировали в смеси метанол-вода-НС1 (1:2: 0,02 по объему) в течение 5 мин для удаления ФеС из клеток, расположенных под кутикулой, и промывали дистиллированной водой. Затем препараты кожицы инкубировали в растворе ферментов следующего состава: 2% (объем) пектиназы (365 ед./мл), 1% (вес : об.) целлюлазы (9,8 ед./мл) в ацетатном буфере (рН 4). После инкубации при температуре 30 С в течение 24 ч при постоянном помешивании (для этого сосуд с инкубируемыми фрагментами кожицы помещали в культуральную качалку), кожицу извлекали и при помощи кисти отделяли мацерирован-ные фрагменты эпидермиса.
Влияние антоцнанов на оптические свойства листьев на уровне целых органов и отдельных клеток
Одной из основных физиологических ролей Ант является защита ФСА от фотоингибирования и, в конечном счете, фотоповреждения [Солов-ченко, Мерзляк, 2008; Chalker-Scott 1999, Field et al, 2001; Hoch et al, 2001; Steyn et al, 2002; Hughes et al, 2007; Pfundel et al, 2006; Merzlyak et al, 2008]. Подробное изучение и количественное описание фотозащитной функции Ант имеет приоритетное значение для экофизиологи-ческих исследований и требует знания локализации и оптических свойств этих и других пигментов in vivo [Gould et al, 2002; Merzlyak et al, 2008].
Целью экспериментов с листьями было получение количественной характеристики поглощения Ант in situ, для чего исследовали ювениль-ные и стареющие листья путем сопоставления спектров образцов, существенно различающихся по содержанию пигментов (см. раздел 1.5.2). Для этого подбирали пары листьев, ориентируясь, прежде всего, на близость спектров поглощения Хл в красной области спектра (рис. 33, 34), а не аналитически измеренного содержания Хл. Таким образом, удавалось учесть некоторые неопределенности, возникающие при измерении спектров листьев [Merzlyak et al, 2002]. При этом проводили и микроспек-трофотометрические измерения поглощения вакуолярных Ант на поперечных срезах листьев.
На спектрах поглощения листьев (рис. 33, 34), наряду с выраженными полосами Хл и Кар (представленным в виде плеч в синей области), присутствовали детали, обусловленные соединениями с максимумом в ближней УФ области, предположительно Фл [Merzlyak et al, 2004].
Поглощение Ант, в зависимости от их количества, проявлялось в виде полосы либо плеча в области 500-600 нм. На разностных спектрах поглощения ювенильных листьев A. platanoides, С. avellana (рис. 33) и С. alaunica (данные не приводятся), практически не отличавшихся по поглощению в области 620-700 нм, присутствовали полосы с максимумами при 540-544 нм, соответственно, обусловленные поглощением Ант. Кроме того, на разностных спектрах поглощения красных и зеленых ювенильных листьев были обнаружены небольшие максимумы при 420 и 480 нм, по-видимому, принадлежащие Кар. Полосы поглощения Ант были особенно заметны на спектрах красных осенних листьев (рис. 34, кривые 2), а амплитуда соответствующих дифференциальных спектров была выше (рис. 34, кривые 3). Согласно данным анализа дифференциальных спектров, максимумы поглощения Ант в листьях A. platanoides, С. alaunica, С. alba и P. quinqimfolia были близки и располагались около 541, 540, 547 и 537 нм, соответственно. Спектры поглощения Ант в целых листьях и в вакуолях отдельных клеток в диапазоне 500— 600 нм (а в случае С. alaunica — вплоть до 400 нм) проявляли значительное сходство в отношении формы и положения максимумов. В области 400-500 нм поглощение содержимого вакуолей С. alba и P. quin-quefolia (но не A. platanoides) было выше по сравнению с поглощением Ант в целых листьях.
Получение характеристики оптических свойств Ант in vivo в этих экспериментах стало возможным благодаря парному сопоставлению спектров избранных образцов, обладающим близким поглощением в красной области спектра. Данный подход основан на том допущении, что спектральный вклад поглощения Хл, идентичный в красной области спектра, остается таковым и в коротковолновых диапазонах. Таким образом, амплитуда дифференциальных спектров, полученных вычитанием спектров зеленых листьев из спектров красных листьев, в области 450-600 нм характеризует поглощение Ант, которое оказалось довольно сильным в листьях исследованных видов, и вклад в общее поглощение ряда других хромофоров, вероятно, фенольной природы, а также Кар.
Существенно, что спектры поглощения Ант, снятые с отдельных вакуолей с использованием метода микроспектрофотометрии, оказались довольно близкими по форме и положению максимумов к спектрам, полученным для целых листьев. Более высокое поглощение в области с X 440 нм обычно относят на счет присутствующих в вакуолярном соке, наряду с Ант, других ФеС, таких как Фл и фенольные кислоты [Cerovic et al., 2002; Merzlyak et ah, 2008]. Согласно результатам хроматографи-ческого анализа и сведениям, опубликованным в литературе, Ант в исследованных видах представлены, главным образом, гликозидами циа-нидина [Harborne, 1980, 1976; Strack, Wray, 1989].
Как показал анализ дифференциальных спектров, максимум поглощения Ант in vivo в листьях располагался, в зависимости от вида, при 537-544 нм (рис. 33-34). Батохромный сдвиг на 5-20 нм, а также уши-рение максимумов Ант in vivo по сравнению с таковым в растворах может быть вызван образованием комплексов с молекулами Ант и другими ФеС (Фл и проантоцианидинами), хелатированием ионов металлов [Harborne, 1976; Strack, Wray, 1989]. Эти процессы, по-видимому, могут вносить существенный вклад, наряду с вариацией содержания Хл и Кар, в разнообразие окраски листьев в осенний период.
Изменение оптических свойств плодов яблони при солнечном ожоге
Для дальнейших экспериментов по изучению фотоповреждения у высших растений в качестве модельной системы были выбраны плоды яблони. С использованием этой системы были изучены два типа фотоповреждения: естественное (на примере физиологического расстройства плодов — солнечного ожога) и искусственно индуцированное облучени-ем высокими (2500 Вт/м") потоками ФАР.
Изменение оптических свойств плодов яблони при солнечном ожоге Естественное фотоповреждение растений мы исследовали на примере солнечного ожога (sunscald) — распространенного в южных регионах физиологического расстройства плодов яблони, имеющего фотоокислительную этиологию [Andrews et al, 1997, 1998] и развивающегося при чрезмерной инсоляции, часто на фоне высокой температуры воздуха [Andrews et al, 1997, 1998]. Внешне солнечный ожог проявляется сначала как выцветание пигментов, в результате на кожице плодов появляются области с бледной окраской (рис. 23, 58а). В дальнейшем ткани на этом участке некротизируются, и в пораженной области развивается бурая окраска (рис. 23, 586).
Спектральную картину изменений отражения света плодами яблони при развитии солнечного ожога исследовали на примере сортов Гранин Смит и Ренет Симиренко, отличающихся высоким содержанием Хл в плодах и восприимчивостью к солнечному ожогу. На рис. 59 представлены спектры отражения плодов сорта Антоновка, устойчивого к солнечному ожогу, в сравнении со спектрами пораженных плодов. На спектрах солнечной поверхности плодов Антоновки (рис. 59а, кривая 2) присутствовали детали, характерные для плодов, адаптированных к сильному солнечному свету (см. раздел 3.4 и рис. 39). Наиболее выраженными были такие изменения, как повышение отражения в красной области наряду со снижением коэффициентов отражения в синей и особенно в сине-фиолетовой области спектра; эти изменения хорошо заметны на дифференциальных спектрах (кривая 3 на рис. 59а).
Особенности спектров плодов, пораженных солнечным ожогом, также хорошо заметны при сравнении дифференциальных спектров (кривые 3 на рис. 59а и б). При солнечном ожоге наблюдали сильное снижение поглощения (повышение отражения) в красной области спектра. В этой области амплитуда дифференциальных спектров f[R(xy), А/(І?(Я)), полученных вычитанием спектров пораженных плодов из спектров интактных плодов, была высокой (рис. 596, кривая 5). Она существенно превышала амплитуду спектров АДі ), рассчитанных путем вычитания спектров J[R(xy) теневой из спектров солнечной поверхности интактных плодов, адаптированных к сильному солнечному свету (ср. кривые 3 на рис. 59а и 596).
Другая существенная особенность изменения спектроскопии плодов при поражении солнечным ожогом заключалась в синхронном снижении поглощения (повышении отражения) в синей и красной областях спектра. Подобные изменения спектров Щц и f[R(xy) были обнаружены при синхронном выцветании Кар и Хл в листьях [Merzlyak et al., 1998] и плодах [Мерзляк и др., 1996, 1997; Merzlyak et al, 1998, Merzlyak, So-lovchenko, 2002] высших растений. В результате на спектрах АДі? ) в синей области появлялись отрицательные максимумы, по форме и положению напоминающие зеркально отраженные максимумы Кар (рис. 596). Подобных спектральных деталей не обнаруживали у интактных плодов, адаптированных к сильному солнечному свету.
На отражение в сине-фиолетовой области спектра поражение солнечным ожогом практически не влияло: на всех этапах развития расстройства оно было очень низким и близким к отражению в этом диапазоне интактных плодов, адаптированных к сильному солнечному свету (рис. 39-51, 59). Это подтверждает высокую фотостабильность Фл, накапливающихся в плодах яблони при действии солнечного света и принимающих участие в защите от фотоповреждения. С другой стороны, из представленных данных видно, что даже высокие количества фотозащитных пигментов в определенных ситуациях (например, при сочетании высоких потоков солнечной радиации и высокой температуры, вызывающем солнечный ожог) не обеспечивают защиту от фотоокислительного повреждения.
