Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1.Засоление как фактор стресса у растений 11
1.1.1.Типы засоления и повреждающее действие соли на растения. 13
1.1.2. Действие засоления на метаболизм растений и его последствия 15
1.1.3 Специфические характеристики растений гликофитов и галофитов к засолению 18
1.2. Стрессы, вызыванные засолением у растений 21
1.2.1. Осмотический стресс при засолении 22
1.2.2.Токсическое действие засоления на растения 23
1.2.3. Окислительный стресс при засолении 24
1.3. Механизмы устойчивости растений при засолени 28
1.3.1.Значение свабодного пролина при засолений в растении 29
1.3.2.Система антиоксидантной защиты растений при засолении 30
1.3.2.1.Ферменты антиоксиданты и их роль в защите растения при засолении 31
1.3.2.2. Низкомолекулярные антиоксиданты и их роль в защите растения при
засолении. 33
1.4.Растения рода Nigella как объект для изучения устойчивости к засолению. 36
1.4.1. Ботанико-хозяйственная характеристика растений рода Чернушка- Nigella и распространение. 36
1.4.2. Характеристика состава вегетативной массы и семян растений чернушка 38
1.4.3. Растения Nigella как источник лекарственных средств 39
ГЛАВА 2. Объект и методы исследования 41
2.1. Объект исследования- Характеристики 41
2.2. Условия выращивания растений и проведения опытов 43
2.2.1. Водные (гидропоники) опыты 43
2.2.2. Почвенные опыты 45
2.3. Измерение биомассы и морфометрич показателей 46
2.4. Определение содержания фотосинтетических пигментов 46
2.5. Определение содержания ионов натрия и калия 47
2.6. Определение осмотического потенциала 47
2.7. Определение содержания свободного пролинa 48
2.8. Определение уровния пероксидного окисления липидов по содержания малонового диальдегида 49
2.9. Определение содержания низкомолекулярных фенольных соединений 49
2.10. Определения aбсолютного содержания и жирнокислотного состава суммарных липидов в листьях и корнях чернушки . 50
2.11. Определения содержания экстрактивных веществ 51
2.12. Определение наличие биологически-активных веществ (БАВ) 51
2.13. Определения содержания липидной фракции в семенах чернушки. 51
ГЛАВА 3. Результаты исследований 53
3.1. Воздействие NaCl на растения двух видов Nigella и на последующее их
восстановление от засоления при выращивании в гидропонике 53
3.1.1. Рост и накопление биомассы растений N. damascena и N. sativa 54
3.1.1.1. Рост побега растений N. damascena и N. sativa в высоту 54
3.1.1.2. Аккумуляция сырой биомассы побега растений N. damascena и N. sativa 55
3.1.1.3. Накопление биомассы корней растений N. damascena и N. sativa 57
3.1.2. Содержание фотосинтетических пигментов 59
3.1.3. Содержания ионов калия и натрия в листьях растений. 62
3.1.4. Осмотический потенциал клеток листьев растений Nigella. 66
3.1.5. Содержания пролина. 68
3.1.6. Уровние окислительного стресса 70
3.1.7. Содержание низкомолекулярных фенольных соединений 71
3.1.8. Абсолютное содержание и жирнокислотный состав суммарных липидов в листьях и корнях чернушки 73
3.2. Воздействие NaCl на растения N. damascena и N. sativa, растущие в почве, и спосоность их к восстановлению. 80
3.2.1. Влияние засоления на выживание растений и ростовые показатели надземной части растений. 81
3.2.1.1. Выживание растений 81
3.2.1.2. Рост побега 82
3.2.1.3. Измерения высоты стебля и биомасса надземной части растений. 83
3.2.2. Cодержание фотосинтетических пигментов при засолении и восстановлении 84
3.2.3. Содержания свободного пролинa при засолении и восстановлении 85
3.3. Влияние засоление на биохимический состав надземной массы и характеристики семян. 87
3.3.1. Влияние засоление на некоторые характеристики плодов и семян видов чернушки. 88
3.3.2 Влияние засоления (NaCl) на наличие групп некоторых БАВ в надземной части видов растений чернушки 90
3.3.3. Влияние засоления на содержание экстрактивных веществ в биомассе побега. 92
3.3.4. Влияние засоление на содержания липидной фракции в семенах двух видов чернушки. 93
Заключение 95
Выводы 97
Список литературы 99
- Специфические характеристики растений гликофитов и галофитов к засолению
- Водные (гидропоники) опыты
- Определения aбсолютного содержания и жирнокислотного состава суммарных липидов в листьях и корнях чернушки
- Накопление биомассы корней растений N. damascena и N. sativa
Специфические характеристики растений гликофитов и галофитов к засолению
Теория стресса была сформулирована Гансом Селье, и термин «стресс» (от англ. stress — напряжение) в физиологии растений был заимствован из медицинской науки. Причины стресса растений кроются, как правило, в неблагоприятных условиях произрастания, когда растения испытывают так называемый «абиотический стресс» (например, критически низкие или высокие температуры, засоление, засуха, недостаток микроэлементов и др.), или так называемый «биотический стресс» (вызывается возбудителями заболеваний и повреждающими растения насекомыми).
Очевидно, что существует множество различных стрессов. Однако, правильнее называть внешние факторы, действующие на биологическую систему и вызывающие стресс, стрессорами, а стресс рассматривать как состояние организма, формирующееся в ответ на их воздействие (Кузнецов., Дмитриева., 2011). Реакции на стрессорные воздействия лишь при некоторых условиях являются патологическими, в принципе же они имеют адаптивное значение, и поэтому были названы Селье «общим адаптационным синдромом». В более поздних работах он объединял термины «стресс» и «общий адаптационный синдром» и употреблял как синонимы (Селье, 1982).
Обычно выделяют три фазы реакции растения на воздействие неблагоприятных факторов: первичная стрессовая реакции (по Селье: реакция тревоги), адаптации (по Селье: резистентности) и истощения. В первую фазу наблюдаются значительные отклонения в физиолого-биохимических процессах, проявляются как симптомы повреждения, так и защитная реакция. Значение защитных реакций состоит в том, что они направлены на устранение (нейтрализацию) возникающих повреждений. Если воздействие слишком велико, организм погибает в стадии тревоги в течение первых часов. Если этого не случилось, реакция переходит во вторую фазу. Во второй фазе организм либо адаптируется к новым условиям существования, либо повреждения усиливаются. При медленном развитии неблагоприятных условий организм легче приспосабливается к ним. После окончания фазы адаптации растения нормально вегетируют в неблагоприятных условиях уже в адаптированном состоянии при общем пониженном уровне процессов (Jitender G., 2011). В фазу повреждения (истощения, гибели) усиливаются гидролитические процессы, подавляются энергообразующие и синтетические реакции, нарушается гомеостаз. При сильной напряженности стресса, превышающей пороговое для организма значение, растение гибнет. При прекращении действия стресс-фактора и нормализации условий среды включаются процессы репарации, т. е. восстановления или ликвидации повреждений ( Селье, 1977).
Адаптационный процесс (адаптация в широком смысле) протекает постоянно и осуществляет «настройку» организма к изменениям внешней среды в пределах естественных колебаний факторов. Эти изменения могут носить как неспецифический, так и специфический характер. Неспецифическими являются однотипные реакции организма на действие разнородных стрессоров или разных организмов на один и тот же стресс-фактор. К специфическим относят ответные реакции, качественно различающиеся в зависимости от действующего фактора и генотипа растений ( Kuznetsov Vl.V. et al., 1990)
Растения, в природных условиях в течение онтогенеза, оказываются под влиянием различных стрессоров, вызывающихя отрицательное воздействие на рост и развитие, что приводят к значительному снижению продуктивности сельскохозяйственных культур (Косулина. с соавт.,1993) . Следует учесть, что 20% используемых под культуру мировых посевных площадей и половина орошаемых земель подвержены солевому стрессу (Munns R, 1993). Высокая концентрация солей, оказывая токсическое действие на растения, приводят к снижению их продуктивности. Поэтому выяснение влияния высоких концентраций солей на метаболические процессы растений и развиваемые ими защитные реакции имеет большое значение не только в физиологии растений, но и в практике сельскохозяйственного производства. ( Бахтенко., Курапов., 2008).
.Типы засоления и повреждающее действие соли на растения. Существуют разные типы засоления: хлоридное (NaCl), сульфатное (Na2SO4), карбонатное (NaHCO3), сульфатно-хлоридное, хлоридно сульфатное и смешанное. Преобладающим катионом в таких почвах является натрий. Встречаются тоже карбонатно-магниевое и хлоридно-магниевое засоление. Во влажных районах преобладает хлоридное засоление (Takemura T. et al., 2000), в степях и пустынях – сульфатное и карбонатное. Действие засоления на растительные организмы определяется, прежде всего, такими двумя основными причинами как ухудшение водного баланса и токсическое действие высоких концентраций солей (Строганов Б.П.,1958). Засоление приводит к созданию в почве низкого (резко отрицательного) водного потенциала, что сильно затрудняет поступление воды в растение ( Балконин., Строганов., 1989). Причина этого состоит в том, что движение воды из почвы в растение идет по градиенту водного потенциала, и чтобы восстановить нарушенное засолением поступление воды в растение, необходимо понизить его водный потенциал.
Водные (гидропоники) опыты
В условиях засоления в тканях растений в повышенных концентрациях накапливаются токсичные промежуточные продукты азотного обмена: диамины, путресцин и кадаверин. Причиной угнетения растений в условиях засоления также может быть аммиачное отравление. Значительное повышение содержания свободного аммиака является, по-видимому, следствием торможения синтеза аминокислот и усиления протеолиза азотсодержащих соединений. При солевом стрессе подавляется синтез белка и усиливается распад уже сформированного белковых комплексов (Abbas M.A. et al., 1991., Ericson M.C., Alfinito S.H., 1984). Ингибирование синтеза белка проявляется в снижении скорости включения аминокислот в белок, а также в ингибировании синтеза пептидных связей из-за блокировки ионами солей заряженных аминогрупп аминокислот и падения энергетического потенциала. Высокая концентрация Na+ и (или) Сl- тормозит фотосинтез (Alamgir., Ali.,1999), Бухов., 2004.). Это связано с чувствительностью к высокой концентрации солей процессов фосфорилирования и карбоксилирования (Касумов Н. А., 1983, Кузнецов Вл.В., 1992). Подавление синтеза белка и торможение фотосинтеза являются важными причинами заметного снижения скорости роста растений при солевом стрессе. Хотя повышенная концентрация солей тормозит синтез белков, инактивируя работу ряда ферментов их синтеза, вместе с тем при действии солей активируется работа многих генов, кодирующих ферменты синтеза веществ, участвующих в осморегуляции. Так, активируется пролинсинтазы ключевого фермента синтеза пролина, альдегиддегидрогеназы – фермента, участвующего в синтезе бетаина. Другие ферменты (например, глицеринальдегидфосфатдегидрогеназа) приводят к увеличению содержания растворимых сахаров, что влияет на концентрацию осмотически активных веществ в клетках растений (Бахтенко., Курапов ., 2008, Клышев Л. К.,1989). Отрицательное действие высокой концентрации солей сказывается раньше всего на корневой системе растений. При этом в корнях страдают наружные клетки, непосредственно соприкасающиеся с раствором соли. В стебле наиболее подвержены действию солей клетки проводящей системы, по которым раствор солей поднимается к надземным органам. (Луценко., Федюкина .,1987, Лапина., Строгонов.,1979)
Токсическое действие высокой концентрации солей связано с повреждением мембранных структур, в частности плазматической мембраны. Вследствие чего возрастает ее проницаемость, теряется способность к избирательному накоплению веществ. В этом случае соли поступают в клетки пассивно вместе с транспирационным током воды.
При повышенном содержании солей в почве у гликофитов нарушается водный и ионный гомеостаз как на клеточном уровне, так и на уровне целого растения. В свою очередь это ведет к различным токсическим эффектам, которые выражаются в повреждениях биополимеров цитоплазмы. В целом почвенное засоление затормаживает рост и может вызвать гибель растений (Балконин, Строганов., 1989)
Эффекты засоления, проявляющиеся на клеточном уровне Первым эффект соли, связанный с дегидратацией клеток. Показано, что в условиях засоления растения теряют воду вследствие высокого осмотического давления почвенного раствора. Дегидратация клеток при засолении происходит в результате снижения водного потенциала почвенного раствора. В настоящее время осмотическое и токсическое действия солей признаны главными повреждающими факторами на клеточном уровне. Природа токсического действия ионов, особенно первичных молекулярных повреждений, активно изучается. Известно, что ионы в высоких концентрациях могут дезинтегрировать клеточные мембраны, подавлять активность ферментов и приводить к нарушениям таких жизненно важных функций, как клеточное деление, ассимиляция углерода, поглощение элементов минерального питания, под влиянием солей происходят нарушения ультраструктуры клеток, в частности изменения в структуре хлоропластов. Это проявляется при хлоридном засолении. Засоление (NaCl) в концентрациях выше 0,4 М ингибирует многие ферменты вследствие нарушения гидрофобно-электростатического баланса сил, поддер живающих структуру белковых молекул. Однако при гораздо более низких концентрациях, токсические эффекты проявляются уже в растений. Факторами, повреждающими макромолекулы, являются активные формы кислорода (АФК) — синглетный кислород, супероксидный радикал, гидроксил-радикал, пероксид водорода и ряд других форм. Их концентрации в клетках растений при почвенном засолении и засухе возрастают. Наблюдающиеся в этом случае токсические эффекты возникают в результате вторичных процессов — взаимодействий биополимеров с накапливающимися при стрессе АФК. (Строганов Б. П. с соавт., 1970.). Эффекты засоления, проявляющиеся на уровне целого растения.
Высокие концентрации солей, как уже отмечалось ингибируют рост растений (Chartzoulakis K., Klapaki G., 2000). Ингибирование опосредовано уменьшением содержания в растениях гормона цитокинина, стимулирующего рост, и увеличением содержания ингибирующей рост абсцизовой кислоты (АБК). Изменения в гормональном статусе растений стимулируют механизмы устойчивости.яя Медленный рост позволяет растениям выживать при стрессе, так как освобождает множество ресурсов (структурных блоков и энергии), необходимых для реализации защитной программы.
Определения aбсолютного содержания и жирнокислотного состава суммарных липидов в листьях и корнях чернушки
Растения Nigella – источники важных лекарственных и пищевых видов сырья. Необходимо знать, каковы изменения - нет ли небагоприятных изменений в составе (липидов) частей растений при росте на среде с высоким содержанием NaCl.
На рис. 16 представлены результаты определения содержания липидов в листьях и корнях двух видов чернушки, выращенных в течение 12 суток на полной среде Хогланда-Снайдер, а также на той же среде в присутствии 70 и 110 мМ NaCl. а также после 12 сут восстановления на среде без соли. Можно видеть, что в листьях N. damascena в присутствии соли содержание липидов по сравнению с контролем несколько возрастает при более низкой концентрации NaCl, тогда как при более высокой - незначительно снижается. В то же время в листьях N. sativa, а также в корнях обоих видов имело место некоторое снижение этого показателя (16А).
Выращивание подвергшихся солевому стрессу растений на среде без соли в течение 12 сут приводило к восстановлению содержания липидов как в листьях, так и в корнях у обоих изученных видов (16В).
Содержание липидов в конце опыта восстановления (12 суток), у контрольных растений, по сравнению с исходном, как в листьях, так и в корнях увеличивалось у N. damascena, в то время как у N.sativa, наоборот, снижалось примерно на 40% (рис. 16Б). В засоленной варианты, по сравнению с исходном, через 12 сут восстановления растений, в листьях обоих видов чернушки и в корнях у N. sativa после 70 мМ NaCl имело место некоторое восстановление абсолютного содержания липидов. В то же время в корнях обоих изученных видов содержание липидов заметно увеличивалось, причем до уровня, превышающего наблюдавшийся у контрольных растений; в корнях N. damascena накапливалось значительно больше липидов, чем у N.sativa (рис. 16Б).
В табл. 14 и 15 приведены качественный и количественный состав ЖК суммарных липидов листьев и корней растений двух видов чернушки, выращивавшихся без соли (контроль), в присутствии разных концентраций NaCl, а также после восстановления на среде без соли. Как качественный, так и количественный состав ЖК липидов листьев у обоих видов чернушки был сходным - в них было обнаружено 16-18 индивидуальных видов Сі4-С28 ЖК, главными из которых были а-линоленовая (9,12,15-18:3), пальмитиновая (16:0), линолевая (9,12-18:2) и гексадекатриеновая (7,10,13-16:3) кислоты. Присутствие в липидах листьев чернушки высоких концентраций последней свидетельствует о том, что Nigella принадлежит к так называемым 16:3-растениям, которые обладают прокариотическим путем биосинтеза галактолипидов (Mongrand et al. 1998). Липиды листьев N. damascena отличались от N. sativa несколько меньшим уровнем ненасыщенности, который при выращивании растений в присутствии соли у обоих видов незначительно повышался. Доля полиненасыщенных ЖК (ПНЖК) в листьях N. sativa была несколько выше (72.2 и 68.4% от суммы ЖК), а уровень мононенасыщенных (5.9 и 7.2%) и насыщенных (21.9 и 24.4%) ЖК - ниже, чем у N. damascena. Солевой стресс у N. sativa вызывал некоторое снижение доли ПНЖК лишь при 110 мМ NaCl, в то время как у N. damascena уровень ПНЖК, наоборот, слегка увеличивался. Что касается липидов корней, то в них идентифицировали 17-20 видов С12-С26 ЖК, среди которых преобладали 16:0, 18:2 и 18:3. В липидах корней обоих видов концентрация ПНЖК была сходной и сколько-нибудь заметно снижалась только при 110 мМ NaCl, причем у N.sativa сильнее, чем у N. damascena. В контрольном варианте индекс ненасыщенности липидов корней N. damascena также был несколько ниже, чем у N.sativa, но если у последних солевой стресс вызывал заметное снижение величины ИН липидов, то у N. damascena ИН уменьшался только при выращивании растений в присутствии 110 мМ NaCl, а при 70 мМ NaCl, напротив, увеличивался.
Выращивание подвергшихся солевому стрессу растений на среде без соли в течение 12 сут приводило к некоторому изменению количественного ЖК-состава липидов их листьев. Однако если у N. damascena ЖК-состав липидов практически восстанавливался до уровня контроля, у N.sativa доля триненасыщенных ЖК и величина ИН при восстановлении растений после выращивания в присутствии 110 мМ NaCl оставались существенно ниже, чем в контроле. Ранее влияние солевого стресса на рост и ЖК-состав липидов было изучено на примере N. sativa, семена которой получены из Туниса (Bourgou et al., 2012). Выращивание растений при 40 мМ NaCl приводило к снижению сухой массы надземных органов и корней на 29 и 12%, а при 60 мМ NaCl -на 47 и 24% соответственно. Однако содержание липидов в надземных органах снижалось на 19% лишь при 60 мМ NaCl, в то время как в корнях при 20 и 40 мМ NaCl содержание липидов, наоборот, увеличивалось на 25 и 34% соответственно, а при 60 мМ NaCl - не изменялось (Bourgou et al., 2012). В отличие от наших данных, доля ПНЖК в липидах листьев тунисской чернушки была несколько выше, а доля мононенасыщенных и насыщенных ЖК - ниже, а в липидах корней наоборот, уровень последних был выше, а концентрация ПНЖК - несколько ниже (Bourgou et al., 2012). Также как и в наших опытах, солевой стресс вызывал в липидах листьев тунисской чернушки некоторое снижение уровня ПНЖК, однако в отличие от наших данных заметное снижение доли 18:3 происходило уже в присутствии 20 мМ NaCl, а при повышении концентрации соли в среде степень снижения усиливалась (Bourgou et al., 2012., Ben Taarit M. et al., 2010).
Накопление биомассы корней растений N. damascena и N. sativa
Уровни содержания липидной фракции в семенах двух видов чернушки, выращенных в разных условиях опыта. «Контр.Д» - содержание липидной фракции в семенах чернушки дамасской в контрольном варианте; «Вар. Д» - содержание липидной фракции в семенах чернушки дамасской в условиях засоления «Контр.П» - содержание липидной фракции в семенах чернушки посевной в контрольном варианте; «Вар. П» - содержание липидной фракции в семенах чернушки посевной в условиях засоленияю.
Как видно из полученных данных (табл. 24, рис 24) уровень накопления липидов семенами чернушки посевной, выращенной на почве с солевой нагрузкой, меньше (23,75%), чем в контроле (32,83%). В семенах чернушки дамасской, выращенной на почве без солевой нагрузкой, накапливается также больше липидной фракции (30,52%), чем в семенах растений, выращенных в условиях солевого стресса (26,45%). Таким образом, в условиях засоления, накопление жирного масла в семенах чернушки посевной тормозится сильнее (- 27,61%), чем в семенах чернушки дамасской (-13,34%).
Растения двух изученных видов рода Nigella (чернушка) - N. damascena и N. sativa – являются гликофитами. Однако в областях их природного произрастания и хозяйственного использования нередки засоленные почвы. В связи с этим основными задачами настоящей работы были: оценить возможность их роста при засолении разной интенсивности, изучить проявления токсического действия в сравнительном аспекте для двух видов, его возможные причины и защитные реакции растений. Дополнительно, связи с использованием растений N. damascena и N. sativa в фармацевтической и медицинской практике, был проведен анализ вегетативной массы, плодов и семян на содержание БАВ, экстрактивных веществ, извлекаемых 50% спиртом, и липидов.
На растениях обоих изученных видов – N. damascena и N. sativa негативое действие засоления проявилось в подавлении ростовых показателей, снижении содержания воды и фотосинтетических пигментов в листьях, нарушении уровня и соотношения важных минеральных ионов – калия и натрия, проявлении окислительного стресса. Установлено, что степень проявления токсического действия была пропорциональна интенсивности засоления и продолжительности его действия. После прекращения засоления растения чернушки довольно успешно восстанавливались. По этому показателю разница между видами была особенно значительна, так как после сильного засоления восстановление N. sativa шло очень медленно и на 12ый день все растения этого вида погибали.
В числе механизмов адаптации растений Nigella к засолению важное значение имеет снижение осмотического потенциала клеток, что является основой поступления воды в ткани засоленных растений для поддержания их водного статуса. Однако аккумуляция ионов натрия в высоких концентрациях оказывает прямое токсическое действие на метаболизм растений, сопряженное со снижением концентрации жизненно необходимого для растений ионов калия, поскольку при засолении интенсивное поглощение натрия уменьшает поступление в растение калия.
В условиях засоления, помимо накопления неорганических ионов, необходимых для понижения осмотического потенциала, обеспечивающего поток воды в надземные органы, важную роль играет аккумуляция водорастворимых низкомолекулярных органических веществ из группы совместимых осмолитов. У растений рода Nigella к ним относится пролин.
Непрямой, но не менее опасный эффект засоления проявляется в растениях в повышении концентрации активных форм кислорода (АФК), вызывающих окислительный стресс, в качестве важного элемента защиты от которого у растений чернушки обнаружено накопление низкомолекулярных фенольных соединений.
В настоящем исследовании установлен факт более низкой
солеустойчивости растений N. sativa, погибавших к 20ому дню культивирования при концентрации 4 г NaCl/кг почвы, когда еще сохранялось 12,5% растений N. damascena; полная гибель последних происходила на 10 дней позже. При выращивании в гидропонике меньшая устойчивость N. sativa проявилась в неспособности к восстановлению после 12 дней сильного засоления (150 мМ NaCl). После удаления NaCl из питательной среды происходило частичное восстанавление ростовых и ряда биохимических показателей. Сравнение N. sativa и N. damascena по этим параметрам показало, что растения N. damascena характеризуются более высоким уровнем солеустойчивости, что наиболее наглядно проявилось в способности к восстановлению также и после наиболее сильного солевого стресса – 150 мМ NaCl, после которого растения все N. sativa погибали. Вероятной причиной более эффективного восстановления растений N. damascena после засоления может быть быстрое и интенсивное использование пролина, накопленного в растениях при вегетации в условиях засоления.
